与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记及其应用

摘要

本发明提供一种与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于用于调控苹果斑点落叶病抗性的miRNA初级转录本Md‑MIRLn12‑277的启动子上，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列的378bp处碱基为T的苹果品种对苹果斑点落叶病的抗性显著高于此处碱基为G的苹果品种。可将其作为苹果属栽培品种对苹果斑点落叶病抗性的分子标记，用于筛选苹果斑点落叶病抗性资源和选育抗性苹果品种。

说明书

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体地说，涉及一种与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

苹果斑点落叶病是苹果最主要真菌性病害之一，可通过向叶片释放各类毒力因子和效应因子影响植物代谢，使叶片出现过氧化物积累和细胞死亡。一系列研究表明，植物的抗病机制是病原菌侵入植物时，首先是位于细胞质膜的受体激酶会在识别病原菌后激活下游MAPK等信号途径使植物产生抗病性(PTI途径)；由于植物的抗病性使得病原菌会进化出一系列效应因子来克服植物的抗病性；为了识别病原菌的效应因子，植物也演化出一系列抗病基因(R基因)，激活抗病反应(ETI途径)，而miRNA是调控抗病基因的重要调控因子。

传统方法采用药剂防治病害会影响食品安全或造成环境污染。通过设计特异性引物进行PCR扩增并测序的鉴定方法可筛选苹果斑点落叶病抗性资源，选育抗性苹果品种是解决这一问题的最有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记及其应用。

本发明以感病品种‘金冠’为试材利用miRNA二代测序筛选出接种苹果斑点落叶病Alternaria Alternariaf.spmali(ALT1)前后表达差异2倍以上的miRNA，获得一个新的miRNA，将其命名为Md-miRLn12(SEQ ID NO:5)。由于苹果感病品种叶片接种ALT1后Md-miRLn12及其初级转录本Md-MIRLn12-277表达会明显升高，但抗性品种无显著变化；因此克隆比较了二者Md-MIRLn12-277及其启动子区，发现抗性品种与感病品种Md-MIRLn12-277序列相同，但启动子区存在3个碱基不同，其中-1186bp SNP位点是决定Md-MIRLn12-277启动子活性的位点。因此，发明人通过这个SNP位点开发了选育抗斑点落叶病苹果品种的分子标记。

为了实现本发明目的，本发明与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于用于调控苹果斑点落叶病抗性的Md-miRLn12的初级转录本Md-MIRLn12-277的启动子上，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列的378bp处碱基为T的苹果品种对苹果斑点落叶病的抗性显著高于此处碱基为G的苹果品种。用于调控苹果斑点落叶病抗性的Md-miRLn12的初级转录本Md-MIRLn12-277的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供用于检测所述与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记的引物，包括正向引物F5’-AACACAGGGAGCACTTCTATTG-3’和反向引物R5'-GTCCGTTATTATACGAATAATTGG-3'。

本发明还提供所述与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记在鉴定苹果斑点落叶病抗性品种及感病品种中的应用，包括以下步骤：

1)提取待测苹果植株的基因组DNA；

2)以待测苹果植株的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中378bp处的碱基为T，则待测苹果植株属于苹果斑点落叶病抗性品种；如果扩增产物序列中378bp处的碱基为G，则待测苹果植株属于苹果斑点落叶病感病品种。

具体可根据测序碱基差异和测序峰图判断不同苹果栽培品种对苹果斑点落叶病抗性。抗性品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处为T，测序峰图为T单峰；中性品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处G和T同时存在，测序峰图为G和T套峰；感病品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处为G，测序峰图为G单峰。

本发明还提供含有所述引物的用于检测苹果斑点落叶病抗性苹果品种的试剂盒。

本发明还提供所述与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记在苹果分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的Md-miRLn12的初级转录本Md-MIRLn12-277，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。该基因编码的成熟miRNA为Md-miRLn12(SEQ ID NO:5)。在苹果斑点落叶病感病苹果植株中抑制Md-miRLn12的表达，可提高感病品种对苹果斑点落叶病的抗性；同时，在苹果斑点落叶病抗性苹果植株中过表达Md-miRLn12，可降低抗性品种对苹果斑点落叶病的抗病性。

本发明还提供一种表达载体，所述表达载体上携带含有Md-miRLn12的模拟靶标串联序列(STTM，序列如SEQ ID NO:6所示)的表达盒。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd>

本发明进一步提供Md-miRLn12在调控苹果斑点落叶病抗性中的应用，利用基因工程的手段，通过抑制Md-miRLn12在苹果斑点落叶病感病苹果植株中的表达，从而提高感病植株对苹果斑点落叶病的抗性。

在本发明的一个优选实施方式中，将合成的Md-miRLn12的模拟靶基因串联序列(STTM，序列如SEQ ID NO:6所示)构建到pFGC5941载体上(NcoI和BamHI酶切位点之间)，采用农杆菌(GV3101)介导的方法，在感病苹果品种中瞬时表达，可提高转基因植株的抗病性。

本发明具有以下优点：

本发明可以有效解决药剂防治苹果斑点落叶病病害影响食品安全或造成环境污染等问题，通过设计特异性引物进行PCR扩增并测序的鉴定方法，解决了选育抗性品种的问题，并且可以筛选苹果斑点落叶病抗性资源，同时也解决了果树转基因，杂交技术较难，耗时长且不方便鉴定的问题。本发明提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于苹果属植物。

附图说明

图1为本发明实施例1接种ALT1后1小时、2小时、24小时和48小时，Md-miRLn2分别在抗性品种‘寒富’和感病品种‘金冠’表达变化，以不接菌表达量作为对照(0小时)。

图2为本发明实施例2在感病品种‘金冠’中沉默Md-miRLn12可以增强感病品种抗病性。其中，A：载体示意图；B：农杆菌介导的瞬时表达感病品种‘金冠’组培苗4天后接菌，接种48小时后通过Northern检测Md-miRLn12表达量；C：农杆菌介导的瞬时表达感病品种‘金冠’组培苗4天后接菌，接种48小时后检测发病率及病症；WT代表不进行瞬时表达‘金冠’组培苗；SC代表划伤不进行瞬时表达‘金冠’组培苗；EV代表pFGC5941空载进行瞬时表达‘金冠’组培苗；STTM-Md-miRLn12代表沉默Md-miRLn12的pFGC5941载体进行瞬时表达‘金冠’组培苗。

图3为本发明实施例2在抗病品种‘寒富’中过表达Md-miRLn12可以降低抗病品种抗病性。其中，A：载体示意图；B：农杆菌介导的瞬时表达抗性品种‘寒富’组培苗4天后接菌，接种48小时后通过Northern检测Md-miRLn12表达量；C：农杆菌介导的瞬时表达抗性品种‘寒富’组培苗4天后接菌，接种48小时后检测发病率及病症；WT代表不进行瞬时表达‘寒富’组培苗；SC代表划伤不进行瞬时表达‘寒富’组培苗；EV代表pFGC5941空载进行瞬时表达‘寒富’组培苗；OE-Md-miRLn12代表过表达Md-miRLn12的pFGC5941载体进行瞬时表达‘寒富’组培苗。

图4为本发明实施例3中感病品种‘金冠’Md-MIRLn12-277启动子和抗性品种‘寒富’Md-MIRLn12-277启动子序列比较结果。

图5为本发明实施例3中分别将抗性品种‘寒富’和感病品种‘金冠’Md-MIRLn12-277启动子融合GUS后，农杆菌介导的瞬时表达‘金冠’和‘寒富’苹果组培苗，接菌前后的GUS染色及GUS活性检测结果。其中，A：分别将抗性品种‘寒富’Md-MIRLn12-277启动子和感病品种‘金冠’Md-MIRLn12-277启动子分别融合GUS载体示意图；B：分别将抗性品种‘寒富’和感病品种‘金冠’Md-MIRLn12-277启动子融合GUS后农杆菌介导的瞬时表达‘金冠’和‘寒富’苹果组培苗4天后接菌，接种48小时后进行GUS染色及GUS活性检测。

图6为本发明实施例3中分别将突变-1186bp处的抗性品种‘寒富’Md-MIRLn12-277启动子和感病品种‘金冠’Md-MIRLn12-277启动子融合GUS后，农杆菌介导的瞬时表达‘金冠’和‘寒富’苹果组培苗，接菌前后的GUS染色及GUS活性检测结果。其中，A：分别将突变-1186bp处的抗性品种‘寒富’Md-MIRLn12-277启动子和感病品种‘金冠’Md-MIRLn12-277启动子融合GUS载体示意图；B：分别将突变-1186bp处的抗性品种‘寒富’和感病品种‘金冠’Md-MIRLn12-277启动子融合GUS后农杆菌介导的瞬时表达‘金冠’和‘寒富’苹果组培苗4天后接菌，接种48小时后进行GUS染色及GUS活性检测。

图7为本发明实施例4中35种苹果品种Md-MIRLn12-277启动子序列(1563bp)PCR扩增电泳图。其中，M为DNA分子量标准，1-35分别为‘寒富’、‘Ⅱ8-19’、‘斯塔克矮金冠’、‘鸡冠’、‘蜜金’、‘红夏’、‘斯塔克金矮生’、‘柳玉’、‘国帅’、‘列湟特加拿大’、‘乔雅尔’、‘60-4-4’、‘白罗斯马林’、‘早金冠’、‘初笑’、‘青葡1号’、‘女游击队员’、‘金沙以拉木’、‘拿破仑’、‘美尔塔什’、‘莫斯科透明’、‘富士’、‘早生鹤之卵’、‘理想’、‘克龙谢尔透明’、‘红金’、‘瑞光’、‘荣冠’、‘花嫁’、‘黄魁’、‘伏帅’、‘嘎啦’、‘槟子’、‘麻姑’、‘金冠’。

图8为本发明实施例4中根据测序峰图分析，判断不同苹果栽培品种对苹果斑点落叶病的抗性。其中，上图代表抗性品种，中间图代表中性品种，下图代表感病品种。抗性品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处为T，测序峰图为T单峰；中性品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处G和T同时存在，测序峰图为G和T套峰；感病品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处为G，测序峰图为G单峰。

图9为本发明实施例4中荧光定量PCR检测35个苹果栽培品种在接菌ALT1后1小时、2小时、24小时和48小时，Md-miRLn12与Md-MIRLn12-277的表达量。抗性品种中，接菌ALT1后Md-miRLn12与Md-MIRLn12-277的表达量较低；感病品种中，接菌ALT1后Md-miRLn12与Md-MIRLn12-277的表达量较高。以不接菌表达量作为对照(0小时)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 Md-miRLn12的发现

以感病品种‘金冠’为试材筛选接种苹果斑点落叶病AlternariaAlternariaf.spmali(ALT1)前后表达差异2倍以上的miRNA，与miRBase(http://www.mirbase.org/)和苹果基因组(https://www.rosaceae.org/)中比对，获得一个新的miRNA，将其命名为Md-miRLn12(SEQ ID NO:5)，并获得Md-miRLn12初级转录本初级转录本Md-MIRLn12-277(SEQ ID NO:4)由于苹果感病品种叶片接种ALT1后Md-miRLn12及其Md-MIRLn12-277表达会明显升高，但抗性品种无显著变化；因此克隆比较了二者Md-MIRLn12-277及其启动子区，发现抗性品种与感病品种Md-MIRLn12-277序列相同，但启动子区存在3个碱基不同。通过GUS染色及GUS活性检测实验，证明Md-MIRLn12-277启动子-1186bp SNP位点是决定Md-MIRLn12-277启动子活性的位点。可利用这个SNP位点开发出选育抗斑点落叶病苹果品种的分子标记。

具体方法如下：

1、植物总RNA提取

(1)苹果‘金冠’各组织样品取1g在液氮中快速研磨，然后转入装有预热的CTAB(700μL)的2mL离心管中，震荡混匀后65℃水浴30min，每10min颠倒混匀一次；

(2)加入700μL CI(氯仿/异戊醇体积比＝24:1)，颠倒混匀1min；

(3)4℃13000rpm 10min；

(4)取上清，加入等体积的CI，颠倒混匀1min；

(5)4℃13000rpm 10min；

(6)将上清转入另一个装有0.1倍体积的3M/L Na₂AC的离心管中，再加入等体积的异丙醇，-70℃存放1小时以上。

(7)4℃10000rpm 20min，然后弃上清并将液体吹干；

(8)加入70％乙醇清洗沉淀2次；

(9)10000rpm离心15min，弃上清并将离心管倒扣在吸水纸上晾干，最终溶解在80μL无菌水中。

总RNA中DNA的去除：

(1)在1.5mL PCR管中加入以下成分：

(2)按照以上体系混匀后37℃处理30min；加入100μL无RNase水(0.1％DEPC处理后的水)；加入等体积CI混匀；

(3)4℃ 10000rpm离心20min；取上清加入等体积CI颠倒混匀，4℃ 10000rpm离心20min；

(4)取上清，2.5倍体积的无水乙醇，-70℃沉淀2h；4℃，10000rpm离心20min；弃上清，沉淀吹干后加入75％乙醇清洗，10000rpm离心5min；

(5)低温下吹风机吹干沉淀，然后溶于30-50μL DEPC水或无RNase水中，-70℃保存备用。

(6)1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，紫外分光光度计测260nm处吸光度计算RNA浓度。

2、逆转录反应体系及步骤

逆转录反应体系如下：

RNA 2μg

特异性茎环引物(10μM)1μL

DEPC水补足至12μL

冰上加样并混匀，短暂离心，70℃5min，然后马上置于冰上5min。

反应体系如下：

轻弹混匀，短暂离心，42℃1h，70℃10min。

反转录产物冷却后放入-80℃冰箱保存或直接用于PCR反应。

3、荧光定量反应体系

设计Md-miRLn12特异引物(F：tgcactagcgtgtttgaacaag，R：acatcgtatcgtgaag)，用SYBR Green荧光定量预混液(TIANGEN,FP121221)在Applied Biosystems 7500进行荧光定量，PCR反应程序如下：95℃，15mins；95℃10sec，60℃30sec，共40个循环。结果利用2^-ΔΔCt方法进行统计分析(Livak>

接种苹果斑点落叶病病原(ALT1)后，Md-miRLn2分别在抗性品种‘寒富’和感病品种‘金冠’表达变化见图1。

实施例2用于调控苹果斑点落叶病抗性的基因Md-miRLn12的获得

合成Md-miRLn12的模拟靶基因串联序列(STTM，序列如SEQ IDNO:6所示)构建到pFGC5941载体上(NcoI和BamHI酶切位点之间)，用来沉默内源Md-miRLn12。农杆菌介导(GV3101)的瞬时表达感病品种‘金冠’苹果组培苗叶片，4d后接种ALT1，2d后检测结果表明，Md-miRLn12表达量降低，叶片发病率显著降低并且病症较轻。说明在感病品种‘金冠’中沉默Md-miRLn12可以增强感病品种抗病性(图2)。

将Md-miRLn12初级转录本Md-MIRLn12-277序列构建到pFGC5941载体上，用来过表达Md-miRLn12。农杆菌介导(GV3101)的瞬时表达抗性品种‘寒富’组培苗叶片，4天后接菌ALT1，接种48小时后检测表明，Md-miRLn12表达上升的同时，发病率上升并且病症严重。说明在抗病品种‘寒富’中过表达Md-miRLn12可以降低抗病品种抗病性(图3)。

具体方法如下：

1、miRNA Northern法检测

合成5’端修饰地高辛标记的Md-miRLn12和U6探针(Md-miRLn12_probe：AGGGAGCAAATCTTGTTCAAA；U6_probe：CTCGATTTATGCGTGTCATCCTTGC)。取60μg RNA(CTAB提取)加入2×loading buffer，95℃5min，然后4℃冷却，上样于15％聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)，1×TBS buffer中100V电泳3h；1×TBS buffer中300mA，4℃电转于尼龙膜上；1200mJ紫外交联2mins，利用地高辛杂交检测试剂盒(Mylab corporation)进行预杂交、杂交、洗膜和信号检测。

2、农杆菌转化

(1)取一管制备好的感受态细胞，冰上完全溶解后轻轻悬浮细胞。

(2)加入5-10μL植物表达载体质粒，轻轻混匀，冰上放置30min。

(3)液氮中冷激1min。

(4)37℃热激5min，冰上放置2min。

(5)加入500μL YEP培养基，于28℃ 140rpm振荡培养4-6h。

(6)室温4000rpm离心3min，去除约400μL上清液，用剩余的培养基悬浮细胞。

(7)将细菌涂布在加有抗生素(50mg/L Km，20mg/L Rif)的固体YEP培养基上。

(8)将平板于28℃倒置培养(24-48h)。

3、农杆菌介导的瞬时表达

苹果‘金冠’、‘寒富’组培苗苗培养于25℃，50％湿度的光照培养箱中，昼夜长度保持为16-8h，光照强度为200μmol·m-²·s-¹。待植株5-6片真叶展开时对每个单株编号并取一片真叶保存后进行农杆菌注射。农杆菌注射方法参见Bai等(Bai>

(1)预培养：YEP 2ml(50mg/L Km，20mg/L Rif)，农杆菌菌斑或甘油菌28℃，180rpm培养过夜。

(2)本培养：YEP培养基4ml(加对应的抗生素和10μM乙酰丁香酮)，加入1/50体积的菌液(80μL)，28℃180rpm培养12-16h。

(3)室温10000rpm，1min离心，除去培养基，用1-2ml悬浊液悬浮菌体(可以涡旋震荡)。

取10μL菌液加入990μL悬浊液中，用分光光度计测定OD₆₀₀，将菌体悬浊液调整至OD₆₀₀＝1.0。室温静置2-5h。

悬浊液：(10mM MES-KOH(pH5.2)，10mM MgCl₂,100μM乙酰丁香酮)。

(4)菌液使用前涡旋震荡或用枪吸打悬浮菌体，用没有针头的1ml注射器吸取菌液。

(5)避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，用装有菌液的注射器压住小孔，另一只手的手指在叶片反方向压住小孔，慢慢用力，将菌液注射入叶片中，注射好的部分的颜色会变浅。每个叶片注射1-2个孔。

(6)4天观察。

实施例3感病品种和抗性品种Md-MIRLn12-277启动子序列的克隆及启动活性比较

ALT1接种苹果‘寒富’和‘金冠’组培苗叶片，接菌48小时后检测发现，感病品种‘金冠’Md-miRLn12及Md-MIRLn12-277表达上升，而抗性品种‘寒富’Md-miRLn12及Md-MIRLn12-277均表达较低。故克隆了Md-MIRLn12-277启动子区，发现感病品种‘金冠’和抗性品种‘寒富’存在三个SNP差异位点，分别是-1506bp(C-T)，-1186bp(G-T)和-175bp(A-G)。(图4)

分别将抗性品种‘寒富’和感病品种‘金冠’Md-MIRLn12-277启动子融合GUS后，分别构建到载体pCAMBIA1305上，农杆菌介导的瞬时表达‘金冠’和‘寒富’苹果组培苗叶片，检测结果表明，感病品种Md-MIRLn12-277启动子具有较强启动子活性，而抗性品种Md-MIRLn12-277启动子活性较弱。(图5)

当突变-1186bp(G-T)时，抗性品种Md-MIRLn12-277启动子活性恢复；感病品种Md-MIRLn12-277启动子-1186bp处的G突变成抗性品种的T后融合GUS，分别构建到载体pCAMBIA1305上，分别农杆菌介导的瞬时表达‘金冠’苹果组培苗叶片，4天后接菌，接种48小时后检测表明，感病品种Md-MIRLn12-277启动子则活性下降。证明抗性品种Md-MIRLn12-277启动子-1186bp处(T-G)的碱基替换导致其活性下降。(图6)

GUS染色方法如下：

苹果植株放入含有0.2M>2PO₄·2H₂O，0.2M>2PO₄·12H₂O，100mM>

GUS活性检测方法如下：

(1)取新鲜的植物组织100mg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80℃冰箱。

(2)将研磨破碎的组织转到EP管里，并立即加入1ml的GUS提取缓冲液，充分混匀。

(3)12 000rpm，4℃离心5min，将上清转至另一洁净的EP管，冰上放置待用。

(4)取7个EP管，分别加入0μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl的BSA标准液，用水补至相同体积20μl。加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以蛋白浓度(mg/ml)对吸收值A595做标准曲线。

(5)取待测蛋白样品10μl，加10μl水，加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。代入公式，求出蛋白样品的浓度。

(6)取100μl蛋白上清，加入400μl 37℃预热的GUS提取缓冲液里，再加入500μlMUG底物，37℃温浴。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200ul加入到800ul反应终止液，室温避光保存。

(7)用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。

(8)以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。

(9)用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。

实施例4 SNP引物的开发与利用

本实施例中的苹果属35个苹果品种采自辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家果树种质资源圃长势一致叶片。

1、基因组DNA提取

(1)1g叶片液氮研磨，转入一个2.0mL离心管中，加入800μl2×CTAB(2％CTAB，10mMTris-HCl，1.4M NaCl，1％PVP)，稍振荡混匀，放于65℃水浴中20-40min，期间轻摇几次。

(2)降至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，室温12000rpm离心10分钟。

(3)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，12000rpm离心10分钟。

(4)上清中加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min。

(5)12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗两次，晾干沉淀，溶于适量双蒸水中。

(6)若需要，按100μl加1μl RNA酶比例进行去RNA处理，37℃30分钟。用CI抽提一遍。

再用乙醇沉淀，沉淀溶于适量双蒸水中。

(7)1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，紫外分光光度计测260nm处吸光度计算DNA浓度。

2、Md-MIRLn12-277启动子序列克隆

根据苹果基因组(https://www.rosaceae.org/)Md-MIRLn12-277启动子序列(MDC008796.277)设计引物。

使用的引物序列如下：

上游引物：5’-AACACAGGGAGCACTTCTATTG-3’

下游引物：5’-GTCCGTTATTATACGAATAATTGG-3’

上述引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成。

PCR反应体系：2×Taq MasterMix(Dye)(北京康为世纪生物科技有限公司,CW0682A)。

PCR反应程序如下：

94℃预变性3min；94℃40s，61℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸2min。

PCR产物检测：根据目标片段大小制作1％琼脂糖凝胶，0.1％TAE电泳缓冲液，70-110v电压电泳约15min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物片段大小，结果见图7。

3、目的片段琼脂糖凝胶回收

使用AXYGEN公司回收试剂盒，方法参照说明书。

(1)切取含有目的DNA片断的琼脂糖，尽量切除多余凝胶，加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，间断混合，直至凝胶块完全熔化。

(2)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

(3)将混合液转移到DNA制备管(2ml离心管)中，12,000×g离心60s，倒掉收集管中的废液，重复操作一次。

(4)将制备管置回2ml离心管，加入500μl Buffer W1,12,000×g离心30s，倒掉收集管中的废液。

(5)将制备管置回2ml离心管，加入700μl Buffer W2,12,000×g离心30s，倒掉收集管中的废液。以同样的方法再用700μl Buffer W2,12,000×g离心60s。

(6)将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心60s。

(7)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25-30μl已加热至65℃的Eluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心60s洗脱DNA。

送中美泰和生物技术(北京)有限公司进行测序，测序结果显示目的片段均为1563bp。

4、Md-MIRLn12-277启动子序列生物信息学分析

利用DNAMAN(Lynnon BioSoft)和BioEdit等软件进行多序列比对分析和测序峰图分析，判断不同苹果栽培品种对苹果斑点落叶病抗性。抗性品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处为T，测序峰图为T单峰；中性品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处G和T同时存在，测序峰图为G和T套峰；感病品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处为G，测序峰图为G单峰。(表1，图8)

表1

感病品种‘金冠’和抗性品种‘寒富’Md-MIRLn12-277启动子序列比较结果见图4。从图4可知，两条序列共有3个碱基不同，其中378bp处碱基是与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记，此处碱基为T的苹果品种对苹果斑点落叶病的抗性显著高于此处碱基为G的苹果品种。

采用荧光定量PCR法，设计如下引物，检测了35个苹果栽培品种中Md-miRLn2与Md-MIRLn12-277接菌ALT1后表达量，与品种抗斑点落叶病能力相符。抗性品种中，接菌ALT1后Md-miRLn12与Md-MIRLn12-277的表达量较低；感病品种中，接菌ALT1后Md-miRLn12与Md-MIRLn12-277的表达量较高(图9)。

荧光定量PCR使用的引物：

Md-miRLn12颈环引物：5’-GTCACATCGTATCGTGAAGCTGCGCAGCTGATGTGACAGGGAGCA-3’

Md-miRLn12荧光定量引物：F 5’-TGCACTAGCGTGTTTGAACAAG-3’和R 5’-ACATCGTATCGTGAAG-3’

内参5srRNA颈环引物：5’-GTCACATCGTATCGTGAAGCTGCGCAGCTGATGTGACTGGATTGG-3’

5srRNA荧光定量引物：F 5’-TGCACTAGCGTGTAGAGGAACC-3’和R 5’-ACATCGTATCGTGAAG-3’

Md-miRLn12初级转录本Md-MIRLn12-277荧光定量引物：

F 5’-TGCCGTGACCAAAGCCACATAC-3’

R 5’-TACTCTCTCTCCGTAAATCCATTGG-3’。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP161118679.3

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1563

<212> DNA

<213> 苹果

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> n为c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (378)..(378)

<223> n为g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1388)..(1388)

<223> n为a或g

<400> 1

aacacaggga gcacttctat tgatttcaaa tcttagggac cacttctatt gatttnaaat 60

cttagtgact aaagtgagga gttatgcaaa tctcaaaggc cattttggtt aaaaagcctt 120

gaaaatattt gttaatacta cctttcatca tcaattgagg actttgaaaa tatttttttg 180

gggaaataag tcaaaataat tatttttgaa atctaaattt gctaaaatga ttagtctttc 240

aatatgtcgt caatatttag tctttcaata tgtcatcgat atttagcctt tcaatatgtc 300

gttgatatat aattttgatc agtttagcaa atgagatttg atttctaatc attttagccc 360

accttcctca gattgttntg gttgtatata gaaattatga tccaatataa atgagaattc 420

aaaaactaga actactgaac cagtttgatc ggatgaatat ctagaaatgg agatcaagtt 480

aaattaccat ataaaccaaa attttatgtt aatgtatgat gaacatcaaa attataattt 540

acatatataa gcctttgcta cggctagagt taacttatgc tacaagtaag aattctactg 600

taatacattg gaaaatgtaa actgccattt gaactccagt tgaaattaac cctctgaact 660

attttttttt gttaagttaa cctcctgaac tatttgaaat aagccagttg accccttgtt 720

ggtagatttc atctactatt tcatcaaatt caaaggaaga ttagtctttt cttcatcaat 780

tcttacttgt caactataac caacaatgta attatgacat gtgaaaacgg acaatgtaaa 840

catttgattt ttttatgttt cctcagtatg ttatatattt ttgaattaat ttgtgtccat 900

gtgtcaaaat tttattggcg gttatagctg acaagtaaca attaatgatg aaatgactaa 960

tttgtccttg aatttgatag aattgattcc gcaatctaac ggtaatgggt taattgactg 1020

attttaaata gttcgggggg ttaatttacc aaaaaaatag tttaaagggg gtcaaattca 1080

actgggatga tagttcaggg tcaaaccgca ctttacccac attggaatac attgatgcag 1140

agcttccgcc gatcgataga tcttttgtga acgtatttaa actcagttcg gtcatgcaat 1200

tccaagaaat gtatagattg gagcatatac cagatcaagt gcaagtgcaa ctactttatc 1260

cagataacaa atataaacga gtaatgctac atttattatc tacttgtatc ataatttata 1320

tgattcgcaa acgtatgtga atcatctctc tattagaaaa atgaacaaat aaataggtaa 1380

gaataatntt tttttaatat aaattcatca ttcatttaca ccgcatcgtc acatgcgacg 1440

tttcaatcag tcaacttatc acatagattc ttaatataat tctatcgtgg tcaaataaaa 1500

aagcaatgtg aaatcgatca atggaattat aaattccttc caattattcg tataataacg 1560

gac 1563

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacacaggga gcacttctat tg22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtccgttatt atacgaataa ttgg24

<210> 4

<211> 1582

<212> DNA

<213> 苹果

<400> 4

gacacttcaa ttattggaca gttcgtttct tcttggaaac gtcctgcaat ctgagtcaac 60

ccacagagcg aagtaaataa ataaaatgga gcatttctgc tcaccatcgt tgatatggtg 120

aatgtcgtta tacagctaat catttgtcat gtgttatttc atttaatttt agtgaacttt 180

catattaaat gttatttttt taaattaaaa aaaataacca aagttaaata aaatgacacg 240

tagtagataa ttaagtttac gataaaatta agatggtgaa caaaaatact ctctaaataa 300

aagtgtattt gaaaggtctt ctaacaacgg caacaacaac tacaaaataa taacaatgaa 360

agcgtagtgg gcgacctcaa caaacaaacc tttggtcctt tttcgtttca tgattccatt 420

tccctagtcc gaatacacag taaggagaaa acaaaaaagt cttaggaaat taaaacaaaa 480

gtacagagaa aacaacaagt tttaggaaat caaacttctc aataagggac tatgatcatg 540

ataaaacatc atacaggaca aagtacagta gaggattttg ttttgattcg ttcaataatt 600

gttgcagcca attaactgcc atgacttcgt ttaggaaacc aggcagctcg gaccccttcc 660

tttgacttct tgatcttgac aaaacatttt agccaaggtg gttttcccac atcctccagc 720

agcagtcrgc acaagcatag acaccttttc atccttaagg agcttcatct tcaactcctt 780

caacggcaaa tccaacctga ctgtaactga tggcggttca ggcaccagac gaacacttca 840

ccttttgtgg ctgattagat tagtttttat caccaaactc tcttctattc gagagagaat 900

caaagtttcc ctaaatatgt atgtggattc agtcgtaatg ggtgctctga gaacggcatt 960

tcaaatgctg gttgatgctr taaaatcagt gcaggaggag aatacagtgt tccaacacct 1020

cctgagagac atcaaatcta cactggactc tctacaacca ctcataaaaa aatataacgc 1080

gaaagaggga ctataaaatt ttgcaataca gacagaggag ggagcaaatc ttgttcaaaa 1140

gtccacacgc caactttgct gcacttttga acaagatttg ctccctcctc catctgtatt 1200

gcaaatttgc agtccctctt tcgggttata tttttttatg agtggttgta gagagtcaag 1260

tgtggatttg atgtttctgg ggaggtgttc gaacattgta ttctcctcct cagctggttt 1320

cacagcacaa accgcattta aaatgccgtg accaaagcca catacataat tacgaaaaga 1380

aagagactca aaactcaatt ctcttacata atctgatgaa agaacagaaa ttccaatgga 1440

tttacggaga gagagtaaaa taatctagct tgatgagaaa ctgaggatgt tatgtaagtt 1500

gtttcttcgc gactcggagt ttcagcacac atatatacaa ctcaacgaac gtgttgacca 1560

aataaaaaac acaacgagtt ga1582

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果

<400> 5

uuugaacaag auuugcuccc u 21

<210> 6

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaacttgttc tcataaacga gggagttgtt gttgttatgg tctaatttaa atatggtcta 60

aagaagaaga ataaacttgt tctcataaac gagggagttg ttgttgttat ggtctaattt 120

aaatatggtc taaagaagaa gaataaactt gttctcataa acgagggagt tgttgttgtt 180

atggtctaat ttaaatatgg tctaaagaag aagaataaac ttgttctcat aaacgaggga 240