一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子及应用

摘要

本发明公开了一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子及应用，所述西门利克森林病毒复制子为含有荧光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。利用该复制子可制备出携带绿色荧光蛋白基因且具有单次感染性的SFV病毒，该复制子或其制备的病毒颗粒在非人灵长类，特别是猴神经细胞的标记、细胞精细形态的描绘、神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子及应用。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础，神经网络的正常连接，使得机体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，尚无有效手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。

西门利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)属于披膜病毒科甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成4个结构蛋白(C、P62、6K和E1)和4个非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。塞姆利基森林病毒具有广泛的宿主范围，包括：人、鼠、猴等，能够感染神经系统，一方面不利于人类的健康和农业生产，另一方面，这种感染特性可以使得其成为介导外源基因到宿主体内的载体，另外，西门利克森林病毒感染脑神经系统的特性使其成为具备解析神经环路的能力。但是因为存在一系列工艺和技术改造方面的问题，所以目前其还没有应用到细胞精细形态的描绘、灵长类神经环路的标记等方面。而本发明通过一系列的条件优化、系统的改造和升级，获得了一种高效且稳定的具有单次感染特性的表达绿色荧光蛋白的SFV系统，明确了其在非人灵长类神经环路应用方面的效果，为开展脑科学研究提供了良好的工具系统。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了一种高效且稳定的具有单次感染特性的表达绿色荧光蛋白的SFV系统。将在神经细胞和非神经细胞精细形态的描绘、灵长类和非灵长类解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子，该复制子为含有荧光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。该复制子可用于西门利克森林病毒类病毒颗粒的制备。

本发明还有一个目的在于提供了一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子的应用，包括该复制子可用于制备西门利克森林病毒类病毒颗粒。制备出的病毒样颗粒可用于非人灵长类神经细胞快速标记，同时，该复制子还可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子，该复制子为含有荧光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。

优选的，使用BamHI+XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSFV-replicon-EGFP，其序列为SEQ ID NO:8所示。

一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子的应用，包括：

1.西门利克森林病毒复制子制备表达绿色荧光蛋白的单次感染性的西门利克森林病毒类病毒颗粒：

使用NruI分别酶切pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper(Berglund,P et al.,(1993)Biotechnology 11,916-920.)，使用MEGAscript SP6Transcription Kit分别体外转录酶切后的pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，收集上清，即得。

2.西门利克森林病毒复制子制备出的病毒样颗粒在制备非人灵长类神经细胞快速标记药物中的应用，特别是用于猴神经细胞的快速标记。

本发明提供的一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子的制备方法也适合于与西门利克森林病毒同科的病毒的构建，例如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)和辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)。西门利克森林病毒复制子或其制备出的病毒样颗粒不仅可用于非人灵长类神经细胞的快速标记，还可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明提供了一种高效、便捷的表达外源蛋白的类西门利克森林病毒的颗粒，该平台制备的病毒具有可视化的特点，便于开展相关的研究。

2.本发明对于开展非人灵长类神经细胞的标记具有重要价值，同时对于其他应用性研究(如蛋白表达、基因治疗、细胞精细结构描绘、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装盒致病机制等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

3.本发明制备的类病毒颗粒能够在数天的时间内快速标记非人灵长类神经细胞。

4.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。SFV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于非人灵长类动物，而且还能用于非灵长类动物的脑科学研究。

附图说明

图1为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒的构建和制备示意图。

A：一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子的构建示意图；

B：一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒的制备示意图。

图2为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒表达荧光示意图。

A：未转染RNA的细胞；

B：共转染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21细胞表达绿色荧光蛋白；

图3为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒单次感染细胞。

A：类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；

B：类病毒颗粒感染BHK21细胞后收集的上清感染BHK21细胞，没有荧光蛋白的表达，即没有病毒产生；

图4为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒生长曲线。

A：类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；

B：不同时间收集类病毒颗粒的滴度分析；

图5为一种稳定携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒快速标记非人灵长类动物(猴)神经细胞的示意图。

猴脑感染表达EGFP的西门利克森林病毒类病毒颗粒后2天，神经细胞被绿色荧光蛋白标记。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子，包括下述步骤制备步骤：

①以pEGFP-N2(Invitrogen公司)为模板扩增EGFP基因，其序列为SEQ ID NO:1，使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物扩增片段SEQ ID NO:1；以pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)为模板扩增capsid的N端102bp(即C34)，其序列为SEQ ID NO:4，使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物扩增片段SEQ ID NO:4；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。C34和EGFP之间通过F2A连接，其序列为SEQ ID NO:7，其序列包含在引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:2中。

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μM Forward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNA Polymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用BamHI和XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到SFV复制子质粒Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSFV-replicon-EGFP，其序列为SEQ ID NO:8所示。

实施例2：

一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子的应用：制备表达绿色荧光蛋白的单次感染性的西门利克森林病毒类病毒颗粒：

用NruI分别酶切pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper(Berglund,P et al.,(1993)Biotechnology 11,916-920.)，使用MEGAscript SP6Transcription Kit分别体外转录酶切后的pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，通过倒置荧光显微镜观察细胞状态和荧光表达，在感染后的不同时间收集病毒上清。使用终浓度为500μg/ml的α-chymotrypsin(Sigma)在37度处理收集的上清30min，然后加入终浓度为250μg/ml>

图2中A：没有转染RNA的BHK21细胞，作为实验的对照；

图2中B：共转染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21细胞，1天后即可产生绿色的荧光信号，表明依赖于西门利克森林病毒复制子能高效快速表达外源蛋白。

利用实施例2所述的方法而制备的表达绿色荧光蛋白的西门利克森林病毒类病毒颗粒经过α-chymotrypsin和aprotinin处理后，用于以下实施例。

实施例3：

西门利克森林病毒复制子制备出的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有单次感染性：

取1μl类病毒颗粒感染BHK21细胞，在感染后1天观察绿色荧光的表达情况，并收集培养基上清。取收集的培养基上清100μl感染BHK21细胞，感染后不同时间观察荧光的表达情况。

图3中A：携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白，表明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值。

图3中B：将感染BHK21细胞后收集的上清再次感染新制备的BHK21细胞，观察后不同时间没有观察到荧光蛋白的表达，表明该病毒样颗粒具有单次感染细胞的特点。

实施例4：

西门利克森林病毒复制子制备出的西门利克森林病毒类病毒颗粒生长曲线分析：

分别取不同时间点收集的类病毒颗粒100μl感染BHK21细胞，在感染后2天观察绿色荧光的表达情况，并计数荧光细胞的数量，计算病毒的滴度。

图4中A：携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白。不同时间收集的病毒均能感染BHK21细胞，并表达绿色荧光蛋白，表明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值。

图4中B：携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在BHK21细胞中的生长曲线。在将pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA共转染BHK21细胞后1天，病毒滴度即达到7×10⁶FFU/ml，而后逐渐升高，转染后3天，滴度到达1.8×10⁸FFU/ml。该数据对于选择最佳的时间收集携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有重要意义。

实施例5：

携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在标记猴神经细胞中的应用，其步骤是：

手术前，无菌的条件下肌肉注射氯胺酮45mg到猕猴(体重4.5kg)，然后肌肉注射戊巴比妥135mg和阿托品0.18mg。然后移除面积为7cm×2.8cm的颅骨，剥除硬脑膜以暴露皮层，注射4μl携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒(滴度是1.8×10⁸FFU/ml)定位注射到猴脑(猕猴，猴龄12年)到猴脑。当注射器的针头达到目的脑区后，等待2min，然后开始缓慢的注射，每次注射使用时间约为20min，注射完毕后等待约10min，然后再拔出针头。术后3天，每天肌肉注射头孢菌素112.5mg。

采用逆差计时的方式分别在取脑组织前1、2、5、7、10天麻醉猴后，用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中2周，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。在注射携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒后2天，可见明显的绿色荧光蛋白的表达，表明携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒能够感染猴脑神经细胞，并能在其中复制和表达蛋白(图5)，该结果表明携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有标记非人灵长类动物神经网络的潜力，其标记的速度快速(只需要2天)，因此是一种高效的标记非人灵长类动物神经元的工具。

最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院武汉物理与数学研究所

<120>一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子及应用

<130>一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子及应用

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<170>PatentIn version 3.1

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gtgacactat a 11471