LIM激酶抑制剂LIMKi3在制备治疗疼痛药物中的应用

摘要

本发明公开了LIM激酶抑制剂LIMKi3在制备治疗疼痛药物中的应用。相对于现有技术，本发明提供的LIM激酶抑制剂LIMKi3能够显著影响疼痛的产生，减轻或者延缓疼痛表型，单独使用或者配合其他镇痛药物使用，能有效治疗疼痛。

说明书

技术领域

本发明属于药物新用途技术领域，涉及LIM激酶抑制剂(LIMKi3)在镇痛药物领域的新用途。

背景技术

疼痛(继呼吸、脉搏、血压、体温之后可被列为人的第五大生命体征。它是指由实际损伤或具有潜在组织损伤风险的各种刺激所引起的一种不愉快的感觉和情绪体验。疼痛可以根据其特征被划分为三个大类：伤害性疼痛、炎症性疼痛和神经病理性疼痛。伤害性疼痛由伤害性刺激所引起，是人体的一种自我保护机制，机体感受到疼痛后逃避刺激，避免刺激对机体造成进一步的伤害，从而保护身体的健康。炎症性疼痛则涉及组织损伤和免疫细胞产物的渗透，炎症因子将会诱发并维持伤害感受器的敏化，并导致长时程的痛觉过敏直到组织修复和炎症消失。神经病理性疼痛则是由强烈的伤害性刺激或组织、神经损伤引起，表现为长时间的痛觉过敏、痛觉异常或自发性疼痛。

疼痛就病程而言，可分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛为新近产生并持续时间较短的疼痛，通常与损伤或疾病有关。疼痛则为持续较长时间的疼痛，可能是急性疼痛治疗效果不好，或损伤愈合后仍然持续存在的疼痛，病人常伴有焦虑、抑郁等精神心理改变。无论是急性疼痛还是慢性疼痛，临床上对疼痛控制的需求远远没有得到满足。

发明内容

发明目的：本发明的在于提供LIM激酶抑制剂LIMKi3在制备治疗疼痛药物中的应用。

技术方案：本发明提供了式I所示LIM激酶抑制剂LIMKi3在制备治疗疼痛药物中的应用

所述治疗疼痛包括消除、减轻或者延缓疼痛等。

所述疼痛包括伤害性疼痛、炎症性疼痛和神经病理性疼痛，但不限于上述疼痛。

作为优选，所述药物是以所述LIMKi3为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的制剂。

所述制剂选自但不限于注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

本发明所述LIMKi3在治疗疼痛时，可以单独使用，也可以与其他镇痛药物配合同时使用，或者与其他镇痛药物一起制成复方制剂使用，都可以达到治疗疼痛的目的。

本发明在制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料(即药学上可接受的辅料)，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的制剂，例如可以是注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂等。

本发明中涉及的LIMKi3抑制底物LIM激酶(LIMK)下游以多种蛋白作为作用底物，包括肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白cofilin，环磷酸腺苷反应元件结合蛋白CREB等。LIM激酶通过磷酸化下游蛋白而广泛参与到通道转运、细胞的运动、形态发生等一些列过程中。在神经系统中则表现为调节突触形态和性能以及受体分布，从而达到影响信号传递的作用。因此在疼痛信号传导过程中，也起到及其重要的调节作用。

最后，本发明还提供了LIM激酶抑制剂LIMKi3抑制LIM激酶下游蛋白磷酸化水平的应用，通过疼痛动物模型试验证实，以LIMK下游蛋白中的丝切蛋白Cofilin以及环磷酸腺苷反应元件结合蛋白CREB为例，所述LIMKi3能显著抑制其活性。

技术效果：相对于现有技术，本发明提供了LIM激酶抑制剂LIMKi3治疗疼痛的新用途，所述LIMKi3能够显著影响疼痛的产生，减轻或者延缓疼痛表型，单独使用或者配合其他镇痛药物使用，能有效治疗疼痛。

附图说明

图1为局部鞘内给药模式下，保留性神经损伤模型中LIMKi3显著抑制LIM激酶下游蛋白磷酸化水平示意图；

图2为局部鞘内给药模式下，LIMKi3对炎症性疼痛表型影响示意图；

图3为不同时间点局部鞘内给药模式下，LIMKi3对保留性神经损伤疼痛表型影响的示意图；

图4为造模后局部鞘内给药模式下，LIMKi3对手术后疼痛表型影响的示意图。

具体实施方式

下面结合附图进一步描述本发明的技术解决方案。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂盒材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

所使用的动物模型，皆为成熟的疼痛动物学模型，相关实验在具备实验操作技能的人员操作下可以进行重复。

实施例1、鞘内给予LIMKi3可以显著抑制LIM激酶下游蛋白磷酸化水平

a)试验动物：健康成年C57bl/6小鼠，清洁级，体重为20-25g。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。

b)试验药品：药物LIMKi3，纯度＞98％，市售(购自Calbiochem公司)。二甲基亚砜(DMSO)，市售。Tris、TEMED、Bovine Serum Albumin、β-Mercaptoethanol、甘氨酸、甘油、吐温-20、溴酚蓝、SDS、Triton 100、Marker购于Sunshine；30％Acrylamide/Bis、Ammonium Persulfate购于Bio-Rad；甲醇、氯化钠、丙三醇、蔗糖购于南京化学试剂有限公司；Paraformaldehyde购于Solarbio；Anti-p-Pofilin抗体购于Santa cruz；Anti-Cofilin抗体购于CST；Anti-CREB抗体购于CST；Anti-p-CREB抗体购于Santa cruz；Anti-Tubulin抗体购于Bio-World；anti-rabbit购于R&D。

c)试验方法：

保留性神经损伤模型：小鼠麻醉后，切开皮肤、钝性分离肌肉就可以看见坐骨神经主干及其三个分支，胫神经、腓总神经和腓肠神经。用6-0缝合线结扎并切断胫神经、腓总神经，保留腓肠神经，确保腓肠神经完好无损，待小鼠恢复后1天进行脊髓取样。

小鼠鞘内注射：按压小鼠腰骶部两侧固定，自L5–L6棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。用25μl微量进样器，注射容积为5μl，注射时间10s，留针20s。

LIMKi3给药剂量和方法：LIMKi3用DMSO溶解后以生理盐水稀释，剂量为5μg/5μl溶媒，给药方式均为鞘内注射。本实施例中，为取样前2小时注射1剂。

组织蛋白免疫印迹：取相关L4-L6脊髓节段称重后，按照1:20(质量:体积)比例加入裂解液，冰上超声处理10s后，沸水浴中5min变性，15,000转离心15min，吸取上清，20μl/管分装，-70℃保存。取10μl样品/泳道上样于10％SDS-PAGE进行凝胶电泳，4℃110V电转90min。5％BSA-TBS封闭1小时后，加入p-Cofilin抗体(p-Ser3)(1:1,000，Santa Cruz)、Cofilin抗体(1:2000，CST)、Tubulin抗体(1：8000，Bio-World)4℃过夜。TBST漂洗10min×3次后，加入HRP标记二抗羊抗兔-HRP二抗(1:1000，R&D)室温孵育3小时后加入ECL(Pierce)发光底物显色。用分子显影仪成像分析数据。用目的蛋白灰度值与胞浆蛋白内参Tubulin灰度值之比进行半定量分析。

d)试验结果描述：

本实施例中主要选取多种LIMK下游蛋白中的丝切蛋白Cofilin以及环磷酸腺苷反应元件结合蛋白CREB的活性作为抑制指标。如图1AB所示，鞘内注射5ug LIMKi3可以显著降低Cofilin的磷酸化水平，抑制保留性神经损伤导致的Cofilin活化。如图1CD所示，鞘内注射5ug LIMKi3同样可以显著降低CREB的磷酸化水平，抑制保留性神经损伤导致的CREB活化。

实施例2、鞘内给予LIMKi3可以显著抑制炎症性疼痛表型

a)试验动物：

健康C57bl/6小鼠，清洁级，体重为20-25g。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。

b)试验药品及试剂：

药物LIMKi3，纯度＞98％，市售(购自Calbiochem公司)。二甲基亚砜(DMSO)，市售。

c)试验方法：

炎症性疼痛模型：小鼠保固后，使用30号针头注射器，在小鼠足底注射完全弗氏佐剂和生理盐水1：1的混合物20微升。注射后不同时间点测定小鼠机械阈值。

小鼠鞘内注射：按压小鼠腰骶部两侧固定，自L5–L6棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。用25μl微量进样器，注射容积为5μl，注射时间10s，留针20s。

LIMKi3给药剂量和方法：LIMKi3用DMSO溶解后以生理盐水稀释，剂量为5μg/5μl溶媒，给药方式均为鞘内注射。本实施例中，注射2剂，间隔12小时。

机械触丝反射阈值测定：在安静环境中，维持环境温度20～25℃，将小鼠放入底部为丝网的玻璃箱内，全身可以自由活动。待小鼠静置60min后，用机械触丝刺激小鼠足掌，测定小鼠的抬脚阈值，并以此作为机械刺激缩足反射阈值。

图2中小鼠随机分为两组：溶媒组与LIMKi3组，在造模前15分钟注射，造模后相应时间点进行疼痛的行为学测定。记录给药后炎症痛模型小鼠的缩足阈值(图2)。

d)试验结果描述

如图2所示：在造模前鞘内注射LIMKi3，对小鼠炎症性机械刺激疼痛具有缓解作用。以上结果表明：LIMKi能够显著抑制炎症导致的疼痛表型。

实施例3、鞘内给予LIMKi3对于保留性神经损伤疼痛表型的影响

a)试验动物：

健康C57bl/6小鼠，清洁级，体重为20-25g。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。

b)试验药品及试剂：

药物LIMKi3，纯度＞98％，市售(购自Calbiochem公司)。二甲基亚砜(DMSO)，市售。

c)试验方法：

保留性神经损伤模型：小鼠麻醉后，切开皮肤、钝性分离肌肉就可以看见坐骨神经主干及其三个分支，胫神经、腓总神经和腓肠神经。用6-0缝合线结扎并切断胫神经、腓总神经，保留腓肠神经，确保腓肠神经完好无损，待小鼠恢复后进行痛觉测试。

小鼠鞘内注射：按压小鼠腰骶部两侧固定，自L5–L6棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。用25μl微量进样器，注射容积为5μl，注射时间10s，留针20s。

LIMKi3给药剂量和方法：LIMKi3用DMSO溶解后以生理盐水稀释，剂量为5μg/5μl溶媒，给药方式均为鞘内注射。本实施例中，注射6剂，初次注射后每间隔12小时注射。

机械触丝反射阈值测定：在安静环境中，维持环境温度20～25℃，将小鼠放入底部为丝网的玻璃箱内，全身可以自由活动。待小鼠静置60min后，用机械触丝刺激小鼠足掌，测定小鼠的抬脚阈值，并以此作为机械刺激缩足反射阈值。

冷觉阈值测定：使用注射器向小鼠足底施加一滴丙酮溶液，然后观察小鼠在一分钟内的舔足甩足等疼痛表型的时间，重复四次后取平均值作为最终冷觉阈值。

图3中小鼠随机分为多组：溶媒组与造模前后不同时间给LIMKi3组(造模前15分钟，造模后6h)，然后在造模后相应时间点进行疼痛的行为学测定。记录给药后小鼠的缩足阈值(图3A)与冷觉反应阈值(图3B)。

d)试验结果描述

如图3所示：在造模前鞘内注射LIMKi3，对小鼠机械刺激和冷觉疼痛都具有缓解作用。在造模后给药组中，可以达到造模前给药类似的效果。以上结果表明：LIMKi3能够显著抑制保留性神经损伤导致的疼痛表型。

实施例4、鞘内给予LIMKi3对于术后疼痛表型的影响

a)试验动物：

健康C57bl/6小鼠，清洁级，体重为20-25g。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。

b)试验药品及试剂：

药物LIMKi3，纯度＞98％，市售(购自Calbiochem公司)。二甲基亚砜(DMSO)，市售。

c)试验方法：

术后痛模型：小鼠麻醉后，切开小鼠一侧足底皮肤，钝性分离足底肌腱，使用镊子牵拉保持2分钟，然后使用6-0缝合线进行足底缝合，待小鼠恢复后进行痛觉测试。

小鼠鞘内注射：按压小鼠腰骶部两侧固定，自L5–L6棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。用25μl微量进样器，注射容积为5μl，注射时间10s，留针20s。

LIMKi3给药剂量和方法：LIMKi3用DMSO溶解后以生理盐水稀释，剂量为5μg/5μl溶媒，给药方式均为鞘内注射。本实施例中，注射1剂。

机械触丝反射阈值测定：在安静环境中，维持环境温度20～25℃，将小鼠放入底部为丝网的玻璃箱内，全身可以自由活动。待小鼠静置60min后，用机械触丝刺激小鼠足掌，测定小鼠的抬脚阈值，并以此作为机械刺激缩足反射阈值。

图4中小鼠随机分为两组：溶媒组与LIMKi3组，在造模前15分钟注射，造模后相应时间点进行疼痛的行为学测定。记录给药后小鼠的缩足阈值(图4)。

d)试验结果描述

如图4所示：在造模前鞘内注射LIMKi3可以减轻手术后疼痛的形成，阻止机械疼痛阈值的降低，但是对未手术处理侧脚掌的疼痛阈值没有明显影响。

以上结果表明：LIMKi3能够显著抑制手术操作导致的异常疼痛表型，对于手术后疼痛的发生有明显的缓解作用。