一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用

摘要

本发明公开了一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其在合成左旋多巴中的应用，本发明所提供的具核梭杆菌TPL突变体与野生型相比较，具有更优良的催化性能。TPL突变体合成左旋多巴累积浓度高达140g/L以上，与野生型相比提高了17％～25％，光学纯度大于99.5％；底物邻苯二酚的转化率达到99.8％以上，与野生型相比较提高了15％‑20％。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种来源于具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine Phenol Lyase，TPL)突变体、编码基因及其在催化合成左旋多巴(L-DOPA)中的应用。

(二)背景技术

左旋多巴(β-3,4-二羟苯基-α-丙氨酸，3,4-dihydroxylphenylalanine-L-alanine，L-DOPA)是生物体内重要的生物活性物质。它能够通过血脑屏障，到达中枢神经系统，在体内脱羧酶的作用下，转化为多巴胺，进而发挥治疗帕金森综合症的作用。随着现代社会生活压力的增加以及人口老龄化的加剧，帕金森病患者数日益升高，左旋多巴作为帕金森综合症治疗的首选药物，其需求量不断增加。

传统制备左旋多巴的主要方法包括从植物如藜豆、猫豆中提取以及化学法不对称合成等。其中，从植物中提取左旋多巴受到原料来源的限制，并且提取步骤繁杂、产量低，远不能满足市场需求；而化学不对称合成法由于反应条件苛刻、转化率及立体选择性低、环境不友好等问题，在工业生产中受到限制。生物催化因其反应条件温和、过程高效、高度立体、区域和化学选择性等优点，已成为左旋多巴工业化生产的重要方法。

酶法合成左旋多巴的生物催化剂主要包括酪氨酸酶、氨基酰化酶、p-羟基苯乙酸3-羟化酶、酪氨酸酚裂解酶等。酪氨酸酶催化L-酪氨酸合成左旋多巴的酶活较低，且由于酪氨酸酶同时具有二酚氧化活性，会将左旋多巴进一步氧化生成副产物多巴醌。氨基酰化酶动力学拆分N-乙酰-3-(3,4-二甲氧苯基)丙氨酸水解合成3-(3,4-二甲氧苯基)丙氨酸，其甲氧基经HBr去保护后合成左旋多巴。该工艺路线长，且使用和产生有毒气体MeBr，安全隐患大。p-羟基苯乙酸3-羟化酶催化L-酪氨酸合成左旋多巴时，需辅因子NADH参与催化反应，生产成本高。与上述酶法工艺相比，酪氨酸酚裂解酶(TPL)工艺以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物，通过C-C键形成反应合成左旋多巴，原子经济性高。由于左旋多巴在水中的溶解度低，在生物催化反应中不断析出，有利于该可逆反应向产物生成方向进行，达到较高的转化率，因而具有重要的工业开发前景。

TPL广泛存在于各种微生物中，目前已报道用于左旋多巴合成的TPL来源包括弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)，草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)以及嗜热菌(Symbiobacterium sp.)等。

由于TPL催化合成左旋多巴的底物之一邻苯二酚并非该酶的天然底物，其催化效率有待提高。另一方面，邻苯二酚是强蛋白质变性剂，在高强度工业生产环境下，高浓度邻苯二酚会对TPL产生抑制作用，甚至使其不可逆失活。因此，开发新的高活力及高邻苯二酚耐受能力的TPL对实现左旋多巴的工业化生产具有十分重要的意义。

(三)发明内容

本发明目的是通过定向进化手段对具核梭杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶进行改造，提供一种突变体蛋白，提高蛋白活力，以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物，高效催化合成左旋多巴。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体(即TPL突变体)，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第84位和129位进行易错PCR双突变获得的。具体所述双突变是将第84位的谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，同时将第129位的苏氨酸突变(T)为异亮氨酸(I)，所述突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。任何对SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有TPL活性的，仍属于本发明的保护范围。

本发明从具核梭杆菌(F.nucleatum，CGMCC 1.2526，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)提取其基因组为模板，成功克隆了编码TPL的基因(Fn-TPL)，转化于大肠杆菌(Escherichia coli)后进行了该基因的表达。进一步从大肠杆菌中提取含Fn-TPL质粒，使用多轮易错PCR方法对TPL基因进行随机突变，连接于表达载体后，同样表达于大肠杆菌，通过筛选获得活力提高的突变体，能够用于左旋多巴的工业化生产。

本发明对SEQ ID NO.1编码的TPL进行突变，可采用常规的分子改造手段。优先地，通过易错PCR扩增，改变PCR体系内Mg²⁺浓度，以及添加Mn²⁺，以获得突变DNA序列SEQ>

本发明还提供一种所述具核梭杆菌TPL突变体的编码基因，所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

本发明还涉及一种所述编码基因构建的重组载体以及由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

本发明可通过本领域常规方法将本发明的TPL突变体的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本发明的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将获得的野生型TPL及突变体基因产物与载体pET-28a连接，构建本发明的TPL突变基因重组表达质粒pET28a-FnTPL和pET28a-FnTPLM。

引入编码本发明的TPL突变体的DNA的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表达系统，满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的TPL突变基因可以有效表达。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、曲霉菌，以及动物细胞和高等植物细胞。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET28a-FnTPL和pET28a-FnTPLM转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL和E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM。

本发明重组TPL突变体的制备包括培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组TPL突变蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的TPL的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生TPL即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至光密度OD₆₀₀达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的TPL突变蛋白。

本发明还提供一种所述具核梭杆菌TPL突变体在合成左旋多巴中的应用，具体所述应用以含具核梭杆菌TPL突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸钠和醋酸铵为底物，以亚硫酸钠和EDTA·Na₂为助剂，以磷酸吡哆醛(Pyridoxal>

进一步，所述转化体系中，初始时，邻苯二酚加入终浓度5～50g/L(优选5g/L)，丙酮酸钠加入终浓度5～50g/L(优选8g/L)，醋酸铵加入终浓度5～100g/L(优选50g/L)，亚硫酸钠加入终浓度0.5～10g/L(优选1g/L)，EDTA·Na₂加入终浓度0.5～10g/L(优选2g/L)，磷酸吡哆醛加入终浓度0.05～5mM(优选1mM)，湿菌体用量为2～50g/L(优选20g/L)。

进一步，所述转化反应过程中对邻苯二酚、丙酮酸钠和醋酸铵进行补料，每隔0.5～4h补料一次，其中邻苯二酚每次补料0.1～10g/L(优选5g/L)，丙酮酸钠每次补料0.1～10g/L(优选5g/L)，醋酸铵每次补料1～20g/L(优选3.5g/L)。

本发明提供的TPL突变体可以以游离酶、固定化酶以及重组游离细胞的形式催化合成左旋多巴。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：

(1)斜面培养：将含具核梭杆菌TPL突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养8～16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH7.0。使用前加入50μg/ml卡那霉素。

(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，pH 7.0。

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度3％的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中，将已灭菌的终浓度为15g/L乳糖直接添加到发酵罐中于28℃下诱导培养。待培养6～8h后放罐收集湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH₄)₂SO₄>2PO₄>2HPO₄·3H₂O>4·7H₂O>

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：本发明所提供的具核梭杆菌TPL突变体与野生型相比较，具有更优良的催化性能。TPL突变体合成左旋多巴累积浓度高达140g/L以上，与野生型相比提高了17％～25％，光学纯度大于99.5％；底物邻苯二酚的转化率达到99.8％以上，与野生型相比较提高了15％-20％。

(四)附图说明

图1为含野生型及突变体TPL全细胞催化合成左旋多巴的反应进程。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1 TPL基因的获得

用DNA提取试剂盒提取具核梭杆菌(F.nucleatum subsp.CGMCC 1.2526，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的全基因组DNA，以该DNA为模板，上游引物(5’GCTGAGGATCCATGAGATTTGAAGATTATCCAGC3’)和下游引物(5’GCATCCTCGAGTTATTTTTTTATTCCAAATCTAGC3’)为作用引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL)：5×PrimeSTARTM>

实施例2 易错PCR构建TPL突变文库

以实施例1获得的TPL基因为模板，通过易错PCR扩增，获得突变序列。扩增引物为(5’GCTGAGGATCCATGAGATTTGAAGATTATCCAGC3’)和(5’GCATCCTCGAGTTATTTTTTTATTCCAAATCTAGC3’)。

扩增体系为：50μl反应体系：

10xTaq polymerase buffer：5μL；

Mg²⁺(25mM)：2-8μL；

Mm²⁺(25mM):2-8μL；

10mMdNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μ；

浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，

DNA模板：1μL；

Taq DNA聚合酶：10U；

用双蒸水补足体系。

PCR反应条件为：预变性95℃1min，然后进入温度循环95℃10s，56℃90s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析和切胶回收，由BamHI/XhoI进行双酶切，与同样进行酶切处理的pET28a连接，连接液电击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，得到TPL的突变文库。

实施例3 TPL突变文库的筛选

TPL突变文库的筛选同文献所述(Choi,et al.,Kor.J.Microbiol.2006,34:58-62)。以突变前的酶为参照，初筛获得活力提高的阳性克隆，进一步通过液相色谱测定。通过第一轮突变后，获得活性最高的突变体，测序表明获得的突变体为E84K。提取含E84K突变体的质粒为模板，进行第二轮易错PCR，如实施例2，转化于大肠杆菌后，再进行突变文库的筛选，获得活力较E84K提高的突变体，经测序表明获得的突变体为双突变体E84K/T129I，其氨基酸序列如SEQ ID No.4，核苷酸序列为SEQ ID No.3。

实施例4 野生型和突变体TPL工程菌的诱导表达

分别将含野生型(SEQ ID No.1)和突变体TPL(SEQ ID No.3)重组质粒的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL和E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％(v/v)接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养6～8h后，4℃、8000rpm离心10min收集湿菌体，于-80℃贮存备用。

实施例5 TPL突变体催化剂的制备

(1)斜面培养：将含具核梭杆菌TPL突变体编码基因的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基质量终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0，使用前加入50μg/ml卡那霉素。

(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，pH 7.0。

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度3％的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中，将已灭菌的终浓度为15g/L乳糖直接添加到发酵罐中于28℃下诱导培养。待培养6～8h后放罐收集湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH₄)₂SO₄>2PO₄>2HPO₄·3H₂O>4·7H₂O>

实施例6 野生型及突变体TPL催化合成左旋多巴

以实施例4获得的突变体菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM和出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL细胞分别测定催化合成左旋多巴的能力。

(1)在500ml反应体系中添加邻苯二酚5g/L，丙酮酸钠5g/L，醋酸铵5g/L，亚硫酸钠0.5g/L，EDTA·Na₂0.5g/L，磷酸吡哆醛(PLP)0.05mM，氨水调pH至8.0，实施例5制备的TPL突变体重组细胞浓度5g/L(湿重)；温度15℃条件下进行反应。反应过程采用补料的方式进行，每隔0.5h补料一次，其中邻苯二酚每次补料0.5g/L，丙酮酸钠每次补料0.8g/L，醋酸铵每次补料2g/L转化24h。反应结束后用高效液相色谱进行检测，检测条件如下：

流动相:A:B＝9:1(A:0.02M KH2PO4-6M HCl,pH＝2.6；B:甲醇)

色谱柱:C18(Welchrom 4.6*250mm)

检测波长:280nm

柱温:34℃

进样量:10μL

流速:1ml/min

TPL突变体菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到20g/L，转化率达45％，产率39％，左旋多巴光学纯度大于99.5％；野生型TPL菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到15g/L，转化率达36％，产率达29％，左旋多巴光学纯度大于99.5％。

(2)在500ml反应体系中添加邻苯二酚5g/L，丙酮酸钠8g/L，醋酸铵50g/L，亚硫酸钠1g/L，EDTA·Na₂2g/L，磷酸吡哆醛(PLP)1mM，氨水调pH至8.0，实施例5制备的TPL突变体重组细胞浓度20g/L(湿重)；温度15℃条件下进行反应。反应过程采用补料的方式进行，每隔1h补料一次，其中邻苯二酚每次补料5g/L，丙酮酸钠每次补料5g/L，醋酸铵每次补料3.5g/L转化17h。TPL突变体菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到140g/L(图1)，转化率达99.8％，产率高于91％，左旋多巴光学纯度大于99.5％；而野生型TPL菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到120g/L(图1)，转化率达85％，产率达78％，左旋多巴光学纯度大于99.5％。

(3)在500ml反应体系中添加邻苯二酚20g/L，丙酮酸钠20g/L，醋酸铵60g/L，亚硫酸钠5g/L，EDTA·Na₂5g/L，磷酸吡哆醛(PLP)3.5mM，氨水调pH至8.0，TPL突变体重组细胞浓度35g/L(湿重)；温度15℃条件下进行反应。反应过程采用补料的方式进行，每隔2h补料一次，其中邻苯二酚每次补料8g/L，丙酮酸钠每次补料8g/L，醋酸铵每次补料15g/L转化20h。TPL突变体菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到58g/L，转化率达41％，产率达35％，左旋多巴光学纯度大于99.5％；而野生型菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到45g/L，转化率达35％，产率达27％，左旋多巴光学纯度大于99.5％。

(4)在500ml反应体系中添加邻苯二酚50g/L，丙酮酸钠50g/L，醋酸铵100g/L，亚硫酸钠10g/L，EDTA·Na₂10g/L，磷酸吡哆醛(PLP)5mM，氨水调pH至8.0，实施例5制备的TPL突变体重组细胞浓度50g/L(湿重)；温度15℃条件下进行反应。反应过程采用补料的方式进行，每隔3h补料一次，其中邻苯二酚每次补料10g/L，丙酮酸钠每次补料10g/L，乙酸铵每次补料20g/L转化9h。TPL突变体菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到45g/L，转化率达35％，产率达28％，左旋多巴光学纯度大于99.5％；而野生型菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到30g/L，转化率达25％，产率达19％，左旋多巴光学纯度大于99.5％。

本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> Fusobacteriumnucleatum

<400> 1

atgagatttg aagattatcc agcagagcca tttagaatta aaagtgtaga aactgttaaa 60

atgattgata aggcagcaag agaagaagta attaaaaaag caggatataa tactttctta 120

attaactctg aagatgttta cattgattta ttaactgata gtggaactaa tgctatgagt 180

gataaacaat ggggtggatt aatgcaaggt gatgaagctt atgcaggaag tagaaatttc 240

ttccacttag aagaaactgt aaaagaaata tttgggttta aacatatagt tcctactcac 300

caaggaagag gagcagaaaa tattttatct caaatagcta taaaacctgg acaatatgtt 360

cctggaaata tgtattttac aactactaga tatcaccaag aaagaaatgg tggaatattt 420

aaagatatta tcagagatga ggcacatgat gctactctta atgttccttt caaaggagat 480

attgacttaa ataaattaca aaaattaata gatgaagttg gagcagaaaa cattgcttat 540

gtttgtttag ctgtaactgt aaaccttgct ggtggacaac cagtttctat gaaaaatatg 600

aaagcagtta gagaactaac taaaaaacat ggaataaaag ttttctatga tgcaactaga 660

tgtgttgaaa atgcttactt cattaaagaa caagaagaag gatatcaaga taaaactata 720

aaggaaatag tgcatgaaat gtttagctat gctgatggat gtactatgag tggtaaaaaa 780

gattgtcttg ttaatatagg tggattttta tgtatgaatg atgaagattt attcttagct 840

gcaaaagaaa tagttgttgt ttatgaaggt atgccatctt atggtggact tgctggtaga 900

gatatggaag ctatggcaat agggttaaga gaatctttac aatatgaata cattagacat 960

agaattttac aagttagata cttaggagaa aaattaaaag aagctggtgt acctatactt 1020

gaaccagttg gaggacatgc tgtattccta gatgctagaa gattctgtcc tcatatccca 1080

caagaagaat tcccagctca agctcttgca gcagctatct atgttgaatg tggtgtaaga 1140

actatggaaa gaggaataat ttctgctggt agagatgtaa aaactggtga aaaccataaa 1200

cctaaactag aaactgttag agttactatt ccaagaagag tttatactta taaacatatg 1260

gatgtagtag cagaaggtat aatcaaatta tataaacata aagaagatat aaaaccatta 1320

gaatttgtat atgaaccaaa acaattaaga ttctttacag ctagatttgg aataaaaaaa 1380

taa 1383

<210> 2

<211> 460

<212> PRT

<213> Fusobacteriumnucleatum

<400> 2

Met Arg Phe Glu Asp Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val

1 5 1015

Glu Thr Val Lys Met Ile Asp Lys Ala Ala Arg Glu Glu Val Ile Lys

202530

Lys Ala Gly Tyr Asn Thr Phe Leu Ile Asn Ser Glu Asp Val Tyr Ile

354045

Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp

505560

Gly Gly Leu Met Gln Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Arg Asn Phe

65707580

Phe His Leu Glu Glu Thr Val Lys Glu Ile Phe Gly Phe Lys His Ile

859095

Val Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Ile Leu Ser Gln Ile

100 105 110

Ala Ile Lys Pro Gly Gln Tyr Val Pro Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr

115 120 125

Thr Arg Tyr His Gln Glu Arg Asn Gly Gly Ile Phe Lys Asp Ile Ile

130 135 140

Arg Asp Glu Ala His Asp Ala Thr Leu Asn Val Pro Phe Lys Gly Asp

145 150 155 160

Ile Asp Leu Asn Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Val Gly Ala Glu

165 170 175

Asn Ile Ala Tyr Val Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly

180 185 190

Gln Pro Val Ser Met Lys Asn Met Lys Ala Val Arg Glu Leu Thr Lys

195 200 205

Lys His Gly Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn

210 215 220

Ala Tyr Phe Ile Lys Glu Gln Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Lys Thr Ile

225 230 235 240

Lys Glu Ile Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met

245 250 255

Ser Gly Lys Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met

260 265 270

Asn Asp Glu Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Glu Ile Val Val Val Tyr

275 280 285

Glu Gly Met Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala

290 295 300

Met Ala Ile Gly Leu Arg Glu Ser Leu Gln Tyr Glu Tyr Ile Arg His

305 310 315 320

Arg Ile Leu Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Lys Leu Lys Glu Ala Gly

325 330 335

Val Pro Ile Leu Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala

340 345 350

Arg Arg Phe Cys Pro His Ile Pro Gln Glu Glu Phe Pro Ala Gln Ala

355 360 365

Leu Ala Ala Ala Ile Tyr Val Glu Cys Gly Val Arg Thr Met Glu Arg

370 375 380

Gly Ile Ile Ser Ala Gly Arg Asp Val Lys Thr Gly Glu Asn His Lys

385 390 395 400

Pro Lys Leu Glu Thr Val Arg Val Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr

405 410 415

Tyr Lys His Met Asp Val Val Ala Glu Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Lys

420 425 430

His Lys Glu Asp Ile Lys Pro Leu Glu Phe Val Tyr Glu Pro Lys Gln

435 440 445

Leu Arg Phe Phe Thr Ala Arg Phe Gly Ile Lys Lys

450 455 460

<210> 3

<211> 1383

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

atgagatttg aagattatcc agcagagcca tttagaatta aaagtgtaga aactgttaaa 60

atgattgata aggcagcaag agaagaagta attaaaaaag caggatataa tactttctta 120

attaactctg aagatgttta cattgattta ttaactgata gtggaactaa tgctatgagt 180

gataaacaat ggggtggatt aatgcaaggt gatgaagctt atgcaggaag tagaaatttc 240

ttccacttag aaaaaactgt aaaagaaata tttgggttta aacatatagt tcctactcac 300

caaggaagag gagcagaaaa tattttatct caaatagcta taaaacctgg acaatatgtt 360

cctggaaata tgtattttac aactattaga tatcaccaag aaagaaatgg tggaatattt 420

aaagatatta tcagagatga ggcacatgat gctactctta atgttccttt caaaggagat 480

attgacttaa ataaattaca aaaattaata gatgaagttg gagcagaaaa cattgcttat 540

gtttgtttag ctgtaactgt aaaccttgct ggtggacaac cagtttctat gaaaaatatg 600

aaagcagtta gagaactaac taaaaaacat ggaataaaag ttttctatga tgcaactaga 660

tgtgttgaaa atgcttactt cattaaagaa caagaagaag gatatcaaga taaaactata 720

aaggaaatag tgcatgaaat gtttagctat gctgatggat gtactatgag tggtaaaaaa 780

gattgtcttg ttaatatagg tggattttta tgtatgaatg atgaagattt attcttagct 840

gcaaaagaaa tagttgttgt ttatgaaggt atgccatctt atggtggact tgctggtaga 900

gatatggaag ctatggcaat agggttaaga gaatctttac aatatgaata cattagacat 960

agaattttac aagttagata cttaggagaa aaattaaaag aagctggtgt acctatactt 1020

gaaccagttg gaggacatgc tgtattccta gatgctagaa gattctgtcc tcatatccca 1080

caagaagaat tcccagctca agctcttgca gcagctatct atgttgaatg tggtgtaaga 1140

actatggaaa gaggaataat ttctgctggt agagatgtaa aaactggtga aaaccataaa 1200

cctaaactag aaactgttag agttactatt ccaagaagag tttatactta taaacatatg 1260

gatgtagtag cagaaggtat aatcaaatta tataaacata aagaagatat aaaaccatta 1320

gaatttgtat atgaaccaaa acaattaaga ttctttacag ctagatttgg aataaaaaaa 1380

taa 1383

<210> 4

<211> 460

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Met Arg Phe Glu Asp Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val

1 5 1015

Glu Thr Val Lys Met Ile Asp Lys Ala Ala Arg Glu Glu Val Ile Lys

202530

Lys Ala Gly Tyr Asn Thr Phe Leu Ile Asn Ser Glu Asp Val Tyr Ile

354045

Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp

505560

Gly Gly Leu Met Gln Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Arg Asn Phe

65707580

Phe His Leu Lys Glu Thr Val Lys Glu Ile Phe Gly Phe Lys His Ile

859095

Val Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Ile Leu Ser Gln Ile

100 105 110

Ala Ile Lys Pro Gly Gln Tyr Val Pro Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr

115 120 125

Ile Arg Tyr His Gln Glu Arg Asn Gly Gly Ile Phe Lys Asp Ile Ile

130 135 140

Arg Asp Glu Ala His Asp Ala Thr Leu Asn Val Pro Phe Lys Gly Asp

145 150 155 160

Ile Asp Leu Asn Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Val Gly Ala Glu

165 170 175

Asn Ile Ala Tyr Val Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly

180 185 190

Gln Pro Val Ser Met Lys Asn Met Lys Ala Val Arg Glu Leu Thr Lys

195 200 205

Lys His Gly Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn

210 215 220

Ala Tyr Phe Ile Lys Glu Gln Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Lys Thr Ile

225 230 235 240

Lys Glu Ile Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met

245 250 255

Ser Gly Lys Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met

260 265 270

Asn Asp Glu Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Glu Ile Val Val Val Tyr

275 280 285

Glu Gly Met Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala

290 295 300

Met Ala Ile Gly Leu Arg Glu Ser Leu Gln Tyr Glu Tyr Ile Arg His

305 310 315 320

Arg Ile Leu Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Lys Leu Lys Glu Ala Gly

325 330 335

Val Pro Ile Leu Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala

340 345 350

Arg Arg Phe Cys Pro His Ile Pro Gln Glu Glu Phe Pro Ala Gln Ala

355 360 365

Leu Ala Ala Ala Ile Tyr Val Glu Cys Gly Val Arg Thr Met Glu Arg

370 375 380

Gly Ile Ile Ser Ala Gly Arg Asp Val Lys Thr Gly Glu Asn His Lys

385 390 395 400

Pro Lys Leu Glu Thr Val Arg Val Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr

405 410 415

Tyr Lys His Met Asp Val Val Ala Glu Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Lys

420 425 430

His Lys Glu Asp Ile Lys Pro Leu Glu Phe Val Tyr Glu Pro Lys Gln

435 440 445

Leu Arg Phe Phe Thr Ala Arg Phe Gly Ile Lys Lys

450 455 460