一种水稻悬浮单细胞培养基及水稻单细胞的制备方法

摘要

本发明提供了一种用于水稻悬浮单细胞培养的AA培养基，本发明培养基中，通过向基本培养基AA中加入丁香酚等激素，能够提高所培育水稻悬浮细胞的增殖速度。同时，本发明还提供了一种水稻悬浮单细胞的制备方法，本发明方法中，通过使用本发明中所述添加有丁香酚等特殊激素小分子化合物成分的基本培养基AA，从而提高了水稻悬浮单细胞的培养速度，同时也提高了制备水稻悬浮单细胞的效率。同时，本发明方法能用于粳米和籼米等不同种类水稻单悬浮细胞的制备，并且都能够实现单细胞的高效培养。因此，本发明方法具有适用范围广，单细胞培养效率高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及单细胞培养领域，具体而言，涉及一种水稻悬浮单细胞培养基及水稻单细胞的制备方法。

背景技术

悬浮单细胞是用来研究污染物对细胞制毒机制的重要试验材料，同时可用来制备原生质体，并进一步开展植物基因组、蛋白质组等操作研究，是一种重要的基础实验材料。

制备悬浮单细胞难度较大，同一种作物的不同品种间制备悬浮单细胞的难易程度差异就很大。以水稻为例，粳稻的单细胞制备相对较容易，而籼稻品种则很难制备单细胞悬浮液。同时，现有技术中，制备水稻悬浮单细胞的培养时间也比较长，一般需要2－3个月的时间才能完成单细胞的培养，不仅耗时，也导致单细胞培养的成本升高。因此，开发一种能够针对不同品种的水稻进行有效悬浮单细胞培养，并且能够实现单细胞快速培养的方法，并提供一种能够提高愈伤组织增殖速度的培养液，也就成了目前亟待解决的技术问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种水稻悬浮单细胞培养基，通过在单细胞培养过程中使用添加有丁香酚等特殊激素小分子化合物成分的基本培养基AA，从而能够水稻悬浮单细胞的增殖速度，同时也提高了制备水稻悬浮单细胞的效率。

本发明的第二目的在于提供一种水稻悬浮单细胞的制备方法，所述的方法中通过改进培养基成分，在基本培养基AA中加入丁香酚等激素成分，从而使得本发明方法能够在较短的时间内制备得到多种水稻品种的悬浮单细胞，进而可以解决现有技术中方法适用面窄，耗时多而且成本高的技术问题。本发明方法能够适用于多种水稻品种悬浮单细胞的制备，并且能够缩短了悬浮单细胞制备的时间，具有应用范围广、悬浮单细胞制备速度快等优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种用于水稻悬浮单细胞培养的AA液体培养基，所述培养基是由2，4－D，KT(激动素)，丁香酚以及蔗糖溶解于基本培养基AA中而制成的。其中，丁香酚在所述培养基中的浓度为0.1－1mg/L。

本发明培养基中，通过向基本培养基AA中加入丁香酚等激素成分，从而能够促进愈伤组织增殖，并进一步提高单细胞的制备速度。

可选的，本发明所述AA液体培养基中各组分浓度为：2，4－D 1－5mg/L；KT 0.1－1mg/L；丁香酚0.1－1mg/L；蔗糖15－40g/L。

同时，本发明还提供了一种水稻悬浮单细胞的制备方法，其包括如下步骤：

将水稻种子去壳后预培养，然后切胚诱导愈伤组织培养，然后将得到的愈伤组织进行继代培养基；

选取继代培养的愈伤组织，并接种于AA液体培养基中，并将接种后的培养基进行超声振荡处理，然后进行震荡培养，即得到水稻悬浮单细胞；

其中，所述AA液体培养基是将2，4－D，KT(激动素)，丁香酚以及蔗糖溶解于基本培养基AA中而制成的。本发明方法中，通过使用添加有丁香酚等特殊激素小分子化合物成分的基本培养基AA，从而提高了水稻悬浮单细胞的培养速度，同时也提高了制备水稻悬浮单细胞的效率。同时，本发明方法适用于多种水稻悬浮单细胞的培养，适用范围广。

可选的，本发明中，所述水稻种子为粳稻种子或籼稻种子。

可选的，本发明中，所述水稻种子为生长饱满的水稻种子。

可选的，本发明中，所述去壳为除去颖壳。

可选的，本发明中，所述切胚为将预培养后所得到的培养水稻种子沿盾片方向切胚，然后将切片(即盾面)组织置于培养基上进行诱导培养。

可选的，本发明中，所述继代培养中，每3天替换继代培养基1次。具体的，所述替换继代培养基为将培养基中2/3上的上清液倒出，然后加入等量的新鲜培养基。

可选的，本发明中，选取的愈伤组织为继代1次的愈伤组织。

可选的，本发明中，选取的继代培养的愈伤组织为生长旺盛且结构松散的愈伤组织。

可选的，本发明中，选取的继代培养的愈伤组织重量为0.5－1g。

可选的，本发明中，所述AA液体培养基在配置完成后，先经过高温灭菌再作为培养基应用。

可选的，本发明中，AA液体培养基的用量为20－50ml。

可选的，本发明中，所述AA液体培养基pH为5.5－5.9；优选的，本发明中，所述AA液体培养基pH为5.7－5.8。

可选的，本发明中，所述振荡培养是在回旋式摇床上进行的。

可选的，本发明中，所述振荡培养是在黑暗条件下进行的。

可选的，本发明中，所述AA液体培养基中，各组分浓度为：基2，4－D 1－5mg/L；KT0.1－1mg/L；丁香酚0.1－1mg/L；蔗糖15－40g/L。优选的，本发明中，所述AA液体培养基中，各组分浓度为：2，4－D 2－3mg/L；KT 0.2－0.5mg/L；丁香酚0.2－0.5mg/L，蔗糖20－30g/L；更优选的，本发明中，所述AA液体培养基中，各组浓度为：2，4－D 2mg/L；KT 0.2mg/L；丁香酚0.2mg/L，蔗糖20－30g/L。

可选的，本发明中，还进一步包括将去壳后水稻种子用酒精消毒，并用次氯酸钠处理的步骤。

可选的，本发明中，所述酒精消毒为将去壳后水稻种子浸泡于50％－75％的酒精中进行消毒。

可选的，本发明中所述消毒的时间1－10min；优选的，本发明中，所述消毒的时间为5－7min。

可选的，本发明中，还包括将消毒后的水稻种子用无菌水进行冲洗的步骤；可选的，所述冲洗为1－3次冲洗。

可选的，本发明中，所述次氯酸钠溶液的为0.05－0.3mol/L；优选的，所述次氯酸钠的浓度0.1－0.2mol/L。

可选的，本发明中，所述次氯酸钠处理为将种子浸泡于次氯酸钠溶液中。

可选的，本发明中，次氯酸钠处理的时间为10－30min；优选的，次氯酸钠处理的时间为20－25min。

可选的，本发明中，所述次氯酸钠处理是在振荡条件下进行的；优选的，本发明中，所述振荡为每5min振荡一次。

可选的，本发明中，所述次氯酸钠处理的时间为10－30min；优选的，本发明中，所述次氯酸钠处理的时间为20min。

可选的，本发明中，还包括在次氯酸钠处理后，再经无菌水冲洗的步骤。

可选的，所述无菌水冲洗的次数为1－10次；优选的，所述无菌水冲洗的次数为4－6次。

可选的，本发明中，所述预培养、诱导愈伤组织培养以及继代培养所用培养基均为添加有2，4－D、KT、蔗糖、琼脂的基本培养基LS，其中，各组分浓度为：2，4－D 1－5mg/L；KT0.05－0.3mg/L；蔗糖20－50g/L；琼脂5－15g/L。

本发明中，通过对对预培养、诱导愈伤组织培养以及继代培养所用培养基的选择和优化，并使用添加有激素和营养物质的基本培养基LS，从而使得处理后水稻种子能够快速发育，所得到的愈伤组织也能够快速增殖，从而提高了悬浮单细胞培养的整体流程速度，提高单细胞培养效率。

可选的，本发明中，所述添加有2，4－D、KT、蔗糖、琼脂的基本培养基LS液体培养基pH为5.5－5.9；优选的，本发明中，所述培养基pH为5.7－5.8。

可选的，本发明中，所述培养基中各组分浓度量为：2，4－D2.5－4.5mg/L；KT0.10－0.15mg/L；糖30－40g/L；琼脂7－12g/L；优选的，本发明中所述培养基中各组分浓度2，4－D 2.5mg/L；KT 0.1mg/L；糖30g/L；琼脂7g/L。

可选的，本发明中，所述预培养、愈伤组织诱导培养以及继代培养的温度为20－30℃；优选的，所述培养的温度为25－27℃。

本发明中，通过对所述培养温度的调整和优化，从而进一步优化了水稻种子组织和/或细胞的发育/增殖环境，从而进一步提高了悬浮单细胞培养的整体流程速度，提高单细胞培养效率。

可选的，本发明中，所述超声振荡的时间为10－20min。

本发明中，通过对超声振荡处理时间的调整和优化，从而可以使得增殖细胞能够充分分散，有利于单细胞的培养。

可选的，本发明中，所述超声振荡的频率为500－3000HZ。

可选的，本发明中，所述振荡培养的温度为20－30℃；优选的，本发明中振荡培养的温度为25－27℃。

本发明中，通过对所述振荡培养温度的调整和优化，从而进一步优化了愈伤组织的增殖环境，从而进一步提高了悬浮单细胞的培养速度，提高单细胞培养效率。

可选的，本发明中，所述振荡培养的振荡速度为60－120rpm；优选的，本发明中，所述振荡培养的振荡速度为80－100rpm。

本发明中，通过对丁香酚等特殊激素小分子用量的进一步调整和优化，从而进一步提高了愈伤组织的增殖速度，进而提高了水稻悬浮单细胞的培养速度，可以将一般几个月才能完成的单细胞培养在15天左右即能够完成。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明中，通过在培养过程中使用添加有丁香酚等特殊激素小分子化合物成分的基本培养基AA，从而提高了所培育水稻悬浮单细胞的增殖速度，同时也提高了制备水稻悬浮单细胞的效率。

(2)本发明中，通过对水稻种子/组织培养以及愈伤组织培养和继代培养等培养环境的调整和优化，进一步提高了悬浮单细胞培养的整体速度，同时也提高了水稻悬浮单细胞培养效率。

具体实施方式

实施例1

(1)水稻愈伤组织培养：挑选适量大小一致、生长饱满的粳稻种子，手工去除颖壳后，置于75％酒精中浸泡消毒7min；然后，将消毒后种子用无菌水冲洗1次，再用0.1mol/L的次氯酸钠浸泡处理20min，期间每隔5min震荡1次次氯酸钠浸泡种子体系。然后，将次氯酸钠处理后种子用无菌水冲洗4次，并将表面沾有的无菌水水吸干，并将种子接种到预培养基上，于25℃以及黑暗条件下，预培养24h。取预培养后得到的胀膨“米粒”沿盾片方向切胚，将切面(即盾片)向上置于培养基上，并于26℃黑暗条件下诱导愈伤组织，15d后剔除芽和根，即得到取愈伤组织；然后，将愈伤组织置于培养基中，兵在27℃黑暗条件下继代培养。

其中预培养、愈伤组织诱导培养以及继代培养所用培养基均为添加有2，4－D、KT、蔗糖、琼脂的基本培养基LS。进一步的，所述培养基中各组分浓度为：2，4－D 2.5mg/L；KT0.1mg/L；蔗糖30g/L；琼脂7g/L。

(2)水稻悬浮单细胞制备：取1.0g继代1次生长旺盛、松散的愈伤组织，然后将其接种于含有50mL经高温灭菌的AA液体培养基中，并将培养基于超声条件下振荡处理15min，从而使得使培养基中愈伤组织细胞充分分散开；然后，将培养基置于回旋式摇床上，并于25℃黑暗条件下，在摇床上以100r/min的振荡速度培养。

其中，所述AA液体培养基是将2，4－D，KT，丁香酚以及蔗糖溶解于基本培养基AA中而制成的，其各组分浓度为：2，4－D 2mg/L；KT 0.2mg/L；丁香酚0.2mg/L；蔗糖30g/L。

振荡培养15天后，将培养基置于显微镜下观察，发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度2×10⁵/ml。

振荡培养过程中，每3d替换一次培养基，培养基替换方法为：倒出原培养基中2/3的上清液，然后加入等量新鲜培养基继续培养。

实施例2

挑选适量大小一致、生长饱满的粳稻种子，然后按照实施例1中所述方法制备水稻悬浮单细胞。

其中，该实施例水稻悬浮单细胞制备的过程中，所述AA液体培养基中各组分浓度为：2，4－D 5mg/L，KT 1mg/L，丁香酚1mg/L，蔗糖40g/L，且其余步骤中所用培养基均与实施例1中相同。

振荡培养15天后，将培养基置于显微镜下观察，未现明显的悬浮细胞；继续培养6天后，将培养基置于显微镜下观察，才发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度1.5×10⁵/ml。

实施例3

挑选适量大小一致、生长饱满的粳稻种子，然后按照实施例1中所述方法制备水稻悬浮单细胞。

其中，该实施例水稻悬浮单细胞制备的过程中，所述AA液体培养基中各组分浓度为：2，4－D 1mg/L，KT 0.1mg/L，丁香酚0.1mg/L，蔗糖15g/L，且其余步骤中所用培养基均与实施例1中相同。

振荡培养15天后，将培养基置于显微镜下观察，未现明显的悬浮细胞；继续培养9天后，将培养基置于显微镜下观察，才发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度1.8×10⁵/ml。

实施例4

挑选适量大小一致、生长饱满的籼稻种子，然后按照实施例1中所述方法制备水稻悬浮单细胞。该实施例中所用培养基均与实施例1中的对应步骤中的培养基相同。

在振荡培养15天后，将实施例4中的培养基置于显微镜下观察，也发现了明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度3×10⁵/ml。

实施例5

挑选适量大小一致、生长饱满的籼稻种子，然后按照实施例1中所述方法制备水稻悬浮单细胞。

该实施例中，水稻悬浮单细胞制备的过程中所用培养基均与实施例2中培养基相同。

在振荡培养15天后，将实施例5中的培养基置于显微镜下观察，未发现明显的悬浮细胞；继续培养8日后，将培养基置于显微镜下观察，才发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度2×10⁵/ml。

实施例6

挑选适量大小一致、生长饱满的籼稻种子，然后按照实施例1中所述方法制备水稻悬浮单细胞。该实施例中，水稻悬浮单细胞制备的过程中所用培养基均与实施例3中培养基相同。在振荡培养15天后，将实施例6中的培养基置于显微镜下观察，未发现明显的悬浮细胞；继续培养10日后，将培养基置于显微镜下观察，才发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度1.9×10⁵/ml。

对比例1

挑选适量大小一致、生长饱满的粳稻种子，然后按照实施例1中所述方法制备水稻悬浮单细胞。

该对比例所用AA液体培养基中，不添加丁香酚，其他添加物用量相同。对比例1中其余步骤中所用培养基均与实施例1中相同。

在振荡培养15天后，将对比例中的培养基置于显微镜下观察，未发现明显的悬浮细胞；继续培养45日后，将培养基置于显微镜下观察，才发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度1×10⁵/ml。

对比例2

挑选适量大小一致、生长饱满的籼稻种子，然后按照实施例1中所述方法制备水稻悬浮单细胞。

该对比例所用AA液体培养基中，不添加丁香酚，其他添加物用量相同。对比例2中其余步骤中所用培养基均与实施例1中相同。

在振荡培养15天后，将对比例2中的培养基置于显微镜下观察，未发现明显的悬浮细胞；继续培养60日后，将培养基置于显微镜下观察，才发现明显的悬浮细胞，经检测，悬浮单细胞的密度1.5×10⁵/ml。

本发明所述方法中，通过使用添加有丁香酚等特殊激素小分子化合物成分的基本培养基AA，从而提高了水稻悬浮单细胞的培养速度，同时也提高了制备水稻悬浮单细胞的效率。进一步的，本发明方法适用于不同种类的水稻悬浮单细胞的制备。因而，本发明方法具有悬浮单细胞培养效率高，适用范围广等优点。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。