一种缘毛鸟足兰的组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种缘毛鸟足兰的组培快繁方法，属于植物组织培养领域，旨在通过诱导、增殖、分化、壮苗、炼苗移栽等过程获得优质的缘毛鸟足兰组培苗，建立缘毛鸟足兰组培快速繁殖技术体系；该组培快繁方法依次包括根状茎中间繁殖体的诱导步骤、增殖步骤及分化培养步骤，所述的根状茎中间繁殖体的诱导步骤，即将外植体接种到诱导培养基中进行培养；其中，所述的诱导培养基包括：MS、0.5～3.0mg/L 6‑苄氨基腺嘌呤、0.1～1.0mg/L萘乙酸、0.05～0.1μmol/L La(NO

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，尤其涉及一种缘毛鸟足兰的组培快繁方法。

背景技术

缘毛鸟足兰(Satyrium ciliatun Ldl.)为兰科鸟足兰属(Satyrium Sw.)的一种地生兰。鸟足兰属约有89个种，绝大部分分布在非洲大陆和马达加斯加群岛，亚洲仅有鸟足兰(S.nepalenseD.Don,Prodr.)、云南鸟足兰(S.yunnanenseRolfe)和缘毛鸟足兰(Satyrium ciliatunLdl.)等3个种分布，而我国仅有云南鸟足兰和缘毛鸟足兰分布，其中缘毛鸟足兰主要分布于中国的藏南、西南和湘西等地，其多生长在海拔1900～4100m的亚高山地带的稀矮灌丛下或林间草地上。

缘毛鸟足兰是在具有近20000种的兰科植物中迄今为止报导过的雄性不育类型与两性类型共存的唯一例子。缘毛鸟足兰为多年生草本植物，地下有块茎，每年长出一个新块茎，越冬，第二年发芽长出新植株，老的块茎在生长季节后期萎缩，腐烂。由于块茎营养繁殖方式只能延续植株的数量，并不能增加植株数量。加上利益驱使，缘毛鸟足兰受到过度的采挖，其野生居群遭到极大的破坏，因此对其进行人工繁育刻不容缓。

目前，国内外尚未有缘毛鸟足兰组织培养种苗繁殖的报道，也未有缘毛鸟足兰种苗组织培养专利的申请。

发明内容

针对上述技术的不足，本发明旨在提供一种通过诱导、增殖、分化、壮苗、炼苗移栽等过程成功获得了优质的缘毛鸟足兰组培苗，建立缘毛鸟足兰组培快速繁殖技术体系的缘毛鸟足兰的组培快繁方法。

为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种缘毛鸟足兰的组培快繁方法，依次包括根状茎中间繁殖体的诱导步骤、增殖步骤及分化培养步骤，所述的根状茎中间繁殖体的诱导步骤，即将外植体接种到诱导培养基中进行培养；

其中，所述的诱导培养基包括：MS、0.5～3.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.1～1.0mg/L萘乙酸、0.05～0.1μmol/L La(NO₃)₃、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁，所述的诱导培养基的pH为5.4～5.8。

需要说明的是，所述的增殖步骤为将诱导所得的根状茎接种到增殖培养基中进行培养；

其中，所述的增殖培养基包括：MS、1.0～1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.1～0.5mg/L萘乙酸、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁、0.2～0.5g/L活性炭，所述的增殖培养基的pH为5.4～5.8。

需要说明的是，所述的分化培养步骤为将增殖培养所得的根状茎接种到分化培养基中进行培养；

其中，所述的分化培养基包括：MS、0.5～1.5mg/L萘乙酸、0.01～0.05μmol/L La(NO₃)₃、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、0.2～0.5g/L活性炭，所述的分化培养基的pH为5.4～5.8。

需要说明的是，在分化培养步骤之后还包括壮苗培养步骤，即将分化培养所得的小苗接种到壮苗培养基中进行培养；

其中，所述的壮苗培养基包括：1/2MS、0.1～0.5mg/L萘乙酸、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，所述的壮苗培养基的pH为5.4～5.8。

需要说明的是，在壮苗培养步骤之后还包括炼苗和移栽步骤，即将试管苗根部放于自然光下至根系发白，将其放入混合基质中栽培成苗；

所述的混合基质为：体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩。

需要说明的是，所述的根状茎中间繁殖体的诱导步骤、增殖步骤、分化培养步骤及壮苗培养步骤的培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～16小时/天。

需要说明的是，所述的根状茎中间繁殖体的诱导步骤的培养时间为60～90天，所述的根状茎的增殖步骤的培养时间为30～60天，所述的分化培养步骤的培养时间为40～60天，所述的壮苗培养步骤的培养时间为30～45天，所述的炼苗和移栽步骤的炼苗时间为3～5天。

需要说明的是，所述的根状茎中间繁殖体的诱导步骤为：将外植体经清水冲洗、升汞消毒、无菌水漂洗后接种到诱导培养基中培养60～90天即可诱导形成根状茎中间繁殖体。

需要说明的是，所述的消毒方法包括以下步骤：

步骤1：将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩三层叶鞘，将包裹有三层叶鞘的营养芽置于超净工作台中；

步骤2：于0.1％的升汞溶液中消毒30～60分钟，无菌水冲洗2～3次后剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10～20分钟，无菌水冲洗3～5次后再剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5～10分钟，无菌水冲洗3～5次后剥去一层叶鞘；

步骤3：立即置于0.1％的升汞溶液中消毒1～3分钟，无菌水冲洗5～7次后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，迅速将外植体剪切成0.3～0.5cm左右的芽点并接种至诱导培养基中。

需要说明的是，所述的根状茎中间繁殖体的诱导步骤之前还包括外植体采集步骤。

本发明的有益效果为：

1.通过诱导、增殖、分化、壮苗、炼苗移栽等过程成功获得了优质的缘毛鸟足兰组培苗，建立无缘毛鸟足兰组培快速繁殖技术体系；

2.通过本发明培养获得的缘毛鸟足兰组培苗的存活率可达95％以上。

具体实施例

下面结合具体实施方式对权利要求书做进一步说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明权利要求范围内。

实施例1

(1)外植体采集：2013年春季当缘毛鸟足兰营养芽萌动时，在云南丽江县野外采集健壮无明显虫害的缘毛鸟足兰的叶鞘未打开的营养芽，采集后用湿润的白纱布包裹后立即置于保鲜盒中带回实验室。将采集回实验室的营养芽先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩三层叶鞘，将包裹有三层叶鞘的营养芽置于超净工作台中；于0.1％的升汞溶液中消毒30分钟，述的壮苗培养步骤的培养时间为30～45天，所述的炼苗和移栽步骤的炼苗时间为3～5天。

需要说明的是，所述的根状茎中间繁殖体的诱导步骤为：将外植体经清水冲洗、升汞消毒、无菌水漂洗后接种到诱导培养基中培养60～90天即可诱导形成根状茎中间繁殖体。

需要说明的是，所述的消毒方法包括以下步骤：

步骤1：将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩三层叶鞘，将包裹有三层叶鞘的营养芽置于超净工作台中；

步骤2：于0.1％的升汞溶液中消毒30～60分钟，无菌水冲洗2～3次后剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10～20分钟，无菌水冲洗3～5次后再剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5～10分钟，无菌水冲洗3～5次后剥去一层叶鞘；

步骤3：立即置于0.1％的升汞溶液中消毒1～3分钟，无菌水冲洗5～7次后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，迅速将外植体剪切成0.3～0.5cm左右的芽点并接种至诱导培养基中。

需要说明的是，所述的根状茎中间繁殖体的诱导步骤之前还包括外植体采集步骤。

本发明的有益效果为：

1.通过诱导、增殖、分化、壮苗、炼苗移栽等过程成功获得了优质的缘毛鸟足兰组培苗，建立无缘毛鸟足兰组培快速繁殖技术体系；

2.通过本发明培养获得的缘毛鸟足兰组培苗的存活率可达95％以上。

具体实施例

下面结合具体实施方式对权利要求书做进一步说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明权利要求范围内。

实施例1

(1)外植体采集：2013年春季当缘毛鸟足兰营养芽萌动时，在云南丽江县野外采集健壮无明显虫害的缘毛鸟足兰的叶鞘未打开的营养芽，采集后用湿润的白纱布包裹后立即置于保鲜盒中带回实验室。将采集回实验室的营养芽先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩三层叶鞘，将包裹有三层叶鞘的营养芽置于超净工作台中；于0.1％的升汞溶液中消毒30分钟，无菌水冲洗2次后剥去一层叶鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水冲洗3次后再剥去一层叶鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒5分钟，无菌水冲洗3次后剥去一层叶鞘并立即置于0.1％的升汞溶液中消毒1分钟，无菌水冲洗5次后备用。

(2)根状茎中间繁殖体的诱导：将步骤(1)处理后的外植体用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，迅速将外植体剪切成0.3～0.5cm左右的芽点并接种至诱导培养基中培养60天即可诱导形成根状茎中间繁殖体，诱导率达86.1％，污染率低于3.0％；

所述的诱导培养基为：MS+3.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+1.0mg/L萘乙酸+0.05μmol/LLa(NO₃)₃+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+50ml/L椰子汁，pH为5.4。

(3)根状茎的增殖：将步骤(2)所得的根状茎切成长约0.5cm的茎段并接种到增殖培养基中培养30天即可得到长度约为3.5～5.0cm的根状茎，增殖系数达到6.5；

根据需要，新获得的根状茎可切成长约0.5cm的增殖材料并在相同的培养基中进行增殖；

所述的增殖培养基为：MS+1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/L萘乙酸+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+50ml/L椰子汁+0.2g/L活性炭，pH为5.4。

(4)分化培养：将步骤(3)所得的根状茎接种到分化培养基中培养40天即能分化出小苗，分化率达到91.8％。

所述的分化培养基为：MS+1.5mg/L萘乙酸+0.01μmol/L La(NO₃)₃+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.2g/L活性炭，pH为5.4。

(5)壮苗培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养30天即能形成试管苗。

所述的壮苗培养基为：1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+50g/L香蕉汁+0.2g/L活性炭，pH为5.4。

(6)移栽：将步骤(5)所得健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗3天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率达到95.9％。

上述步骤(2)～(5)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12小时/天。

实施例2

(1)外植体采集：2014春季当缘毛鸟足兰营养芽萌动时，于云南大理野外采集健壮无明显虫害的缘毛鸟足兰的叶鞘未打开的营养芽，采集后用湿润的白纱布包裹后立即置于保鲜盒中带回实验室。将采集回实验室的营养芽先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩三层叶鞘；将包裹有三层叶鞘的营养芽置于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒45分钟，无菌水冲洗3次后剥去一层叶鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗4次后再剥去一层叶鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒8分钟，无菌水冲洗4次后剥去一层叶鞘并立即置于0.1％的升汞溶液中消毒2分钟，无菌水冲洗6次后备用。

(2)根状茎中间繁殖体的诱导：将步骤(1)获得的外植体用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，迅速将外植体剪切成0.3～0.5cm左右的芽点并接种至诱导培养基中培养80天即可诱导形成根状茎中间繁殖体，诱导率达到89.7％，污染率低于3％以下。

所述的诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.6mg/L萘乙酸+0.07μmol/L La(NO₃)₃+23g/L蔗糖+4.2g/L琼脂+65ml/L椰子汁，pH为5.6。

(3)根状茎的增殖：将步骤(2)所得的根状茎切成长约0.5cm的茎段并接种到增殖培养基中培养50天即可得到长度约为3.5～5.0cm的根状茎,增殖系数达到7.1；

根据需要，新获得的根状茎可切成长约0.5cm的增殖材料并在相同的培养基中进行增殖；

所述的增殖培养基为：MS+1.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.35mg/L萘乙酸+24g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+68ml/L椰子汁+0.3g/L活性炭，pH为5.6。

(4)分化培养：将步骤(3)所得的根状茎接种到分化培养基中培养55天即能分化出小苗，分化率为94.2％。

所述的分化培养基为：MS+0.85mg/L萘乙酸+0.04μmol/L La(NO₃)₃+25g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.3g/L活性炭，pH为5.6。

(5)壮苗培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养37天即能形成试管苗。

所述的壮苗培养基为：1/2MS+0.4mg/L萘乙酸+22g/L蔗糖+4.7g/L琼脂+80g/L香蕉汁+0.4g/L活性炭，pH为5.6。

(6)移栽：将步骤(5)所得健壮的试管苗在温室的自然光下炼4天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30后成活率达到100％。

上述步骤(2)～(5)的培养条件为：培养温度为27℃，光照强度为1700lx，光照时间为14小时/天。

实施例3

(1)外植体采集：2015年春季当营养芽萌动时，在云南宾川县野外采集健壮无明显虫害的缘毛鸟足兰的叶鞘未打开的营养芽，采集后用湿润的白纱布包裹后立即置于保鲜盒中带回实验室。将采集回实验室的营养芽先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩三层叶鞘；将包裹有三层叶鞘的营养芽置于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒60分钟，无菌水冲洗3次后剥去一层叶鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗5次后再剥去一层叶鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水冲洗5次后剥去一层叶鞘并立即置于0.1％的升汞溶液中消毒3分钟，无菌水冲洗7次后备用。

(2)根状茎中间繁殖体的诱导：将步骤(1)获得的外植体用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，迅速将外植体剪切成0.3～0.5cm左右的芽点并接种至诱导培养基中培养90天即可诱导形成根状茎中间繁殖体，诱导率为70.8％，污染率低于1％。

所述的诱导培养基为：MS+0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+0.1μmol/L La(NO₃)₃+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁，pH为5.8。

(3)根状茎的增殖：将步骤(2)所得的根状茎切成长约0.5cm的茎段并接种到增殖培养基中培养60天即可得到长度约为3.5～5.0cm的根状茎，增殖系数达到6.8；

根据需要，新获得的根状茎可切成长约0.5cm的增殖材料并在相同的培养基中进行增殖；

所述的增殖培养基为：MS+1.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁+0.5g/L活性炭，pH为5.8。

(4)分化培养：将步骤(3)所得的根状茎接种到分化培养基中培养60天即能分化出小苗，分化率达到96.4％。

所述的分化培养基为：MS+0.5mg/L萘乙酸+0.05μmol/L La(NO₃)₃+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。

(5)壮苗培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养45天即能形成试管苗，

所述的壮苗培养基为：1/2MS+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100g/L香蕉汁+0.5g/L活性炭，pH为5.8。

(6)移栽：将步骤(5)所得健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗5天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率达到95％。

上述步骤(2)～(5)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。