一种用于固定核酸探针的点样液及其配制方法和核酸探针固定方法

摘要

本发明公开了一种用于固定核酸探针的点样液及其配制方法和核酸探针固定方法，该点样液含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和日落黄色素。使用本发明的点样液无需提前用盐酸、EDC处理尼龙膜，而是将该点样液与核酸探针溶液混合直接点到未经处理的尼龙膜上即完成核酸探针的固定。因此，使用本发明的点样液使得核酸探针的固定省时、低成本、易操作、可满足规模化生产要求。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸芯片技术领域，尤其涉及一种用于固定核酸探针的点样液及其配制方法和核酸探针固定方法。

背景技术

制作基于尼龙膜固相载体的核酸芯片过程中，一个关键工序即是将核酸探针固定到尼龙膜上。目前采用的传统工艺方法是先使用盐酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化尼龙膜(Zhang Yong，Coyne Mazie Y，Will Stephen G，et al(1991)，Single-base mutational analysis of cancer and genetic diseases using membrane bound modified oligonucleotides[J].Nucl Acids Res，19(14):3929-3933.；Chehab FF and Wall J(1992)，Detection of multiple cystic fibrosis mutations by reverse dot blot hybridization:a technology for carrier screening[J].Human Genetics，89(2):163-168)，之后再将氨基标记的核酸探针通过点样设备点到活化过的尼龙膜上进行化学固定反应。该工艺方法缺点有：步骤繁琐、耗费时间长、材料成本高、操作不方便，难以满足大规模生产要求等。

发明内容

本发明提供一种用于固定核酸探针的点样液，使用该点样液无需提前用盐酸、EDC处理尼龙膜，而是将该点样液与核酸探针溶液混合直接点到未经处理的尼龙膜上即完成核酸探针的固定。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于固定核酸探针的点样液，该点样液含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素。

作为本发明的优选方案，上述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是4～20％(质量/体积)和0.1～1％(质量/体积)。

作为本发明的进一步优选方案，上述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是6～16％(质量/体积)和0.2～0.8％(质量/体积)。

作为本发明的更进一步优选方案，上述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 和日落黄色素的含量分别是8～12％(质量/体积)和0.4～0.6％(质量/体积)。

作为本发明的优选方案，上述点样液以磷酸盐缓冲液(PBS)作为溶剂。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种如第一方面的点样液的配制方法，包括：将配方量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于日落黄色素溶液中，形成上述点样液。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种使用如第一方面的点样液固定核酸探针的方法，包括：将上述点样液与核酸探针工作液混合，然后将混合液点到未经处理的尼龙膜上。

作为本发明的优选方案，上述混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为2～10％(质量/体积)。

作为本发明的优选方案，上述点样液与核酸探针工作液按等体积混合。

本发明的有益效果是：使用本发明的点样液无需提前用盐酸、EDC处理尼龙膜，而是将该点样液与核酸探针溶液混合直接点到未经处理的尼龙膜上即完成核酸探针的固定。因此，使用本发明的点样液使得核酸探针的固定省时、低成本、易操作、可满足规模化生产要求。更重要的是，使用本发明的点样液完全能够取得与现有提前用盐酸、EDC处理尼龙膜再进行点样相同的效果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

本发明的用于固定核酸探针的点样液，含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和日落黄色素。

需要说明的是，目前还没有将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素混合形成点样液，一步法实现核酸探针的点样和固定的方法。而本发明的点样液能够实现这样的目的，取得省时、低成本、易操作、可满足规模化生产要求的效果。

由于本发明的点样液需要与核酸探针工作液混合后再进行点样，而点样液与核酸探针工作液的混合比例允许在较宽的范围内变化，例如按照体积比1:10～10:1的范围。因此，点样液中EDC和日落黄色素的含量可以不做具体限定，根据具体情况，在点样液中EDC和日落黄色素的含量较高的情况下，可以相应地与较大体积比的核酸探针工作液混合；在点样液中EDC和日落黄色素的含量 较低的情况下，可以相应地与较小体积比的核酸探针工作液混合。

虽然，点样液中EDC和日落黄色素的含量可以不做具体限定，但是从实现更好的固定效果的角度考虑，优选地，点样液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是4～20％(质量/体积)和0.1～1％(质量/体积)；更优选地，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是4～20％(质量/体积)和0.1～1％(质量/体积)；进一步更优选地，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是6～16％(质量/体积)和0.2～0.8％(质量/体积)；最优选地，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是8～12％(质量/体积)和0.4～0.6％(质量/体积)。

需要说明的是，EDC和日落黄色素在点样液中的含量按照质量/体积计，其中质量/体积的单位按照本领域通常的理解，比如克/毫升(g/mL)，例如4～20％(质量/体积)可以表示在100mL点样液中含有4～20g EDC；类似地，0.1～1％(质量/体积)可以表示在100mL点样液中含有0.1～1g日落黄色素。当然，上述对单位的说明仅是示例性的，并不排除采用其它单位的表示方式。

作为本发明的优选方案，上述点样液以酸盐缓冲液(PBS)为溶剂。

本发明还提供了上述点样液的配制方法，包括：将配方量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于日落黄色素溶液中，形成上述点样液。

上述“配方量”是指，配制以后点样液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的终浓度含量。例如，点样液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是4～20％(质量/体积)和0.1～1％(质量/体积)；更优选地，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是4～20％(质量/体积)和0.1～1％(质量/体积)；进一步更优选地，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是6～16％(质量/体积)和0.2～0.8％(质量/体积)；最优选地，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和日落黄色素的含量分别是8～12％(质量/体积)和0.4～0.6％(质量/体积)。

本发明还提供了使用上述点样液固定核酸探针的方法，包括：将上述点样液与核酸探针工作液混合，然后将混合液点到未经处理的尼龙膜上。

本发明的点样液以及其使用方法的优势正体现在，其不需要提前用盐酸、EDC处理尼龙膜，而是将该点样液与核酸探针溶液混合直接点到未经处理的尼龙膜上即完成核酸探针的固定。

如上所述，由于本发明的点样液需要与核酸探针工作液混合后再进行点样，而点样液与核酸探针工作液的混合比例允许在较宽的范围内变化，例如按照体积比1:10～10:1的范围，优选1:5～5:1的范围，更优选1:2～2:1的范围。因此，点样液中EDC和日落黄色素的含量可以不做具体限定。然而，从固定效果的角度而言，点样液与核酸探针工作液混合之后形成的混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为2～10％(质量/体积)比较好。因此，从优化固定效果的目的出发，最优选点样液与核酸探针工作液按等体积混合，并且混合之后形成的混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为2～10％(质量/体积)，也就是说混合之前点样液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的含量是4～20％(质量/体积)，进一步，混合之前点样液中日落黄色素的含量是0.1～1％(质量/体积)。

以下通过比较例和实施例详细说明本发明的点样液及其配制方法和使用方法，以及其固定效果。

以下实施例基本上按照如下步骤进行：

1、称取EDC适量加至含0.1％～1％的日落黄色素溶液中，形成点样液；

2、将该点样液与核酸探针工作液等体积混合，形成混合液；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样。

以下比较例基本上按照这样的程序进行，尼龙膜经前处理(盐酸、EDC处理)后，再用不含EDC的日落黄色素溶液作为点样液与核酸探针工作液混合作为样本，使用同样的点样仪将样本点到经前处理过的膜上形成比较组尼龙膜。

比较例和实施例点样后的样品，分别经DNA杂交和显色后，比较其固定效果，具体通过INS值比较固定效果。

以下实施例中，按照如下方法进行杂交和显色。

1DNA杂交：

1.1准备

1.1.1准备试剂

将杂交中和液及洗液B置55℃预热。

1.1.2准备湿盒

建议制作方法：用适当大小(不小于20cm×15cm×10cm)的带盖塑料盒，内置吸水纸，加水浸湿，以无流动水为宜，55℃预热。

注意：在基因芯片的温育操作中必须用湿盒保湿，切忌湿盒干燥！

1.1.3基因芯片定位

小心转移基因芯片至96孔板内，按正位摆放在芯片孔内(正位指芯片水平放置、黑色定位点面朝上，定位点正对孔内左下角；芯片孔指已定位芯片的孔位)。

注意：转移芯片时应避免器械接触芯片中心区及污损芯片！

1.2预杂交

向各芯片孔中加入100μL洗液B，55℃温育15分钟；吸干孔内液体。

1.3变性

取30μL变性液加至PCR产物管中，轻微摇动混匀，静置10分钟。

1.4中和与杂交

向各芯片孔中分别加入100μL杂交中和液和变性的PCR产物(约60μL)，轻微摇动混匀。

55℃温育30分钟，吸干孔内液体。

1.5清洗

向各芯片孔中加入150μL洗液B，轻微摇动漂洗3分钟，吸干孔内液体；重复2次。

注意：应使芯片孔内温度不低于20℃，否则影响清洗效果！

2显色

2.1准备试剂

2.1.1将洗液A和显色液B置37℃预热。

2.1.2配制酶标工作液

按表1要求，用洗液A将酶标原液稀释为酶标工作液。

注意：实际计算用量时应计入损耗量。

表1配制酶标工作液

用量酶标原液洗液A1份检测用量1μL100μL24份检测用量24μL2.4mL

2.2酶标

取100μL酶标工作液，加至清洗的芯片孔内，37℃温育30分钟；吸干孔内液体。

2.3清洗

加入150μL洗液A，轻微摇动漂洗3分钟，吸干孔内液体；重复1次。

加入150μL洗液C，轻微摇动漂洗3分钟，吸干孔内液体。

注意：应使芯片孔内温度不低于20℃，否则影响清洗效果！

2.4显色

分别加入50μL显色液A和50μL显色液B，轻微摇动混匀，室温显色5分钟。

吸干孔内液体，加入150μL洗液C，静置约1分钟，吸干孔内液体。

2.5风干

45℃风干。注意：请确认风干后检测。

3检测与分析

检查确认芯片孔内基因芯片均为正位，用HPV分型基因芯片检测阅读系统对基因芯片检测并分析。

比较例1：

1、取5ml含0.1％的日落黄色素溶液；

2、将80μL该溶液与2.4μM的5’-氨基标记核酸探针工作液F1(F1核酸探针序列为：5’-GCAGACCGAAGTGGATTGCGAGTATTTGA-3’,来自GeneBank ID：NM_117849)等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将经盐酸和EDC前处理之后的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用包含F1探针序列的反向互补序列的核酸溶液(含有0.1μM的5’-生物素标记的人工合成核酸片段，序列为：5’-TCTCTTCCGTTAATTTCTCAACACATCTTTTCAAATACTCGCAATCCACTTCGGTCTGC-3’)与芯片杂交，记录INS值及阴阳性结果。

比较例2：

1、取5ml含0.5％的日落黄色素溶液；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将经盐酸和EDC前处理之后的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

比较例3：

1、取5ml含1％的日落黄色素溶液；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将经盐酸和EDC前处理之后的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例1：

1、称取EDC 0.2g加至5ml含0.1％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例2：

1、称取EDC0.2g加至5ml含0.5％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例3：

1、称取EDC0.2g加至5ml含1％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例4：

1、称取EDC0.4g加至5ml含0.1％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例5：

1、称取EDC0.4g加至5ml含0.5％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例6：

1、称取EDC0.4g加至5ml含1％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例7：

1、称取EDC0.8g加至5ml含0.1％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例8：

1、称取EDC0.8g加至5ml含0.5％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例9：

1、称取EDC0.8g加至5ml含1％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例10：

1、称取EDC1.0g加至5ml含0.1％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例11：

1、称取EDC1.0g加至5ml含0.5％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

实施例12：

1、称取EDC1.0g加至5ml含1％的日落黄色素溶液中；

2、将80μL该溶液与探针工作液F1等体积混合，离心10000rpm，5min；

3、将混合液加入加样板中；

4、将未经处理的尼龙膜平铺于点样仪载台上；

5、编辑点样程序，开始点样；

6、用F1探针的反向互补序列与芯片杂交记录INS值及阴阳性。

表1示出了以上比较例和实施例得到的INS值及阴阳性结果。

表1比较例和实施例得到的INS值及阴阳性

实施例/比较例EDC含量日落黄色素含量INS值及阴阳性比较例100.10％58(阳性)比较例200.50％56(阳性)比较例301.00％52(阳性)实施例14％0.10％57(阳性)实施例24％0.50％54(阳性)实施例34％1.00％50(阳性)实施例48％0.10％58(阳性)实施例58％0.50％53(阳性)实施例68％1.00％52(阳性)实施例716％0.10％58(阳性)实施例816％0.50％54(阳性)实施例916％1.00％51(阳性)实施例1020％0.10％57(阳性)实施例1120％0.50％52(阳性)实施例1220％1.00％51(阳性)

注：INS值大小反映显色点颜色深浅，当INS值≧11判断为阳性结果，<11为阴性结果。

表1所示的结果表明，实施例与比较例均能取得相当的结果，表明采用本发明的点样液直接点样尼龙膜的固定效果与现有的先用盐酸和EDC处理尼龙膜 再点样的固定效果是一样的。然而，本发明的点样液及点样方法的显著优势在于，使用本发明的点样液使得核酸探针的固定省时(例如节省时间100％)、低成本(例如，EDC材料成本降低90％)、易操作、可满足规模化生产要求。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。