一种检测游离态及结合态微量氰化物的方法

摘要

本发明公开了一种检测游离态及结合态微量氰化物的方法，属于分析检测技术领域，主要用于饮料酒及其原料分析。本发明利用一种特定的预处理及衍生化装置，可分别处理游离态或结合态氰化物样品。对于游离态氰化物，释放氢氰酸直接将氰根衍生；对于结合态氰化物先转变为游离氢氰酸，再与衍生试剂衍生。对于衍生物利用液相色谱‑质谱联用技术进行定性定量分析，采用内标法建立标曲，分别计算游离态和结合态氰化物含量。本发明建立的检测方法检测限可低至0.01μg/L，定量限为0.05μg/L，线性相关系数大于0.99，加标回收率为93.8％～106％，相对标准偏差小于10％。本发明方法检测灵敏度高，所需时间短，干扰小，可分别满足结合态和游离态氰化物测定的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测游离态及结合态微量氰化物的方法，属于分析检测技术领域。主要用于饮料酒及其原料分析。

背景技术

氰化物属剧毒物质，可通过呼吸道、消化道以及皮肤进入人体内，与细胞线粒体内氧化型细胞色素氧化酶的三价铁结合，阻止氧化酶中的三价铁还原，妨碍细胞正常呼吸，造成机体缺氧以致产生中毒效应。此外，氰化物在一定条件下还可能形成其他有害化合物，在食品、饮料中存在安全风险。自然界存在的氰化物包括游离态和结合态。结合态氰化物通常以生氰糖苷的形式存在，通过水解形成游离态氰化物，因此也是重要的危险因子。氰化物是酒类的一项重要食品安全检测指标，氰化物也是形成氨基甲酸乙酯的重要前体物质。饮料酒及其原料中的游离态和结合态氰化物，均可形成游离态，继而与酒精形成氨基甲酸乙酯。部分饮料酒中存在氨基甲酸乙酯超标的问题，为了保障食品安全和人民的身体健康，饮料酒中的氰化物研究是十分必要的。准确测定氰化物对于相关危害物的控制具有重要意义。目前，国内外对氰化物的测定多应用在医疗检测、环境等方面。测定方法主要有比色法、荧光法和顶空气相色谱法。而结合态氰化物的测定不太多见，一般需要较复杂的水解过程。比色法主要有异烟酸-吡唑酮、异烟酸-巴比妥酸、吡啶-巴比妥酸法。其中，异烟酸-巴比妥酸法是GB/T5009.48-2003用于检测白酒中氰化物含量的方法。该方法操作繁琐、出现白色浑浊以及颜色干扰问题，在定性中存在假阳性干扰，检测限在3mg/L，对于微量氰化物测定困难。顶空气相色谱法是利用试剂对氰化物进行衍生化，通过顶空萃取结合GC-ECD进行检测。此方法检测到的氰化物为游离态氰化物，检测限在2.5μg/L。现有方法对氰化物的检测，一般存在检出限较高，容易受到样品基质干扰，结合态氰化物测定困难，或者操作繁琐、设备复杂，干扰大等问题。

氰化物的检测，一般都需要经过预处理，将氰根酸化为氢氰酸再进行检测，而结合态氰化物的预处理则更为复杂。目前一般的预处理设备经常存在转化率低，或氢氰酸损失，或操作繁琐等问题，使检测准确度低，不能很好的检测样品中实际含量。对于微量游离氰化物的测定，目前国内外以气相或液相色谱法较多，一般需要对游离氰化物先进行酸化和衍生化，再进行气相或液相色谱测定。而对于微量结合态氰化物目前尚没有直接测定的方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种检测游离态及结合态微量氰化物的方法，解决现有技术游离态及结合态氰化物测定方法检测限高，操作繁琐，检测灵敏度低易受干扰等问题。

一种检测游离态及结合态微量氰化物的方法，对游离态和结合态的氰化物采用不同的预处理方式；对游离态氰化物的预处理是在预处理及衍生化装置中直接将氰根酸化后进行衍生化反应；对结合态氰化物的预处理是在预处理及衍生化装置中先采用沸水浴加热蒸馏法分解释放出游离态氰化物后再衍生化反应；对衍生物进行检测，分别计算出游离态氰化物和总氰化物的含量，总氰化物含量减去游离态氰化物含量即为结合态氰化物含量。

所述预处理及衍生化装置包含样品反应瓶和衍生接收瓶，在样品反应瓶中进行酸解反应释放出游离态氰化物，通过导管将释放出的游离态氰化物导入到加有衍生剂的衍生接收瓶，在衍生接收瓶中进行衍生化反应。检测游离态及结合态氰化物的方法具体包含以下步骤：

(1)游离态及结合态氰化物样品的预处理及衍生化

a.游离态氰化物测定的样品预处理及衍生化步骤如下：准确称取适量液体样品或固体样品浸提液加入到预处理及衍生化装置的样品反应瓶，打开加酸口，迅速加入适量酸化试剂后立即关闭加酸口进行反应。打开可控开关通入氮气，反应过程中在通入氮气的条件下，将生成的氢氰酸转移到衍生接收瓶。衍生接受瓶预先加入一定量的衍生化试剂和内标溶液。反应结束后得到待测衍生物，用于液相或气相色谱分析。

b.结合态氰化物测定的样品预处理及衍生化步骤如下：准确称取适量液体样品或固体样品加入到预处理及衍生化装置的样品反应瓶，并加入一定比例的蒸馏水和抗干扰剂。对于含乙醇样品，先加入适量氢氧化钠溶液碱解10min。然后打开加酸口，迅速加入过量酸化试剂后立即关闭加酸口。样品反应瓶加热反应并蒸馏。冷凝连通管接通冷却水，将馏出液中生成的氢氰酸转移到衍生接收瓶。衍生接受瓶预先加入一定量的衍生化试剂和内标溶液。馏出液在衍生接收瓶收集并进行衍生化反应，反应结束后定容并得待测衍生物，用于液相或气相色谱分析。

(2)利用液质联用仪对氰化物衍生产物及内标13C15N-氰化物衍生物进行检测分析；

(3)使用LC-MS/MS-MRM方法制作氰化物标准曲线，并依据氰化物标准曲线采用内标法对样品中的游离态及结合态氰化物含量进行计算。分别计算出游离态氰化物和总氰化物的含量，总氰化物含量减去游离态氰化物含量即为结合态氰化物含量。

步骤(1)b中所述加入一定比例的蒸馏水，样品与蒸馏水的比例为1:(5-10)g/mL，浸泡时间为0-5h；所述酸化试剂为酒石酸，添加量为样品质量的10-20％；所述抗干扰剂为100g/L的乙酸锌溶液，添加量为样品：乙酸锌等于1:(1-3)g/mL；步骤(1)a中添加的酸化试剂为乳酸，反应时间为15-35min。

步骤(1)a和b中衍生剂为包括2.71mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二缩醛(NDA)溶液、50mmol/L的牛磺酸溶液、甲醛和氨水体积比为25：25：45：5的混合溶液；所述的内标溶液为浓度为1-5mg/L的13C15N-氰化物标准品溶液。

步骤(2)中液质联用，色谱条件为：色谱柱：Acquity UPLC C18，2.1×100mm，1.7μm；柱温40℃；进样量2μL；流速0.3mL/min；流动相：A为2mM乙酸铵，B为乙腈，梯度洗脱程序如下：

质谱条件为：电离方式ESI(-)；多重反应监测质谱模式；离子源温度为150℃；碰撞能量30eV；锥孔电压25V；毛细管压力2500V。

本发明的第二个目的是提供一种游离态及结合态微量氰化物测定的预处理及衍生化装置。

所述预处理及衍生化装置包含样品反应瓶和衍生接收瓶，在样品反应瓶中进行酸解反应释放出游离态氰化物，通过导管将释放出的游离态氰化物导入到加入衍生剂的衍生接收瓶，在衍生接收瓶中进行衍生化反应。

所述的氰化物测定的预处理及衍生化装置具体包括样品反应瓶(1)、衍生接收瓶(2)、样品反应瓶长导管(3)、样品反应瓶短导管(4)、衍生接收瓶长导管(5)、大气连通管(6)、冷凝连通管(7)、可控开关(8)、加酸口(9)瓶塞(10)、冷却水出口(11)和冷却水进口(12)；所述样品反应瓶长导管(3)一端伸入到样品反应瓶瓶底液面下方，一端与可控开关(8)连接；所述衍生接收瓶长导管(5)一端伸入到衍生接收瓶瓶底液面下方；所述大气连通管(6)一端伸入到衍生接收瓶内，一端暴露在瓶外；所述冷凝连通管(7)通过样品反应瓶短导管(4)和衍生接收瓶长导管(5)连通样品反应瓶和衍生接收瓶，将反应瓶产生的氢氰酸导入到衍生接收瓶；所述可控开关(8)连接通氮气。

本发明的第三个目的是提供一种结合态及游离态微量氰化物预处理及衍生化方法。

样品预处理及衍生步骤如下：

a.游离态氰化物测定的样品预处理及衍生化步骤如下：准确称取适量液体样品或固体样品浸提液加入到预处理及衍生化装置的样品反应瓶，打开加酸口，迅速加入适量酸化试剂后立即关闭加酸口进行反应。打开可控开关通入氮气，反应过程中在通入氮气的条件下，将生成的氢氰酸转移到衍生接收瓶。衍生接受瓶预先加入一定量的衍生化试剂和内标溶液。反应结束后得到待测衍生物，用于液相或气相色谱分析。

b.结合态氰化物测定的样品预处理及衍生化步骤如下：准确称取适量液体样品或固体样品加入到预处理及衍生化装置的样品反应瓶，并加入一定比例的蒸馏水和抗干扰剂。对于含乙醇样品，加入适量氢氧化钠溶液碱解10min。然后打开加酸口，迅速加入过量酸化试剂后立即关闭加酸口。样品反应瓶加热反应并蒸馏。冷凝连通管接通冷却水，将馏出液中生成的氢氰酸转移到衍生接收瓶。衍生接受瓶预先加入一定量的衍生化试剂和内标溶液。馏出液在衍生接收瓶收集并进行衍生化反应，反应结束后定容并得待测衍生物，用于液相或气相色谱分析。

所述预处理及衍生化装置包含样品反应瓶和衍生接收瓶，在样品反应瓶中进行酸解反应释放出游离态氰化物，通过导管将释放出的游离态氰化物导入到加入衍生剂的衍生接收瓶，在衍生接收瓶中进行衍生化反应。

步骤a中添加的酸化试剂为乳酸，反应时间为15-35min。

步骤a和b中衍生剂为包括2.71mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二缩醛(NDA)溶液、50mmol/L的牛磺酸溶液、甲醛和氨水体积比为25：25：45：5的混合溶液；所述的内标溶液为浓度为5mg/L的¹³C¹⁵N-氰化物标准品溶液。

步骤b中所述加入一定比例的蒸馏水，样品与蒸馏水的比例为1:(5-10)g/mL，浸泡时间为1-5h；所述酸化试剂为酒石酸，添加量为样品质量的10-20％；所述抗干扰剂为100g/L的乙酸锌溶液，添加量为样品：乙酸锌等于1:(1-3)g/mL；在本发明的一种实施方式中，步骤b中称取样品加入蒸馏水浸泡，样品与蒸馏水的比例为1:5g/mL，浸泡2h；所述加入酒石酸和乙酸锌，酒石酸的添加量为样品质量的10-20％，100g/L的乙酸锌溶液的添加量为样品：乙酸锌等于1:2g/mL；步骤a样品和乳酸的添加量的体积比为2：1，所述衍生化反应在室温下进行，时间为20min。

本发明的有益效果：

采用先酸化后衍生化的方式，排除饮料酒中其他成分的干扰，提高了氰化物的检测准确度。采用液相色谱-质谱联用技术对氰化物进行定性定量分析。本发明利用特制的预处理及衍生化装置，采用导管排气法收集反应得到的氢氰酸，整个装置气密性好，减小因氢氰酸的损失而导致的检测不准确性，可实现微量氰化物的检测。本发明建立的方法定量黄酒中氰化物的检测限可低至0.01μg/L，线性相关系数大于0.99，加标回收率为93.8％～106％，相对标准偏差小于10％。

本方法可直接测出样品中游离态氰化物，间接测出结合态氰化物的含量。利用预处理及衍生化装置，可根据情况分别对游离态和结合态氰化物进行预处理和衍生化，用于气相或液相色谱测定。该装置可分别满足结合态和游离态氰化物测定预处理的不同要求，准确检测结合态和游离态氰化物的各自含量。

本方法提供的氰化物测定的预处理及衍生化装置操作简便，安全，特别是将结合态氰化物测定较为复杂的预处理和衍生化过程合并在一套装置中，显著简化了操作，为准确测定样品氰化物含量奠定了基础。

附图说明

图1：预处理及衍生化装置图

图2：氰化物标准品及内标¹³C¹⁵N-氰化物液相色谱图

图3：氰化物标准品质谱图

图4：氰化物测定标准曲线

具体实施方式

试剂的配制与保存：

配制10g/L的氰化钾(KCN)储备液，4℃冰箱保存；配制5mg/L的氰化钾同位素(K¹³C¹⁵N)储备液，4℃冰箱保存；2.71mM的2,3-萘基二缩醛(NDA)：将100mgNDA溶于20mL甲醇中，并作10倍稀释，4℃下避光保存；50mM牛磺酸：取313mg牛磺酸用超纯水定容至50mL，4℃下保存。混合衍生剂，包括2,3-萘基二缩醛(NDA)，牛磺酸，甲醛，氨水，比例为25:25:45:5。

标准曲线的建立：

将10mg/L氰化钾标准品储备液稀释成一系列浓度的标准液，取上述溶液各2mL，加入反应装置样品反应瓶中，在衍生接收瓶中加入2ml衍生剂和20μL 5mg/L ¹³C¹⁵N-氰化物内标。向样品反应瓶中加入1mL乳酸开始反应，使其酸化产生氢氰酸，并转移至衍生接收瓶被衍生剂衍生吸收。在室温条件下反应20min，然后进行液质联用分析。将所测得的峰面积与同位素峰面积的比值作为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归分析，绘制标准曲线。

实施例1：黄酒中游离态和结合态氰化物的测定

(一)黄酒样品的预处理及衍生化：

a.游离态氰化物测定的样品预处理及衍生化：在预处理及衍生化装置的样品反应瓶中加入2mL的黄酒样品，添加1mL乳酸，将氰根酸化转化成为氢氰酸。在通入氮气的条件下，将氢氰酸转移到衍生接受瓶中。在衍生接受瓶中预先准确添加2mL衍生剂和10μL浓度为1mg/L内标¹³C¹⁵N-氰化物标准品溶液。衍生剂与氢氰酸发生衍生化反应，时间为20min，室温下进行。得到衍生后产物，进样检测游离氰化物含量。

b.结合态氰化物测定的样品预处理及衍生化：在预处理及衍生化装置的样品反应瓶中加入2mL的黄酒样品和0.5mL 2g/L的氢氧化钠，碱解10min后加入10ml饱和酒石酸溶液和2mL 100g/L的乙酸锌，进行沸水浴加热蒸馏，将馏出液用衍生接受瓶接收。在衍生接受瓶中预先准确添加2mL衍生剂和100μL浓度为5mg/L内标¹³C¹⁵N-氰化物标准品溶液。当馏出液在接近10mL时停止蒸馏。将馏出液定容，进样检测总氰化物含量。

(二)利用赛默飞TSQ Quantum Ultra EMR三重四极杆液质联用仪对氰化物衍生产物及内标¹³C¹⁵N-氰化物衍生物进行检测分析。

色谱条件：色谱柱：Acquity UPLC C18，2.1×100mm，1.7μm；柱温40℃；进样量2μL；流速0.3mL/min；流动相：A为2mM乙酸铵，B为乙腈，梯度洗脱程序如下：

质谱条件：电离方式ESI(-)；多重反应监测质谱模式；离子源温度为150℃；碰撞能量30eV；锥孔电压25V；毛细管压力2500V。

(三)建立LC-MS/MS-MRM方法，采用内标法通过氰化物标准曲线分别进行定量计算黄酒中游离态和总氰化物的含量，总氰化物减去游离态氰化物计算的得到结合态氰化物含量。结果如下表所示：

实施例2：水中总氰化物的测定

(一)样品的预处理及衍生化：

总氰化物测定的样品预处理及衍生化：在预处理及衍生化装置的样品反应瓶中加入2mL的水样品，加入约10mL蒸馏水，迅速加入1g酒石酸和2mL 100g/L的乙酸锌，进行沸水浴加热蒸馏，将馏出液用衍生接受瓶接收。在衍生接受瓶中预先准确添加2mL衍生剂和100μL浓度为5mg/L内标¹³C¹⁵N-氰化物标准品溶液。当馏出液在接近10mL时停止蒸馏。将馏出液定容，进样检测总氰化物含量。

(二)利用赛默飞TSQ Quantum Ultra EMR三重四极杆液质联用仪对氰化物衍生产物及内标¹³C¹⁵N-氰化物衍生物进行检测分析。

色谱条件：色谱柱：Acquity UPLC C18，2.1×100mm，1.7μm；柱温40℃；进样量2μL；流速0.3mL/min；流动相：A为2mM乙酸铵，B为乙腈，梯度洗脱程序如下：

质谱条件：电离方式ESI(-)；多重反应监测质谱模式；离子源温度为150℃；碰撞能量30eV；锥孔电压25V；毛细管压力2500V。

(三)建立LC-MS/MS-MRM方法，采用内标法通过氰化物标准曲线进行定量计算水中氰化物的含量，测得总氰化物的含量为7.49μg/L。

实施例3：氰化物检测方法的评价

(1)重复性——精密度试验

将浓度为10μg/L的标准溶液6份，分别进行检测，最终结果如表1所示。试验结果表明，本方法具有良好的重现性。

表1精密度

(2)回收率——准确度试验

取游离态氰化物浓度为4.71μg/L的黄酒样品6份，分别准确加入浓度为2.5、10μg/L的标准品，按照上述步骤进行测定。回收率分别为93.8％、106％。详情见表2。

表2.回收率

(3)检测限和定量限

当进样量为2μL，S/N＝3时，氰化物测定的LOD为0.01μg/L；当进样量为2μL，S/N＝10时，LOQ为0.05μg/L。

实施例4：黄酒原料中游离态和结合态氰化物的测定

(一)黄酒原料样品的预处理及衍生化：

a.游离态氰化物测定的样品预处理及衍生化：在预处理及衍生化装置的样品反应瓶中准确加入1g的原料样品,加入约5mL蒸馏水浸泡2h，添加2.5mL乳酸，将氰根酸化转化成为氢氰酸。在通入氮气的条件下，将氢氰酸转移到衍生接受瓶中。在衍生接受瓶中预先添加2mL衍生剂和10μL浓度为1mg/L内标¹³C¹⁵N-氰化物标准品溶液。衍生剂与氢氰酸发生衍生化反应，时间为20min，室温下进行。得到衍生后产物，进样检测游离氰化物含量。

b.结合态氰化物测定的样品预处理及衍生化：在预处理及衍生化装置的样品反应瓶中准确加入1g的原料样品,加入约10mL蒸馏水浸泡2h，迅速加入1g酒石酸和2mL 100g/L的乙酸锌，进行沸水浴加热蒸馏，将馏出液用2mL衍生剂接收。在衍生接受瓶中预先添加2mL衍生剂和100μL浓度为5mg/L内标¹³C¹⁵N-氰化物标准品溶液。当馏出液在接近10mL时停止蒸馏。将馏出液定容，定容后内标¹³C¹⁵N-氰化物的终浓度为50μg/L，进样检测总氰化物含量。

(二)利用赛默飞TSQ Quantum Ultra EMR三重四极杆液质联用仪对氰化物衍生产物及内标¹³C¹⁵N-氰化物衍生物进行检测分析。

色谱条件：色谱柱：Acquity UPLC C18，2.1×100mm，1.7μm；柱温40℃；进样量2μL；流速0.3mL/min；流动相：A为2mM乙酸铵，B为乙腈，梯度洗脱程序如下：

质谱条件：电离方式ESI(-)；多重反应监测质谱模式；离子源温度为150℃；碰撞能量30eV；锥孔电压25V；毛细管压力2500V。

(三)建立LC-MS/MS-MRM方法，采用内标法通过氰化物标准曲线分别进行定量计算黄酒中游离态和总氰化物的含量，总氰化物减去游离态氰化物计算的得到结合态氰化物含量。结果如下表所示：

以上较佳实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。