一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用，在该牛血清白蛋白检测探针的制备方法中，先采用廉价的氨水溶液和过氧化氢溶液使玻璃毛细管(GC)表面的羟基处于活化状态，随后利用3‑氨基丙基三乙氧基硅烷在活化后的GC表面修饰上氨基，得到NH

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，具体而言，涉及一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用。

背景技术

在培养细胞生产疫苗的过程中，牛血清是培养基的主要成分。由于牛血清中常常含有牛血清白蛋白，因此对疫苗中残留的牛血清白蛋白(BSA)的检测是非常重要的，它直接关系到生物制品使用的安全性。但目前的检测方法都需要高昂的仪器，同时检测步骤繁琐、费时、检测条件苛刻，且检测时所使用试剂的毒性较大。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针，这种检测探针结构稳定、容易保藏。采用这种牛血清白蛋白检测探针检测BSA时，操作简单、检测迅速且灵敏度高，能够对样品中很微量的BSA进行有效检测，且这种牛血清白蛋白检测探针利用了玻璃毛细管的虹吸作用，能够对微量的牛血清白蛋白实现快速的可视化分析。

本发明的第二目的在于提供一种所述的牛血清白蛋白检测探针的制备方法，这种制备方法步骤简单、反应条件温和、容易实现，适合工业大生产。

本发明的第三目的在于提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针的应用，即用该牛血清白蛋白检测探针来检测待测样品中牛血清白蛋白的含量。检测BSA时操作简单、检测迅速且灵敏度高，能够对样品中很微量的BSA进行有效检测。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种基于玻璃毛细管(glass capillary，GC)的牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其包括：

活化步骤：将玻璃毛细管与氨水溶液混合，并于65-90℃下浸泡7-15min,随后将玻璃毛细管取出后再与过氧化氢溶液混合，并于65-90℃下浸泡7-15min，然后再用有机溶剂洗涤玻璃毛细管，得到活化后的玻璃毛细管(OH-GC)；

修饰步骤：以甲苯为溶剂配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液与活化后的玻璃毛细管混合，并于20-30℃下搅拌18-24h，然后再用有机溶剂洗涤玻璃毛细管，得到氨基修饰的玻璃毛细管(NH₂-GC)；

键合步骤：将牛血清白蛋白与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合，于20-30℃下搅拌1-3h；随后与氨基修饰的玻璃毛细管混合，于20-30℃下搅拌4-6h，洗涤，得到牛血清白蛋白检测探针(BSA-GC)。

一种根据上述制备方法制得的基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针。

一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针的应用，其包括：

步骤a：用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗牛血清白蛋白(aBSA)，得到辣根过氧化物酶标记的抗体(HRP-aBSA)；

步骤b：将待测样品与辣根过氧化物酶标记的抗体混合，震荡反应4-8min；随后，再与牛血清白蛋白检测探针混合，震荡反应4-8min，洗涤，得到结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针(HRP-aBSA-BSA-GC)；

步骤c：在结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针中加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，静置12-18min进行显色，随后加入H₂SO₄终止显色，于445-455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

在该牛血清白蛋白检测探针的制备方法中，先采用廉价的氨水溶液和过氧化氢溶液使GC表面的羟基处于活化状态，随后利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在活化后的GC表面修饰上氨基，得到NH₂-GC；再然后将BSA键合到NH₂-GC上，得到BSA-GC。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。

用牛血清白蛋白检测探针来检测样品中的BSA的原理是：

在待测样品中加入相对BSA过量的HRP-aBSA后，一部分的HRP-aBSA与待测样品中的BSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA复合物，另一部分的HRP-aBSA游离在待测样品液中；随后，在待测样品中加入BSA-GC，BSA-GC与待测样品液中游离的那部分HRP-aBSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA-GC复合物；洗涤后，在所得到的HRP-aBSA-BSA-GC复合物中加入TMB。TMB为HRP的底物，在与HRP-aBSA-BSA-GC复合物作用后形成的产物呈蓝色，随后用H₂SO₄终止反应后，TMB的产物由蓝色变为黄色。采用比色法测反应液在445-455nm处的吸光度，将其数值带入由系列标准BSA溶液采用同样检测方法所得的标准曲线中，即可得出待测样品中BSA的含量。

上述标准曲线为反比例曲线，即当待测样品中的BSA浓度越低，游离的HRP-aBSA的量就越多，用比色法所测得的吸光度值也就越高，由此可见，该吸光度值与待测样品中的BSA浓度呈反比。

该检测方法利用了抗原(即BSA)与抗体(即aBSA)的特异性结合反应，特异性强；同时利用HRP来标记抗体，实现特异性的可视化检测，灵敏度高；且在一定的范围内，对待测样品中是否含有BSA能够实现快速的肉眼可见的可视化分析。

该牛血清白蛋白检测探针的稳定性强，在利用该牛血清白蛋白检测探针检测待测样品中的BSA时，操作过程简单、迅速，所需要的仪器设备仅为紫外分光光度计，检测成本低，简单易行。该方法的适用广泛、实用性强，可快速检测疫苗等生物样品中BSA的含量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为BSA-GC的合成路线图；

图2为利用BSA-GC检测待测样品的BSA的步骤图；

图3为实验例1中的线性拟合标准曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供了一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其包括：

(1)活化步骤：将GC与氨水溶液混合，并于65-90℃下浸泡7-15min,随后将玻璃毛细管取出后再与过氧化氢溶液混合，并于65-90℃下浸泡7-15min，然后再用有机溶剂洗涤玻璃毛细管，得到OH-GC；

普通的GC表面覆盖有有机物和金属离子，如果这些成分不除去，GC表面的羟基则处于钝化状态，难以进一步进行后续的反应。因此，采用氨水和过氧化氢对GC进行浸泡处理，能够使GC表面的羟基处于活化状态，有利于后续的修饰步骤顺利进行。

发明人经过多次试验探索，得出上述浸泡的条件为：65-90℃下浸泡7-15min。在这种条件下，GC表面的羟基的活化效率高，其中，活化效率以75℃下浸泡10min最佳。

在本发明较佳的实施例中，上述氨水溶液中氨水与水的体积比为1：3-5。此处，氨水为NH₃·H₂O的质量分数为26％的市售分析级氨水。采用氨水与水的体积比为1：3-5的氨水溶液，优选为1：4，能够快速除去GC表面的有机物和金属离子，为GC表面羟基的活化扫清障碍。

在本发明较佳的实施例中，上述过氧化氢溶液中过氧化氢与水的体积比为1：1-3。此处，过氧化氢为H₂O₂的质量分数为30％的市售分析级过氧化氢。采用过氧化氢与水的体积比为1：1-3的过氧化氢溶液，优选为1：2，有利于GC表面的OH快速活化，且使得活化更加完全。

(2)修饰步骤：以甲苯为溶剂配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液与OH-GC混合，并于20-30℃下搅拌18-24h，然后再用有机溶剂洗涤玻璃毛细管，得到NH₂-GC；

使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷与OH-GC反应，在GC-OH中的-OH上通过化学反应共价键合上NH₂，得到NH₂-GC，便于后期键合BSA。为了使反应进行的更加充分，采用甲苯为溶剂，有利于反应的顺利进行。

在本发明较佳的实施例中，为了在OH-GC表面键合较多数量的氨基，上述3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTEMS)的质量分数为1-5％，优选为3％。GC表面键合的氨基的数量越多，GC表面最终键合的BSA的量就会越多，能够大幅提高检测的灵敏度。

在本发明较佳的实施例中，上述有机溶剂选自丙酮、四氢呋喃和甲苯中的一种或多种。采用有机溶剂洗涤，有利于除去玻璃表面的其它杂质，使GC露出疏水表面，方便下一步键合氨基。进一步优选的，在活化步骤和修饰的步骤中，上述洗涤的过程为将玻璃毛细管依次用丙酮、四氢呋喃、以及甲苯各洗涤2-5次。在本发明中，洗涤是指GC的内表面和外表面均被清洗的过程，采用浸泡的方法清洗GC的外表面，利用GC的毛细管现象将溶剂吸到GC的管腔中，来实现对GC的内表面的清洗。采用这种洗涤方式，洗涤效果好，有利于GC-OH与APTEMS的顺利反应。

(3)键合步骤：将牛血清白蛋白与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺混合(NHS)，于20-30℃下搅拌1-3h；随后与NH₂-GC混合，于20-30℃下搅拌4-6h，洗涤，得到BSA-GC。

EDC和NHS均为羧基活化试剂，将BSA与EDC和NHS混合，使BSA中的羧基活化，进一步与NH₂-GC中的氨基发生缩合反应，得到BSA-NH₂-GC复合物，即为牛血清白蛋白检测探针，简称BSA-GC。

为了使BSA中的羧基完全活化，提高BSA与NH₂-GC的键合速率，在本发明较佳的实施例中，上述EDC与BSA的质量比为1：8-12。优选为，EDC与BSA的质量比为1：10。进一步的，上述NHS与BSA的质量比为1：8-12。优选为，NHS与BSA的质量比为1：10。

为了避免在BSA-GC表面的BSA结构被有机溶剂破坏，在键合步骤中洗涤的溶剂为乙醇和/或水。优选的洗涤方法为，采用乙醇和水交替洗涤，每种溶剂洗涤3次。采用这种洗涤方法，能够相对彻底的洗去物理附着在BSA-GC表面的BSA，从而提高该探针在应用时的灵敏度和准确度。

本实施方式还提供一种由上述制备方法制得的基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针。这种探针利用了玻璃毛细管的虹吸原理，在一定浓度范围内能够对牛血清白蛋白实现可视化分析；且这种探针是基于抗原与抗体的特异性结合作用，特异性好，检测结果准确。

本实施方式还提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针的应用，其包括：

步骤a：用HRP标记aBSA，得到HRP-aBSA。

HRP能够将其底物TMB水解成有颜色的产物，用HRP标记aBSA，便于采用比色法检测aBSA，进而对待测样品中微量的BSA进行分析。

步骤b：将待测样品与HRP-aBSA混合，震荡反应4-8min；随后，再与BSA-GC混合，震荡反应4-8min，洗涤，得到HRP-aBSA-BSA-GC。

aBSA与BSA之间的键合，是基于抗原与抗体之间的特异性反应，反应速度快、特异性强。因此，得到的HRP-aBSA-BSA-GC复合物中，各个基团之间都是通过共价键连接的，结构稳定。

在本发明较佳的实施例中，上述方法中，震荡反应应理解为：反应容器位于震荡反应器上，反应时的震荡反应器的转速为500-1500rpm。

步骤c：在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，静置12-18min进行显色，随后加入H₂SO₄终止显色，于445-455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。

在本发明较佳的实施例中，上述步骤c为在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，静置15min进行显色，随后加入H₂SO₄终止显色，于450nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。

用牛血清白蛋白检测探针来检测样品中的BSA的原理是：

在待测样品中加入相对BSA过量的HRP-aBSA后，一部分的HRP-aBSA与待测样品中的BSA进行特异性结合，另一部分的HRP-aBSA游离在待测样品液中；随后，在待测样品中加入BSA-GC，BSA-GC与待测样品液中游离的那部分HRP-aBSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA-GC复合物；洗涤后，在所得到的HRP-aBSA-BSA-GC复合物中加入TMB。TMB为HRP的底物，在与HRP-aBSA-BSA-GC复合物作用后形成的产物呈蓝色，随后用H₂SO₄终止反应后，TMB的产物由蓝色变为黄色。采用比色法测反应液在445-455nm处的吸光度，将其数值带入由系列标准BSA溶液采用同样检测方法所得的标准曲线中，即可得出待测样品中BSA的含量。

上述标准曲线为反比例曲线，即当待测样品中的BSA浓度越低，游离的HRP-aBSA的量就越多，用比色法所测得的吸光度值也就越高，由此可见，该吸光度值与待测样品中的BSA浓度呈反比。

进一步的，所检测的待测样品为疫苗。在培养细胞生产疫苗的过程中，牛血清是培养基的主要成分，因此生产得到的疫苗中极易含有残留的BSA。若BSA的含量超标，则说明疫苗的质量不合格，残留的BSA直接关系到疫苗使用的安全性。采用本发明提供的这种探针能够快速、有效的检测出疫苗中的BSA含量是否超标，从而有效的控制疫苗质量。

实施例1

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针，这种牛血清白蛋白检测探针的合成路线如图1所示，其制备方法如下：

(1)活化步骤：将GC与氨水溶液混合，并于65℃下浸泡15min,随后将GC取出后再与过氧化氢溶液混合，并于65℃下浸泡15min，然后再用丙酮洗涤GC，得到OH-GC；

(2)修饰步骤：以甲苯为溶剂配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液与OH-GC混合，并于30℃下搅拌18h，然后再用四氢呋喃洗涤GC，得到NH₂-GC；

(3)键合步骤：将BSA与EDC和NHS混合，于20℃下搅拌1h；随后与NH₂-GC混合，于30℃下搅拌4h，洗涤，得到BSA-GC。

实施例2

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针，这种牛血清白蛋白检测探针的制备方法为：

(1)活化步骤：将GC与氨水溶液混合，并于75℃下浸泡10min,随后将GC取出后再与过氧化氢溶液混合，并于75℃下浸泡10min，然后再用丙酮和四氢呋喃依次洗涤GC，得到OH-GC；

(2)修饰步骤：以甲苯为溶剂配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液与OH-GC混合，并于25℃下搅拌20h，然后再用丙酮、四氢呋喃和甲苯依次洗涤GC，得到NH₂-GC；

(3)键合步骤：将BSA与EDC和NHS混合，于25℃下搅拌2h；随后与NH₂-GC混合，于25℃下搅拌5h，洗涤，得到BSA-GC。

实施例3

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针，这种牛血清白蛋白检测探针的制备方法为：

(1)活化步骤：将GC与氨水溶液混合，并于90℃下浸泡7min,随后将GC取出后再与过氧化氢溶液混合，并于90℃下浸泡7min，然后再用四氢呋喃洗涤GC，得到OH-GC；

(2)修饰步骤：以甲苯为溶剂配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液与OH-GC混合，并于20℃下搅拌24h，然后再用四氢呋喃和甲苯依次洗涤GC，得到NH₂-GC；

(3)键合步骤：将BSA与EDC和NHS混合，于20℃下搅拌3h；随后与NH₂-GC混合，于20℃下搅拌6h，洗涤，得到BSA-GC。

实施例4

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针，其制备方法与实施例2基本一致，不同之处在于：

(1)活化步骤：将GC与氨水溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中氨水溶液中氨水与水的体积比为1：3；随后将GC取出后再与过氧化氢溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中过氧化氢溶液中过氧化氢与水的体积比为1：3；然后将GC依次用丙酮、四氢呋喃、以及甲苯各洗涤2次，得到OH-GC；

(2)修饰步骤：以甲苯为溶剂配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量分数为1％。随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液与OH-GC混合，并于25℃下搅拌20h，然后然后将GC依次用丙酮、四氢呋喃、以及甲苯各洗涤5次，得到NH₂-GC。

实施例5

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针，其制备方法与实施例2基本一致，不同之处在于：

(1)活化步骤：将GC与氨水溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中氨水溶液中氨水与水的体积比为1：4；随后将GC取出后再与过氧化氢溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中过氧化氢溶液中过氧化氢与水的体积比为1：2；然后将GC依次用丙酮、四氢呋喃、以及甲苯各洗涤3次，得到OH-GC；

(2)修饰步骤：以甲苯为溶剂配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量分数为3％。随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液与OH-GC混合，并于25℃下搅拌20h，然后然后将GC依次用丙酮、四氢呋喃、以及甲苯各洗涤4次，得到NH₂-GC。

实施例6

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针，其制备方法与实施例2基本一致，不同之处在于：

(1)活化步骤：将GC与氨水溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中氨水溶液中氨水与水的体积比为1：5；随后将GC取出后再与过氧化氢溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中过氧化氢溶液中过氧化氢与水的体积比为1：1；然后将GC依次用丙酮、四氢呋喃、以及甲苯各洗涤5次，得到OH-GC；

(2)修饰步骤：以甲苯为溶剂配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量分数为5％。随后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液与OH-GC混合，并于25℃下搅拌20h，然后然后将GC依次用丙酮、四氢呋喃、以及甲苯各洗涤2次，得到NH₂-GC。

实施例7

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针的应用，即将上述实施例1-6制备的BSA-GC应用于检测待测样品中的BSA，其包括下述：

步骤a：用HRP标记羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；

步骤b：将待测样品与HRP-aBSA混合，震荡反应4min；随后，再与BSA-GC混合，震荡反应4min，洗涤，得到HRP-aBSA-BSA-GC；

步骤c：在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，静置18min进行显色，随后加入H₂SO₄终止显色，于445nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中BSA的含量。

实施例8

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针的应用，即将上述实施例1-6制备的BSA-GC应用于检测待测样品中的BSA，其包括下述：

步骤a：用HRP标记羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；

步骤b：将待测样品与HRP-aBSA混合，震荡反应6min；随后，再与BSA-GC混合，震荡反应6min，洗涤，得到HRP-aBSA-BSA-GC；

步骤c：在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，静置15min进行显色，随后加入H₂SO₄终止显色，于450nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中BSA的含量。

实施例9

本实施例提供一种基于玻璃毛细管的牛血清白蛋白检测探针的应用，即将上述实施例1-6制备的BSA-GC应用于检测待测样品中的BSA，其包括下述：

步骤a：用HRP标记羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；

步骤b：将待测样品与HRP-aBSA混合，震荡反应8min；随后，再与BSA-GC混合，震荡反应8min，洗涤，得到HRP-aBSA-BSA-GC；

步骤c：在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，静置12min进行显色，随后加入H₂SO₄终止显色，于455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中BSA的含量。

实验例1

本实验例用上述制备的牛血清白蛋白检测探针来对狂犬疫苗中BSA含量进行检测。

一.HRP-aBSA的制备：

(1)取HRP 10mg溶于1mL 1.25％戊二醛溶液中，在室温下静置过夜。随后将反应后的酶液过Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱，收集棕色液体并浓缩至1mL。

(2)将0.5mL 10mg/mL的aBSA与0.5mL生理盐水混合，并加入0.1mL、1M的碳酸盐缓冲溶液(pH9.5)，混匀。随后逐滴加入上述收集的棕色液体，于室温下搅拌3h。

(3)将0.1mL、0.2M的赖氨酸加入上述溶液中，室温下放置3h。随后加入等体积的饱和硫酸铵，40℃下静置1h。随后，于3000rpm下离心30min，弃去上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤两次，最后溶于2mL、0.01M的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中。

(4)将上述溶液装入透析膜中，0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中透析24h，浓缩至2mL，即得HRP-aBSA。

二、检测狂犬疫苗中BSA的含量：

如图2所述，检测步骤包括：

(1)配制下列浓度的BSA的标准溶液：10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、70ng/mL、90ng/mL。本实验中的待测样品为四种购自勃林格殷格翰集团的狂犬疫苗。共有10个实验组，其中四组为狂犬疫苗；6组为BSA标准溶液，同时进行下述平行实验。

(2)取2mL的样品溶液，向其中加入1mL的HRP-aBSA，此HRP-aBSA是由上述制得的HRP-aBSA稀释1000倍而得，再混匀，振荡5min，使样品中的BSA充分与HRP-aBSA结合。

(3)将实施例3制得的BSA-GC分散于上述溶液中，振摇5min，使溶液中游离的HRP-aBSA充分结合到BSA-GC纳米粒子上。

(4)将所得到的HRP-aBSA-BSA-GC复合物与溶液分离，并洗涤。随后加入2mL TMB溶液静置15min显色，溶液呈蓝色，然后加入2mL的1.25mol/L的H2SO4终止显色，溶液呈黄色。然后将上述液体采用比色法进行分析，测量其在450nm处的吸光度。

(5)由BSA的标准溶液(10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、70ng/mL、90ng/mL)测得的吸光度值与其BSA浓度做线性模拟，得到标准曲线；再将由四种狂犬疫苗所测得的吸光度值代入标准曲线，即可得出每种狂犬疫苗中BSA的含量。

结果分析：

由BSA的标准溶液测得的吸光度值与其BSA浓度做线性拟合，得到标准曲线：Y＝-0.007X+0.812(r²＝0.999)，如图3所示。

将四种狂犬疫苗的实验组在450nm处测得的吸光度值代入标准曲线的方程式：Y＝-0.007X+0.812(r²＝0.999)中，即可测出狂犬疫苗中BSA的含量，结果如表1所示，采用其它实施例的探针的检测结果与实施例3一致，故没有逐一列出。

表1.狂犬疫苗中BSA含量的检测

由表1可知，这四种狂犬疫苗中的BSA的浓度均小于15ng/mL。WHO规定的疫苗中的BSA的含量不超过50ng/mL。由此可知，这四种狂犬疫苗中的BSA均符合WHO的标准，由此说明该方法能够快速有效的对疫苗中BSA的含量进行检测。

实验例2

本实验例采用加样回收法，来测试采用本发明提供的牛血清白蛋白检测探针来检测BSA的这种检测方法的准确度。

本实验例中采用的牛血清白蛋白检测探针及其检测方法与实验例1一致。待测样品为狂犬疫苗加样溶液，即在狂犬疫苗中添加不同浓度的BSA蛋白(分别为6.5ng/mL、8.1ng/mL、97ng/mL)。然后按实施例1中的步骤进行分析，结果如表2所示：

表2加样回收法检测结果

表2中，疫苗中原有的BSA，为采用实验例1的方法重复检测三次的结果。

回收率＝检测到的BSA/(疫苗中原有的BSA+添加的BSA)×100％

由表2可以看出，采用该方法检测BSA的回收率均大于94％，说明该检测方法的准确度高，能够对样品中的BSA进行准确的测定。

实验例3

本实验例通过配制一系列不同浓度的BSA的待测溶液，其中BSA的浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、0.75ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL。采用实验例1中的方法对各待测溶液中的BSA的浓度进行测量，确定本发明提供的牛血清白蛋白检测探针来检测BSA的这种检测方法的最低检测限，并与文献中记载的现有技术的最低检测限进行比较，如表3所示：

表3本发明检测BSA的方法与现有技术的比较

由表3可知，相比于现有技术中BSA的检测方法，本发明提供的方法的检测限低、操作简单、特异性高，且所使用的材料容易合成、检测成本低廉。

综上所述，在该牛血清白蛋白检测探针的制备方法中，先采用廉价的氨水溶液和过氧化氢溶液使GC表面的羟基处于活化状态，随后利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在活化后的GC表面修饰上氨基，得到NH₂-GC；再然后将BSA键合到NH₂-GC上，得到BSA-GC。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。

该检测方法利用了抗原(即BSA)与抗体(即aBSA)的特异性结合反应，特异性强，同时利用HRP来标记抗体，实现特异性的可视化检测，特异性强，灵敏度高。由于牛血清白蛋白检测探针为白色的，在一定的范围内，对待测样品中是否含有BSA能够实现快速的肉眼可见的可视化分析。

该牛血清白蛋白检测探针的稳定性强，在利用该牛血清白蛋白检测探针检测待测样品中的BSA时，操作过程简单、迅速，所需要的仪器设备仅为紫外分光光度计，检测成本低，简单易行。该方法的适用广泛、使用性强，可快速检测疫苗等生物样品中BSA的含量。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。