一种HPLC手性固定相及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种HPLC手性固定相及其制备方法和应用，以单分散性良好的二氧化硅微球为原料，感光高分子重氮树脂为表面改性剂，将β‑环糊精/聚丙烯酸复合物接到二氧化硅微球表面，然后借助紫外光，将重氮树脂与硅羟基之间的氢键、重氮树脂与β‑环糊精/聚丙烯酸复合物之间的氢键转化为共价键，从而使β‑环糊精稳定的接到微球表面。本发明采用的感光高分子重氮树脂，与传统硅烷偶联剂相比，具有无毒害，易合成，环境友好性等特点，制得的经修饰的硅球手性固定相在高效液相色谱中对多种手性药物对应体实现了基线分离，展现出优异手性拆分能力，可应用于多种手性色谱柱填料领域。

说明书

技术领域

本发明属于色谱分离技术领域，具体涉及一种利用感光高分子聚合物重氮树脂在二氧化硅微球表面修饰环糊精进行改性的HPLC手性固定相及其制备方法和应用。

背景技术

随着社会的进步与发展，人们逐渐认识到手性药物与生活息息相关，而手性药物在医药市场的份额也逐年攀升。随着人们对手性药物需求的急剧增加，建立快速的手性分离方法，对药代动力学研究和手性药物产品质量控制都具有十分重要的意义。目前，色谱法已成为光学拆分最有用的方法。这些方法包括气相色谱法，薄层色谱法，超临界流体色谱法，毛细管电泳，逆流色谱，离心分配色谱法，高效液相色谱法(HPLC)。高效液相色谱凭借着其高效、高灵敏度、分析速度快、运用范围广等优势成为手性分离领域一项重要技术。

液相色谱法手性拆分依据其原理可分为手性衍生法、手性流动相法和手性固定相法。手性固定相法是基于样品与固定相表面的手性选择剂形成暂时的非对映体配合物的能量差异或稳定性不同而达到手性分离，是不经过转变成非对映体的直接拆分的方法。手性固定相拆分法的优点是制备方便，能适用于各类化合物的拆分。手性固定相法是目前最具优势的光学异构体拆分方法。

在手性色谱分离中，一种理想的手性固定相应具备以下优点：分离范围广，适应多种结构类型的对映体分离；分析速度快，分离速率高，能快速、准确测定对映体的纯度；分离具有特定性；分离选择性和柱容量较高，具有制备分离能力。在过去的几年中，大量的手性固定相得到了开发与应用，已合成的商品手性固定相多达上百种，但迄今为止，还没有一种手性固定相能同时满足上述各方面的要求。

β环糊精(Cyclodextrins，βCD)是由一定数量的葡萄糖单元通过α-1，4-糖苷键连接而成的环状分子。分子整体上具有环内疏水和环外亲水的特性和较强的手性识别能力而在手性药物的分离中占有比较重要的地位。Armstrong等率先通过烷基化、酰基化和氨基甲酸酯化，增加了新的手性识别位点，使环糊精类固定相的手性色谱性能有较大的提高。而用不同的衍生化试剂对βCD的羟基进行修饰，可以提高键合相与手性分子之间的作用力，扩大应用范围。环糊精类色谱固定相一般是将βCD或其衍生物键合到硅胶基质上，硅胶先经过硅烷化试剂预处理，常用的硅烷化试剂有γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)、y-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH570)。βCD经过修饰后，常连有氨基、羟基、烯基或环氧基官能团，可与硅烷化硅胶键合；也有采用硅烷化试剂将βCD衍生化，再在无水条件下与硅胶的硅羟基反应，即将βCD连接到硅胶基质上。

CN103601823A公开了一种β开环糊精手性固定相的制备方法，以SiO₂微球为原料，通过γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)，三甲基氯硅烷，4,4’-二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)，将β-环糊精键合到SiO₂微球表面，得到一种β-环糊精手性固定相。CN104841408A公开了一种环糊精手性固定相及其制备方法与应用，通过点击反应制备巯基-乙烯基键合环糊精手性固定相手性色谱填料，通过对环糊精6位的选择性改性和硅胶的巯基化处理，利用高效催化剂通过点击反应进而制备化学稳定性优异的巯基-乙烯基键合的环糊精手性固定相。以上两种方法在制备环糊精手性固定相时均使用了硅烷偶联剂，而改性过程中常用的硅烷偶联剂往往具有一定的毒性并且对水敏感，需要控制在无水条件下使用，相对苛刻，而且过程繁琐，耗时较长；另外，这些因素会引起环境污染等问题，大大限制了其应用。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有HPLC手性固定相制备方法复杂耗时且环境不友好，进而提供一种新型HPLC手性固定相的制备方法，该制备方法利用无毒的感光高分子重氮树脂取代硅烷偶联剂，先将βCD接枝到聚丙烯酸(PAA)链上以增加其水溶性，然后将βCD修饰到二氧化硅上，从而在微球表面引入手性识别基团，反应条件温和，时间短，易操作，且改性后的色谱柱填料具有良好的手性分离效果。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种HPLC手性固定相的制备方法，包括下述步骤：

S1、将二氧化硅微球均匀分散于重氮树脂溶液中，室温下避光搅拌2-4小时，离心分离后用水洗涤微球；

S2、将步骤S1的产物置于β-环糊精/聚丙烯酸复合物溶液中，室温下避光搅拌2-4小时，离心分离后用水洗涤微球；

S3、将步骤S2的微球干燥后置于紫外光下曝光处理10-20min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球。

所述制备方法还包括：

S0、将二氧化硅微球均匀地分散在浓度为0.08-0.12mol/L的盐酸溶液中进行活化处理15-45min，离心分离后用水洗涤微球至中性。

所述二氧化硅微球为平均粒径1-3μm的单分散性微球。

所述步骤S1中重氮树脂溶液为8-12mg/mL的重氮树脂水溶液，所述步骤S2中β-环糊精/聚丙烯酸复合物溶液为8-12mg/mL的β-环糊精/聚丙烯酸复合物水溶液。所述步骤S0、S1、S2中用水洗涤微球是用去离子水洗涤微球2-4次。所述步骤S3中微球干燥是将微球放入真空箱中进行室温干燥12-14小时。

一种所述方法制备得到的HPLC手性固定相。

所述的HPLC手性固定相在分离手性物质中的应用，包括下述步骤：

将HPLC手性固定相用装柱机填注到不锈钢色谱柱中，在柱温为20～30℃、流速为0.2mL/min条件下，对手性物质样品进行高效液相色谱分离。

所述的手性物质样品为酒石酸美托洛尔、异丙嗪、二氧丙嗪或扑尔敏。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明提供的HPLC手性固定相制备方法为利用感光高分子重氮树脂将βCD接到SiO₂微球表面。光照后，重氮树脂与硅羟基之间的氢键作用、重氮树脂与环糊精表面羟基之间的氢键作用转化为共价键作用，从而使βCD稳定的接到微球表面，得到βCD-PAA@SiO₂微球。βCD-PAA@SiO₂微球用作液相色谱柱填料，对手性药物有较强的拆分能力。此制备方法简便且效率高，改性后的色谱柱填料具有良好的分离效果。

(2)本发明的原料二氧化硅微球采用盐酸进行活化处理，活化的目的在于提高二氧化硅微球表面的硅羟基含量，使其稳定均匀存在，提高后续修饰的改性率。

(3)采用本发明的方法，工艺设备简单，重复性好，所用原料易得，生产成本低且效率高；此外，本发明采用的感光高分子重氮树脂，与传统硅烷偶联剂相比，具有无毒害，易合成，环境友好性等特点。

(4)通过本发明方法改性的单分散二氧化硅微球，作为高效液相色谱柱填料，在不同流动相模式下对多种手性药物对映体实现了基线分离，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1所用的单分散二氧化硅微球的扫描电镜图片；

图2为实施例1所得的改性与未改性的二氧化硅微球的傅立叶变换红外光谱分析曲线图片；

图3为应用例1所得的高效液相色谱的分离谱图；

图4为应用例2所得的高效液相色谱的分离谱图；

图5为应用例3所得的高效液相色谱的分离谱图；

图6为应用例4所得的高效液相色谱的分离谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。

扫描电镜照片由JEOLJSM-6390LV型扫描电镜测得。

傅立叶变换红外光谱分析图片由Nicolet6700型红外光谱仪测得。

高效液相色谱图由青岛七彩虹SEV P500型液相色谱仪测得。

实施例1-4中使用的重氮树脂具有式(1)所示结构：

其中n为3-6的整数。

实施例1-4中使用的β-环糊精/聚丙烯酸复合物βCD-PAA具有式(2)所示结构：

式(2)中黑色铃铛状物即为β环糊精。

所选βCD-PAA复合物，其制备过程如下：将0.5g氨基化β基环糊精，0.2g二环己基碳二亚胺，1.4gPAA加入40mL1-甲基-2-吡咯烷酮，60℃反应12h，将产物过滤并用甲醇洗涤三遍即可。

实施例1

本实施例的HPLC手性固定相的制备方法，包括下述步骤：

S0、二氧化硅微球的活化处理：

将2g平均粒径为2μm的单分散二氧化硅微球均匀地分散在浓度为0.1mol/L的盐酸水溶液中处理30min，离心分离并将二氧化硅微球用去离子水洗涤至中性；

S1、对活化处理后的二氧化硅微球进行改性：

将活化后的二氧化硅微球置于浓度为10mg/mL的重氮树脂水溶液中，室温下避光、磁力搅拌3小时，离心分离后将微球用去离子水洗涤3次；

S2、将步骤S1得到的微球置于浓度为10mg/mL的βCD-PAA水溶液中，室温下避光、磁力搅拌3小时，离心分离后将微球用去离子水洗涤3次。

S3、将步骤S2得到的微球放于真空干燥箱中室温干燥12h，将干燥后的微球置于紫外光下曝光处理15min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂。本实施例的重氮树脂为式(1)所示结构，其中n＝4。

发明人采用扫描电子显微镜对所选的二氧化硅微球原料进行了微观形貌分析，如图1所示，从图中可以看出，微球单分散性好，粒径均一，微球的粒径约为2μm；另外，采用傅里叶变换红外光谱法对改性与未改性的二氧化硅微球的红外光谱图进行了分析，如图2所示，其中a线为改性前二氧化硅微球的红外分析谱图，b线为表面修饰βCD-PAA后的二氧化硅微球的红外分析谱图，图中1093cm^-1处是二氧化硅中Si-O振动峰，1639cm^-1和1384cm^-1处是环糊精上C-H振动吸收峰。

实施例2

本实施例的HPLC手性固定相的制备方法，包括下述步骤：

S0、二氧化硅微球的活化处理：

将2g平均粒径为3μm的单分散二氧化硅微球均匀地分散在浓度为0.08mol/L的盐酸水溶液中处理45min，离心分离并将二氧化硅微球用去离子水洗涤至中性；

S1、对活化处理后的二氧化硅微球进行改性：

将活化后的二氧化硅微球置于浓度为12mg/mL的重氮树脂水溶液中，室温下避光、磁力搅拌2小时，离心分离后将微球用去离子水洗涤3次；

S2、将步骤S1得到的微球置于浓度为12mg/mL的βCD-PAA水溶液中，室温下避光、磁力搅拌2小时，离心分离后将微球用去离子水洗涤3次。

S3、将步骤S2得到的微球放于真空干燥箱中室温干燥12h，将干燥后的微球置于紫外光下曝光处理20min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂。

本实施例的重氮树脂为式(1)所示结构，其中n＝5。

实施例3

本实施例的HPLC手性固定相的制备方法，包括下述步骤：

S0、将2g平均粒径为1μm的单分散二氧化硅微球均匀地分散在浓度为0.12mol/L的盐酸水溶液中处理15min，离心分离并将二氧化硅微球水洗至中性；

S1、对活化处理后的二氧化硅微球进行改性：

将活化后的二氧化硅微球置于浓度为8mg/mL的重氮树脂水溶液中，室温下避光、磁力搅拌4小时，离心分离后将微球用去离子水洗涤3次；

S2、将步骤S1得到的微球置于浓度为8mg/mL的βCD-PAA水溶液中，室温下避光、磁力搅拌4小时，离心分离后将微球用去离子水洗涤3次。

S3、将步骤S2得到的微球放于真空干燥箱中室温干燥13h，将干燥后的微球置于紫外光下曝光处理15min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂。

本实施例的重氮树脂为式(1)所示结构，其中n＝6。

实施例4

本实施例的HPLC手性固定相的制备方法，包括下述步骤：

S0、二氧化硅微球的活化处理：

将2g平均粒径为1μm的单分散二氧化硅微球均匀地分散在浓度为0.12mol/L的盐酸水溶液中处理30min，离心分离并将二氧化硅微球水洗至中性；

S1、对活化处理后的二氧化硅微球进行改性：

将活化后的二氧化硅微球置于浓度为12mg/mL的重氮树脂水溶液中，室温下避光、磁力搅拌3小时，离心分离后将微球用去离子水洗涤3次；

S2、将步骤S1得到的微球置于浓度为12mg/mL的βCD-PAA水溶液中，室温下避光、磁力搅拌3小时，离心分离后将微球用去离子水洗涤3次。

S3、将步骤S2得到的微球放于真空干燥箱中室温干燥14h，将干燥后的微球置于紫外光下曝光处理15min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂。

本实施例的重氮树脂为式(1)所示结构，其中n＝3。

应用例1

将实例1所得的可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂在40Mpa压力下用装柱机填到长度为100mm，直径为4.6mm的不锈钢色谱柱中，以乙腈作为流动相，在0.2mL/min的流速下，对手性药物酒石酸美托洛尔进行了高效液相色谱分离，并在250nm波长的紫外检测条件下对分离物质进行检测，检测结果如附图3所示，图3显示具有两个清晰的波峰，这说明酒石酸美托洛尔的(S)-对映体和(R)-对映体实现了分离，因此修饰后的微球手性固定相作为色谱柱填料具有良好的手性分离效果。需要说明的是，如果酒石酸美托洛尔的(S)-对映体和(R)-对映体没有被分离开，则检测结果将只出现一个波峰。

应用例2

将实例1可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂在40Mpa压力下用装柱机填到长度为100mm，直径为4.6mm的不锈钢色谱柱中，以乙腈-TEAA(二者体积比7:3)(TEAA为乙酸和三乙胺的混合水溶液，其中三乙胺在TEAA中的浓度为0.3％，TEAA的PH为4)作为流动相，在0.2mL/min的流速下，对手性药物异丙嗪进行了高效液相色谱分离，并在250nm波长的紫外检测条件下对分离物质进行检测，检测结果如附图4所示。

图4显示具有两个清晰的波峰，这说明手性药物异丙嗪的(S)-对映体和(R)-对映体实现了分离，因此修饰后的微球手性固定相作为色谱柱填料具有良好的手性分离效果。需要说明的是，如果手性药物异丙嗪的(S)-对映体和(R)-对映体没有被分离开，则检测结果将只出现一个波峰。

应用例3

将实例1可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂在40Mpa压力下用装柱机填到长度为100mm，直径为4.6mm的不锈钢色谱柱中，以乙腈-TEAA(二者体积比7:3)(TEAA为乙酸和三乙胺的混合水溶液，其中三乙胺在TEAA中的浓度为0.3％，TEAA的PH为4)作为流动相，在0.2mL/min的流速下，对手性药物二氧丙嗪进行了高效液相色谱分离，并在250nm波长的紫外检测条件下对分离物质进行检测，检测结果如附图5所示。

图5显示具有两个清晰的波峰，这说明手性药物二氧丙嗪的(S)-对映体和(R)-对映体实现了分离，因此修饰后的微球手性固定相作为色谱柱填料具有良好的手性分离效果。需要说明的是，如果手性药物二氧丙嗪的(S)-对映体和(R)-对映体没有被分离开，则检测结果将只出现一个波峰。

应用例4

将实例1可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂在40Mpa压力下用装柱机填到长度为100mm，直径为4.6mm的不锈钢色谱柱中，以甲醇-TEAA(7:3)(其中TEAA为0.3％PH>

图6显示具有两个清晰的波峰，这说明手性药物扑尔敏的(S)-对映体和(R)-对映体实现了分离，因此修饰后的微球手性固定相作为色谱柱填料具有良好的手性分离效果。需要说明的是，如果手性药物扑尔敏的(S)-对映体和(R)-对映体没有被分离开，则检测结果将只出现一个波峰。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。