一种抑制精子活动力的适体组及其制备方法

摘要

本发明公开了一种抑制精子活动力的适体组及其制备方法，包括能够抑制精子活动力的若干功能性适体，该若干功能性适体是以第一至第三十五候选适体为模板，以新鲜精子为靶标进行功能性筛选和诱变PCR进化而获得的，上述第一至第三十五候选适体依次包括如SEQ ID NO01至35所示的序列。本发明的适体组对精子的亲和力强、特异性高，且对精子具有制动功能。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制精子活动力的适体组及其制备方法。

背景技术

适体(aptamer，也译为核酸适体、适配体)是近年来快速发展的一种新型材料，是具有类似抗体特异性结合能力的短链DNA或RNA分子。适体在功能上类似于抗体，但与单克隆抗体相比，没有免疫源性；明确其序列后，可通过化学合成批量生产；化学稳定性好，可在常温下保存和运输。适体的靶标可以是大分子(例如蛋白质)，也可以是不具备免疫原性的小分子(例如无机盐)，甚至完整的细胞(例如肿瘤细胞)。已有申请专利(WO2008/028081A2)宣称可以制备多克隆适体与精子结合，但该专利所公开的多克隆适体并不能抑制精子的活动力。

适体可以通用体外筛选技术SELEX(Systematic Evolution of Ligands byEXponential enrichment指数富集配体系统进化)而获得。但已有不少报道总结了SELEX技术的弊端，主要原因在于这种技术所用的起始文库所含序列的随机性和局限性。一段长度为40个核苷酸的随机序列，其全部随机序列的总数应可达到4⁴⁰，约等于10²⁴，而目前的技术实际上很难获得候选适体序列数目超过10¹⁶的文库。即便文库含有的随机序列数目达到10¹⁶，也只是占所指总数的亿分之一(10¹⁶∶10²⁴＝1∶10⁸)。如果起始文库不含目标序列，则难以从中富集出适体。迄今，虽有许多报道提出了不同的改进方法，包括由SELEX的发明者LarryGold实验室提出的Photo-SELEX，即通过单色紫外线照射，使适体序列与靶蛋白形成稳定的交联复合物，有利于与不结合的游离序列区分开，可惜这些改良都没有从根本上解决SELEX受制于文库局限性这一关键技术瓶颈：起始文库含有目标序列的可能性只是一个小概率(例如：亿分之一)事件。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种抑制精子活动力的适体组。

本发明的另一目的在于提供上述抑制精子活动力的适体组的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种抑制精子活动力的适体组，包括能够抑制精子活动力的若干功能性适体，该若干功能性适体是以第一至第三十五候选适体为模板，以新鲜精子为靶标进行功能性筛选和诱变PCR进化而获得的，上述第一至第三十五候选适体依次包括如SEQ ID NO 01至35所示的序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第一至第三十五候选适体依次如SEQ IDNO 01至35所示。

进一步优选的，由所述能够抑制精子活动力的若干功能性适体组成。

上述适体组的制备方法具体包括如下步骤：

(1)选择单链寡核苷酸起始文库，其具体序列为正向引物的序列+N₄₀+反向引物结合序列，其中N为长度40个核苷酸的随机序列；

(2)设计和制备正向引物和反向引物；

(3)制备人精子标本，分为不同稀释度精浆的抗冻精液和新鲜精液；

(4)制备人阴道上皮细胞；

(5)进行诱变PCR延伸扩增上述单链寡核苷酸起始文库，引物为步骤(2)的正向引物和反向引物，反应体系中还包括dNTPs、dITP、MnCl₂，Taq>

(6)用步骤(5)所得的双链DNA产物制备仅含有正链的单链DNA序列；

(7)对上述单链DNA序列进行选择，以获得选定序列，该选择包括与步骤(3)的抗冻精液共孵育进行正向筛选和与步骤(4)的人阴道上皮细胞共孵育进行反向筛选，反向筛选和正向筛选的孵育温度相同；

(8)将步骤(7)选择得到的选定序列作为模板返回步骤(5)进行诱变PCR，并依次重复若干轮步骤(5)至(7)，直至获得选定适体；其中，每一轮步骤(5)的诱变PCR轮流降低dNTPs中其中一种的浓度，其余dNTPs的浓度均与dITP相同；每一轮正向筛选所用的缓冲液中的洗涤剂的浓度从0逐渐升高，且孵育温度也逐渐升高；每一轮的反向筛选所用的缓冲液均不含洗涤剂；

(9)对上述选定适体进行克隆、挑选和测序，获得所述第一至第三十五候选适体；

(10)以步骤(9)获得的第一至第三十五候选适体为模板，以步骤(3)的新鲜精液为靶标，进行功能性筛选和诱变PCR进化，获得所述若干功能性适体，即所述抑制精子活动力的适体组。

在本发明的一个优选实施方案中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO 36所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述反向引物的序列如SEQ ID NO 37所示。

在本发明的一个优选实施方案中，第一次诱变PCR中降低浓度的dNTP为dGTP。

上述适体组的制备方法，采用SELEM(Systematic Evolution of Ligands byEnhanced Mutation强化诱变配体系统进化)技术，其关键点如下：

①连续强化的诱变

SELEM在SELEX的基础上，通过连续强化的变异和渐趋苛刻的选择来实现适体分子的定向进化，以此抵消起始文库可能不含所需序列的风险。现有的SELEX技术虽然也包含了微小的变异，但其变异只是基于系统中酶活性(例如DNA聚合酶)的低保真性(lowfidelity)。这种低保真性的频率极低，单凭此不足以构成足够的变异动力。本发明在PCR(Polymerase Chain Reaction)过程中强化诱变，集变异和扩增于同一过程，构成足够的变异动力，从而驱动高效的定向进化。换言之，每一轮的PCR都通过强化了的诱变为下一轮的筛选提供更多新的相关序列。然后，新一轮的文库在更进一步苛刻的条件下接受选择。如此反复，每一轮都驱动文库得到更新。这种吐弱纳强的更新过程使得一系列连续动态文库所含的序列与靶标的亲和力逐步提高。

诱变PCR(mutagenesis PCR)在酶工程等领域是一种常用的策略。其变异动力可以通过以下方式而获得：在反应体系中施加过渡金属离子、选用聚合保真性低的DNA聚合酶、所用的4种自然核苷酸(dNTPs)浓度彼此不相等、或过度增加热循环数等。在本发明的一个优选实施方案中，采用综合变异动力，包括采用低保真(low fidelity)的Taq DNA聚合酶配以过渡金属离子(MnCl₂中的锰离子)、不等量的自然核苷酸配以脱氧次黄苷三磷酸(deoxyinosine>-4至2x10^-3之间，当反应体系中同时存在MnCl₂其出错率加剧。非自然核苷酸dITP不具备严格遵循碱基互补配对原则的特点，当反应体系中原有4种自然核苷酸的某一种核苷酸用量偏低同时又有dITP存在，那么dITP通过Taq>

②渐趋苛刻的选择

在分子进化过程中变异和选择两者均不可或缺。逐渐提高选择压力有利于对动态文库中的序列进行连续地吐弱纳强。通过渐趋苛刻的条件从连续变异的动态文库中筛选出来的单链DNA序列，其亲和力一轮比一轮提高了。选择条件包括所用缓冲液中洗涤剂浓度、离子强度、pH值，靶标与单链DNA序列孵育温度、时间，对细胞表面非特异性结合点的屏蔽，等等。本发明根据精子这一具体的靶标特点，进行了优化选择条件。特别是洗涤剂的浓度和孵育的温度在进化过程中的提高速度。

SELEM按照上述两个基本原理建立一种体外分子定向进化的新方法。进化沿着增强亲和力的方向发展，文库所含的序列通过吐弱纳强，渐趋高亲和状态。其中亲和力最强的序列可以不是来自于起始文库而是在定向进化过程中通过变异分化而来的。

③制备具有亲和力强、特异性高、抑制精子功能确实的适体(医学科学研究伦理批准编号：2012001)

如上所述，即使起始文库不含亲和力强的序列，通过逐步苛刻的条件也可以从连续变异分化的动态文库里筛选出与精子亲和力强的适体。除了亲和力，本发明所制备的适体同时还要求与精子细胞结合的高特异性。为了到达这个要求，所采用的筛选步骤包括正筛(positive selection)和反筛(Negative selection)。用精子作为靶标来筛选与之结合的核酸序列，称为正筛选。为了排除掉非特异性结合的核酸序列，将与精子结合的核酸序列分离出来后，再与阴道上皮细胞共孵育，除去能与上皮细胞结合的序列，留下只与精子结合的核酸序列，称为反筛选。反筛之后留下的单链DNA序列又进入下一轮的变异和选择。如此反复，筛选出特异性高的适体。

本发明的有益效果：本发明的适体组对精子的亲和力强、特异性高，且对精子具有制动功能。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

(1)选择单链寡核苷酸起始文库，其具体序列为正向引物的序列+N₄₀+反向引物结合序列，其中N₄₀为长度40个核苷酸的随机序列，具体为：GGCATACGAGCTTGTTCAATA(如SEQ>40+TGATAGTAAGTGCAATCTCGC(与SEQ>

(2)设计和制备正向引物和反向引物：正向引物：Pf序列为5’GGCATACGAGCTTGTTCAATA(SEQ ID NO 36)；Pff在Pf的5’端加上一个荧光基团(fluorescence)；反向引物：Pr序列为5’GCGAGATTGCACTTACTATCA(SEQ ID NO 37)；Prb在Pr的5’端加上一个生物素基团(biotin)；

(3)制备人精子标本，分为不同稀释度精浆的抗冻精液和新鲜精液；经医学伦理委员批准，采用捐赠者精液。加甘油至终浓度为30％。抗冻精液分装(每份20万/10μL)于液态氮中储存以备用于筛选适体分子。从第1至第3轮采用纯化的精子细胞，即用磷酸盐缓冲液(PBS)完全置换精浆。之后，根据筛选过程的监测，逐渐减少PBS比例，直至不含PBS。

(4)制备人阴道上皮细胞：经医学伦理委员批准，取材于行全子宫切除术后的阴道组织，术后病理诊断为良性疾病。采用本行业内技术人员所熟知的方法，将阴道组织经过消毒、剪除皮下组织、接种培养和传代培养。为反筛步骤提供上皮细胞，用以排除非特异性序列。；

(5)进行诱变PCR延伸扩增上述单链寡核苷酸起始文库，引物为步骤(2)的正向引物和反向引物，反应体系中还包括dNTPs、dITP、MnCl₂，Taq>

a、在1.5ml离心管中加入溶于100μL结合缓冲液(含4.5g/L葡萄糖、5mmol/LMgCl₂、0.1mg/mL酵母tRNA、1mg/mL牛血清清蛋白BSA和起始浓度为0％NP40，调节pH为7.5)的起始文库，含10^15-16拷贝数的GGCATACGAGCTTGTTCAATAN₄₀TGATAGTAAGTGCAATCTCGC(其中N₄₀为40个碱基长随机序列段)。置摇床上0℃冰浴5min后加入10μL人精子，混匀，继续摇动(150r/min)孵育60min。然后4℃1,000r/min离心5min，弃上清液，加500μL清洗缓冲液(含4.5g/L葡萄糖和5mM>2，调节pH为7.5)重悬精子，重复清洗3次。用100μL结合缓冲液重悬精子细胞沉淀，加热至94℃10min，立即离心(12kr/min)5min，弃沉淀，吸取上清液，获得第一轮筛选产物。

b、以筛选产物为模板进行诱变PCR，在50μL的PCR反应体系中含6μL新一轮筛选产物，1μM Pf，1μM Prb，10mM Tris-HCl，pH 8.6，50mM KCl，5mM>2，新配0.1mM>2，3UTaq>

(6)用步骤(5)所得的双链DNA产物制备仅含有正链的单链DNA序列：采用本行业内技术人员所熟知的方法，通过琼脂凝胶电泳回收PCR的双链DNA(dsDNA)产物。用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠富集dsDNA，弃上清液。置带PCR产物的磁珠于45μL 0.3N NaOH溶液中，分离互补的两条链，其中带有生物素的负链与磁珠结合，在磁力作用下，从溶液中去除掉。留在溶液中的正链即为含单链DNA序列的次级文库，用于下一轮筛选；

(7)对上述单链DNA序列进行选择，以获得选定序列，该选择包括与步骤(3)的抗冻精液共孵育进行正向筛选和与步骤(4)的人阴道上皮细胞共孵育进行反向筛选，反向筛选和正向筛选的孵育温度相同，具体的：加5μL 3N HCl中和单链DNA序列，再加50μL 2倍浓度的结合缓冲液，和10μL人精子进行正筛。

正筛选之后进行反筛，采用10μL洗脱液(含7M尿素和5mM EDTA)，将与精子结合的核酸序列分离出来，再与阴道上皮细胞共孵育(医学伦理委员批准)，加90μL不含洗涤剂的结合缓冲液中，室温1h。离心后留取上清液，其中含有只与精子结合而不与上皮细胞结合的选定序列。

(8)将步骤(7)选择得到的选定序列作为模板返回步骤(5)进行诱变PCR，并依次重复若干轮步骤(5)的b至(7)，通过步骤(5)b的强化诱变；再通过步骤(6)和(7)的渐趋苛刻选择，吐弱纳强，直至获得选定适体；其中，

每一轮步骤(5)的诱变PCR轮流降低dNTPs中其中一种的浓度，其余dNTPs的浓度均与dITP相同，具体的：在筛选过程中需要连续多次的PCR，每一次PCR投料时轮流降低4种自然核苷酸(dNTPs：dGTP，dTTP，dCTP和dATP，第一轮的PCR选dGTP的浓度偏低。)中的1种浓度为20μM，其他3种自然核苷酸浓均为200μM；

每一轮正向筛选所用的缓冲液中的洗涤剂的浓度从0逐渐升高，且孵育温度也逐渐升高；每一轮的反向筛选所用的缓冲液均不含洗涤剂，具体的：每一轮正向筛选的孵育条件在上述步骤(5)的a的孵育条件基础上渐趋苛刻，每2轮的进化步骤提高0.05％NP40浓度，使得NP40的浓度从开始的0％增至0.4％，然后稳定至进化结束，每2轮的进化步骤提高4℃，使得温度从开始的0℃增至24℃，然后稳定至结束，孵育温度与该轮正筛选的温度同步升高。

(9)采用NanoDrop 2000C分光光度计检测每一轮从靶标精子标本洗脱下来的结合核酸序列浓度，借此监测筛选过程。根据结合序列获得量增加的情况，调整筛选条件以及决定是否停止进化而进入克隆和测序阶段。

荧光标记：从第十轮开始进行双份PCR，其中一份如以上第(2)节所述。另一份PCR反应采用荧光标记的正向引物(Pff)，其余条件相同。扩增后的正链序列带有荧光，负链带有生物素。用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠富集dsDNA，弃上清液。置带PCR产物的磁珠于45μL 0.3N NaOH溶液中，分离互补的两条链，其中带有生物素的负链与磁珠结合而从溶液中去除掉。带荧光的正链序列与精子共孵育，通过荧光显微镜监测抗精子适体的富集情况。

(10)对上述选定适体进行克隆、挑选和测序，获得所述第一至第三十五候选适体：第15轮正筛洗脱液中DNA浓度达25ug/μL，同一轮在镜下可见精子明显荧光信号。便以该洗脱液为模板，通过高保真PCR扩增(采用的引物对：Pf/Pr)。以本行业内技术人员所熟知的方法，采用pGEM t-vector将扩增产物克隆并转染进大肠杆菌DH5a。常规平板培养。

以菌落直接为模板通过PCR扩增，参照以上步骤(9)所述，制备带荧光单克隆序列。在镜下观察，挑选可与精子相结合但不与上皮细胞结合的单克隆适体进行测序，具体如表1所示：

表1抑制精子活动力的第一至第三十五候选适体

(11)以步骤(10)获得的第一至第三十五候选适体为模板，以步骤(3)的新鲜精液为靶标，进行功能性筛选和诱变PCR进化，获得所述若干功能性适体，即所述抑制精子活动力的适体组，具体如实施例2所示。

实施例2

(1)诱变PCR：混合实施例1所获的第一至第三十五候选适体为模板，在50μL的PCR反应体系中含，1μM Pf，1μM Prb，10mM Tris-HCl，pH 8.6，50mM KCl，5mM>2，新配0.1mMMnCl₂，3U>

(2)采用本行业内技术人员所熟知的方法，通过琼脂凝胶电泳回收PCR的双链DNA(dsDNA)产物。用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠富集dsDNA，弃上清液。置带PCR产物的磁珠于45μL 0.3N NaOH溶液中，分离互补的两条链，其中带有生物素的负链与磁珠结合，在磁力作用下，从溶液中去除掉。留在溶液中的正链即为含单链DNA序列的次一级文库，用于下一轮筛选。加5μL 3N HCl中和溶液，再加50μL2倍浓度的结合缓冲液(含终末浓度0.05％NP40)。

(3)功能性筛选：将10μL新鲜精液用含10％血清的Earle’s培养液洗涤后与上述(2)所获的核酸片段混匀，静置于含CO₂孵育箱内1h，使精子获能游动，而活力受制的精子沉底。弃上层云雾状含活力的精子，取沉底精子包括与其结合的核酸片段，进行PCR扩增。

(4)以上述(3)所获的沉底精子包括与其结合的核酸片段为模板进行诱变PCR，在50μL的PCR反应体系中含1μM Pf，1μM Prb，10mM Tris-HCl，pH 8.6，50mM KCl，5mM>2，新配0.1mM>2，3U>

(5)重复上述步骤(2)-(4)。

(6)荧光标记：从第六轮开始进行双份PCR，其中一份如以上第(4)节所述，另一份PCR反应采用荧光标记的正向引物(Pff)，其余条件相同。扩增后的正链序列带有荧光，负链带有生物素。用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠富集dsDNA，弃上清液。置带PCR产物的磁珠于45μL 0.3N NaOH溶液中，分离互补的两条链，其中带有生物素的负链与磁珠结合而从溶液中去除掉。在溶液中加5μL3N HCl中和之，再加50μL2倍浓度的结合缓冲液。带荧光的正链序列与精子共孵育，通过荧光显微镜监测抗精子适体的富集情况。

(7)第10轮的监测在镜下可见精子明显荧光信号。便以同一轮的文库为模板，通过高保真PCR扩增(采用的引物对为Pf和Pr)。采用本行业内技术人员所熟知的方法，通过琼脂凝胶电泳回收PCR的双链DNA(dsDNA)产物。用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠富集dsDNA，弃上清液。置带PCR产物的磁珠于45μL 0.3N NaOH溶液中，分离互补的两条链，其中带有生物素的负链与磁珠结合，在磁力作用下，从溶液中去除掉。留在溶液中的正链即为能够抑制精子活动的适体，即本发明的适体组。

(8)采集精子标本：捐精入选者年龄22-30岁，采精前禁欲5-7天，以自慰采集标本，精液量≥2ml。液化后30min之内检查完毕。用来自于同一份精液的两份不同的10μL标本重复计数200个精子细胞，并比较两次独立计数各级精子所占的百分数。镜下将精子活动力分为4级：a级精子活动好，运动迅速，活泼有力，直线向前运动；b级精子活动较好，运动速度尚可，游动方向不定，呈直线或非直线运动，带有回旋；c级精子运动不良，运动迟缓，原地打转或抖动，向前运动能力差；d级精子，精子完全不活动。借助于实验室计数器的帮助，计数各级精子的数目。

统计学处理：试验数据采用SPSS10.0统计软件进行分析，组间计量资料用T检验进行比较。结果如表2所示。

表2所制备的适体对人精子活动力的抑制作用

实验表明本发明所制备的适体组对人精子活动力的抑制作用具有非常明显的统计学意义。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

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tgcgagattg cacttactat ca 82

<210> 25

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggcatacgag cttgttcaat atgctgcgcg ctatagcgca tgactgcgcg ataatgcgct 60

agcgagattg cacttactat ca 82

<210> 26

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ggcatacgag cttgttcaat aatgctgagc tgactgatcg tcgatatcgc gcgctattag 60

cgcgagattg cacttactat ca 82

<210> 27

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggcatacgag cttgttcaat atgctattta tagtcgcgcg ctggatatat gctgcgcttc 60

ggcgagattg cacttactat ca 82

<210> 28

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggcatacgag cttgttcaat atagctatat ttatgctgct gatgctagtc gtgtatatat 60

agcgagattg cacttactat ca 82

<210> 29

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

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cgcgagattg cacttactat ca 82

<210> 30

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggcatacgag cttgttcaat atagctgcta tagctgctgc gcgcgatgct gactgacgct 60

agcgagattg cacttactat ca 82

<210> 31

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggcatacgag cttgttcaat agactagcta cgcgtcagat cgtcctatag catgcattgc 60

ggcgagattg cacttactat ca 82

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<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggcgagattg cacttactat ca 82

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

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agcgagattg cacttactat ca 82

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcgagattgc acttactatc a 21