一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用

摘要

本发明公开了一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用。本发明的引物组合，由序列1至6所示的6条单链DNA分子组成。本发明还保护所述引物组合在鉴别人参、西洋参和三七中的应用。本发明提供的检测方法对人参、西洋参、三七中任意两者相互掺伪的检出限均达到1％，满足中药生产检验的需求。本发明可用于人参、西洋参、三七的根、根茎、叶、花、果实及其加工制品的鉴别。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用。

背景技术

人参属(Panax L.)植物是名贵的药用植物，全属植物均作药用。《中国药典》收载的有6种，包括人参、西洋参、三七、竹节参、珠子参、羽叶三七。其中人参、西洋参、三七是人参属最主要的药用及功能性食品品种，其根、根茎、叶、花、果实等均做药用，价值很高。在中医临床用药上，人参性温，功效大补元气、固脱生津、安神；三七性温、味甘微苦，功效散瘀止血、消肿定痛；西洋参性凉，功效补气养阴、清热生津。三者药效具有很大区别，不能混用。然而，由于人参、三七、西洋参为人参属近缘物种，形态和化学成分相似，市场有掺杂混用现象发生，尤其是市场常见人参、西洋参饮片或人参花、西洋参花、三七花相互掺杂的情况，对用药安全造成损害，需要建立准确、可靠、特别是能同时检测是否存在相互掺杂的鉴定方法。

目前虽然分别有人参、西洋参特异性分子标记及其检测方法的报道，但这些技术只关注人参属真伪品的鉴定，无法鉴定是否存在掺杂品，对市场实际存在的花、叶、饮片类掺杂样品需要进行多次PCR反应才能判定。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用。

本发明提供了一种引物组合，由引物对I、引物对II和引物对III组成；

所述引物对I由引物F1和引物F2组成；

所述引物F1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物F2为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物对II由引物F3和引物F4组成；

所述引物F3为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物F4为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物对III由引物F5和引物F6组成；

所述引物F5为如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物F6为如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物组合的用途为如下(b1)至(b6)中的任意一种：

(b1)鉴别人参、三七和西洋参；

(b2)制备用于鉴别人参、三七和西洋参的试剂盒；

(b3)鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参；

(b4)制备用于鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参的试剂盒；

(b5)鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参；

(b6)制备用于鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参的试剂盒。

本发明还保护所述引物组合的应用，如下(b1)至(b6)中的任意一种：

(b1)鉴别人参、三七和西洋参；

(b2)制备用于鉴别人参、三七和西洋参的试剂盒；

(b3)鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参；

(b4)制备用于鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参的试剂盒；

(b5)鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参；

(b6)制备用于鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参的试剂盒。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)鉴别人参、三七和西洋参；

(c2)鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参；

(c3)鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护鉴别由单一原料加工的待测药材的原料为人参、三七还是西洋参的方法，为如下方法I或方法II。

所述方法I包括如下步骤：提取待测药材基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有227-267bp的DNA片段、待测药材的原料为人参，如果扩增产物中含有472-512bp的DNA片段、待测药材的原料为三七，如果扩增产物中含有1068-1108bp的DNA片段、待测药材的原料为西洋参。

所述方法II包括如下步骤：检测待测药材基因组DNA中是否含有所述引物组合中的引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测药材的原料为人参，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测药材的原料为三七，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测药材的原料为西洋参。

所述待测药物的原料为人参、三七或西洋参的根、叶、花、茎或种子。

本发明还保护鉴定由单一原料加工的待测药材的原料是否为人参、三七或西洋参的方法，为如下方法III或方法IV或方法V。

所述方法III包括如下步骤：提取待测药材的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果采用扩增产物中含有227-267bp的DNA片段、待测药材的原料为人参，如果扩增产物中含有472-512bp的DNA片段、待测药材为三七，如果扩增产中含有1068-1108bp的DNA片段、待测药材的原料为西洋参，如果扩增产物中不含有227-267bp的DNA片段、472-512bp的DNA片段或1068-1108bp的DNA片段、待测药材的原料为非人参且非三七且非西洋参。

所述方法IV包括如下步骤：提取待测药材的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测药材的原料为人参或三七或西洋参，如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测药材的原料为非人参且非三七且非西洋参。

所述方法V包括如下步骤：检测待测药材的基因组DNA中是否含有所述引物组合中的引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测药材的原料为人参，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测药材的原料为三七，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测药材的原料为西洋参，如果所述基因组DNA中不含有引物对I、引物对II或引物对III的靶序列、待测的原料为非人参且非三七且非西洋参。

所述待测药材的原料具体可为人参、三七、西洋参、竹节参、珠子参或羽叶三七的根、叶、花、茎或种子。

本发明还保护鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参的方法，为如下方法VI或方法VII或方法VIII。

所述方法VI包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有227-267bp的DNA片段、待测样品中含有人参，如果扩增产物中含有472-512bp的DNA片段、待测样品中含有三七，如果扩增产物中含有1068-1108bp的DNA片段、待测样品中含有西洋参，如果扩增产物中不含有227-267bp的DNA片段、472-512bp的DNA片段或1068-1108bp的DNA片段、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参。

所述方法VII包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测样品中含有人参或三七或西洋参，如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参。

所述方法VIII包括如下步骤：检测待测样品的基因组DNA中是否含有所述引物组合中的引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测样品中含有人参，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测样品中含有三七，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测样品中含有西洋参如果所述基因组DNA中不含有引物对I、引物对II或引物对III的靶序列、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参。

本发明还保护所述引物对II或引物对III。

本发明还保护所述引物对II在制备试剂盒甲中的应用。

所述试剂盒甲的用途为如下(d1)或(d2)：

(d1)鉴定待测药材是否为三七；

(d2)鉴定待测样品中是否含有三七。

本发明还保护所述引物对III在制备试剂盒乙中的应用。

所述试剂盒乙的用途为如下(d3)或(d4)：

(d3)鉴定待测药材是否为西洋参；

(d4)鉴定待测样品中是否含有西洋参。

本发明还保护含有所述引物对II的试剂盒甲。

所述试剂盒乙的用途为如下(d1)或(d2)：

(d1)鉴定待测药材是否为三七；

(d2)鉴定待测样品中是否含有三七。

本发明还保护含有所述引物对III的试剂盒乙。

所述试剂盒乙的用途为如下(d3)或(d4)：

(d3)鉴定待测药材是否为西洋参；

(d4)鉴定待测样品中是否含有西洋参。

以上任一所述的PCR扩增退火温度为60℃。

以上任一所述PCR扩增的反应体系具体可为：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μLdNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板(DNA含量为0.032g-20ng)，16.3μL无菌双蒸水。

所述DNA含量具体可为10ng。

以上各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为5μM。

以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。

以上任一所述227-267bp的DNA片段具体可为247bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列7所示的DNA分子。

以上任一所述472-512bp的DNA片段具体可为492bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列8所示的DNA分子。

以上任一所述1068-1108bp的DNA片段具体可为1088bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列9所示的DNA分子。

以上任一所述待测样品具体可为人参、三七、西洋参、竹节参、珠子参或羽叶三七的根、叶、花、茎、种子、加工制品或其他类型的药材。

真伪掺杂品的鉴别一直是中药鉴别的难点问题，依赖于具有同时检测真伪品特异性标记的方法的开发。多重PCR是一种在同一体系内进行多个PCR扩增的技术，其突出优势是在一次检测中同时表征多个位点或基因片段，从而具有掺杂检测的潜力。此前的人参属多重PCR鉴别方法往往只关注于能否同时检测人参、西洋参、三七物种，对每种药材均需要两对引物的扩增结果才能判定，无法用于鉴定是否存在掺杂样品。本发明对多批人参、西洋参、三七及其他近缘物种进行了实验验证，包含根、叶、花、种子和不同类型的药材，结果所有人参、三七、西洋参均获得正确的阳性鉴别结果，其他人参属近缘物种均为阴性，与形态学鉴定结果完全吻合，进一步验证了本发明的可靠性和稳定性。为检测该方法对混伪品的鉴别能力，本发明制作了一系列不同掺伪程度的人参、西洋参、三七混合样品并进行多重PCR扩增，结果对人参、西洋参、三七中任意两者相互掺伪的检出限均达到1％，满足中药生产检验的需求。本发明可用于人参、西洋参、三七的根、根茎、叶、花、果实及其加工制品的鉴别。

附图说明

图1为退火温度优化实验结果。其中，各温度泳道1和泳道2为西洋参样本(表1中的序号为16、17)；泳道3和4为三七样本(表1中的序号为10、11)；泳道5和6为人参样本(表1中的序号为1、2)；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图2为PCR鉴定方法验证结果。其中，泳道1-7为人参(表1中的序号为1-7)；泳道8-13为三七(表1中的序号为10-15)；泳道14-20为西洋参(表1中的序号为16、17、18、19、20、20、20)；泳道21为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的1/3，西洋参样本质量占混合样本质量的1/3，三七样本质量占混合样本质量的1/3)；泳道22为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的49.75％，西洋参样本质量占混合样本质量的0.5％，三七样本质量占混合样本质量的49.75％)；泳道23为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的0.5％，西洋参样本质量占混合样本质量的49.75％，三七样本质量占混合样本质量的49.75％)；泳道24为以水做模板的空白对照；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图3为人参、三七、西洋参相互掺伪样品PCR鉴别检出限。其中，泳道1为人参；泳道9为三七；泳道17为西洋参；泳道2-8、泳道10-16、泳道18-24为人参、三七、西洋参以不同质量比混合的混合样本，人参、三七、西洋参占混合样本质量的百分比为：泳道2(50％、12.5％、12.5％)，泳道3(80％、10％、10％)，泳道4(90％、5％、5％)，泳道5(95％、2.5％、2.5％)，泳道6(98％、1％、1％)，泳道7(99％、0.5％、0.5％)，泳道8(0％、50％、50％)，泳道10(12.5％、50％、12.5％)，泳道11(10％、80％、10％)，泳道12(5％、90％、5％)，泳道13(2.5％、95％、2.5％)，泳道14(1％、98％、1％)，泳道15(0.5％、99％、0.5％)，泳道16(50％、0％、50％)，泳道18(12.5％、12.5％、50％)，泳道19(10％、10％、80％)、泳道20(5％、5％、90％)，泳道21(2.5％、2.5％、95％)，泳道22(1％、1％、98％)，泳道23(0.5％、0.5％、99％)，泳道24(50％、50％、0％)；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为5μM。

10×buffer缓冲液：Takara公司，产品目录号：A1101E。

SpeedStar HS Taq DNA聚合酶：Takara公司，5U/μL，产品目录号：RR070A。

100×SYBR Green I：Invitrogen公司，产品目录号：1135054。

人参：参考文献：张均田.人参研究的最新进展[J].江苏大学学报医学版，2009，19(3)：185-191.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。

西洋参：参考文献：王筠默.西洋参药理作用研究的最新进展[J].中药药理与临床，2001，13(4)：46-48.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。

三七：参考文献：杨志刚，陈阿琴，俞颂东.三七药理研究新进展[J].上海中医药杂志，2005，39(4)：59-62.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。

竹节参：参考文献：左锐，袁丁.竹节参化学成分和药理活性研究进展[J].时珍国医国药，2005，16(9)：838-839.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。

珠子参：参考文献：赵仁，赵毅，李东明，等.珠子参研究进展[J].中国现代中药，2008，10(7)：3-6..；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。

羽叶三七：参考文献：赵毅，赵仁，山学祥，等.羽叶三七植物性状及生长动态分析[J].云南中医学院学报，2012，35(2)：24-27.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。

以下实施例中的人参属植物材料及其来源见表1。表1中的样品均符合中国药典(2015年版)一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味样品实物与名称相符，质量符合标准。所有植物材料均经过减压干燥后使用球磨粉碎机粉碎至能过五号筛，得到植物材料粉末用于检测。

表1人参属植物材料来源表

实施例1、引物设计

对各种人参属物种的基因组进行大量序列分析，获得了用于鉴定人参、三七和西洋参的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定人参、三七和西洋参的三套引物对。

用于鉴定人参的引物对(引物对I)由引物F1和引物F2组成(5’→3’)：

F1(序列表的序列1)：TAACAATACCGGGCTGATAC；

F2(序列表的序列2)：CCAGTTAAGGACAGGAG；

用于鉴定三七的引物对(引物对II)由引物F3和引物F4组成(5’→3’)：

F3(序列表的序列3)：AGGGATGAGGGGTGCGTAG；

F4(序列表的序列4)：CGACATGAGAAGAGGGCTTTTA；

用于鉴定西洋参的引物对(引物对III)由引物F5和引物F6组成(5’→3’)：

F5(序列表的序列5)：AAATGCGGGTTATGACAAA；

F6(序列表的序列6)：TTCTGCATATACGCCCAAATT。

引物对I、引物对II和引物对III组成引物组合。

实施例2、鉴定方法优化

一、退火温度优化

待测样本为：人参(表1中的序号为1和2)、三七(表1中的序号为10和11)、西洋参(表1中的序号为16和17)。

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、取步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行PCR扩增。

PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μLSpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板(DNA含量为10ng)，16.3μL无菌双蒸水。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。

分别设置如下退火温度：

退火温度I：59℃；

退火温度II：60℃；

退火温度III：61℃；

退火温度IV：62℃。

3、将步骤2得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

结果如图1所示。结果表明退火温度为60℃-62℃时人参、三七、西洋参分别出现约247bp、492bp以及1088bp大小的特异性条带，无非特异性扩增及假阳性条带出现，但61℃以上时人参、三七特异性条带亮度明显降低，因此确定PCR最佳退火温度为60℃。

二、引物用量优化

待测样本为：人参(表1中的序号为1和2)、三七(表1中的序号为10和11)、西洋参(表1中的序号为16和17)。

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、取步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行PCR扩增。

PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，引物F1，引物F2，引物F3，引物F4，引物F5，引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板(DNA含量为10ng)，无菌双蒸水加至25μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。

分别设置不同的引物加入量。设置方法如表2所示，按照表2所示的3个因素(F1、F2加入量，F3、F4加入量，F5、F6加入量)设置64个处理组。

表2引物加入量

F1、F2加入量(μL)F3、F4加入量(μL)F5、F62加入量(μL)0.10.10.10.20.20.150.30.30.20.40.40.25

3、将步骤2得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

结果显示，最佳引物加入量为F1、F2各0.3μL，F3、F4各0.2μL，F5、F6各0.25μL。

实施例3、鉴定方法建立

一、琼脂糖凝胶电泳法

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物。

PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.3μL引物F1，0.3μL引物F2，0.2μL引物F3，0.2μL引物F4，0.25μL引物F5，0.25μL引物F6，0.2μLSpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板DNA，17.2μL无菌双蒸水。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。

3、将步骤2得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据结果进行如下判断：

如果扩增产物中含有247bp的DNA片段，则待测样本中含有人参，如果扩增产物中不含有247bp的DNA片段，则待测样本中不含有人参；

如果扩增产物中含有492bp的DNA片段，则待测样本中含有三七，如果扩增产物中不含有492bp的DNA片段，则待测样本中不含有三七；

如果扩增产物中含有1088bp的DNA片段，则待测样本中含有西洋参，如果扩增产物中不含有1088bp的DNA片段，则待测样本中不含有西洋参。

二、荧光染色法

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物。

PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.3μL引物F1，0.3μL引物F2，0.2μL引物F3，0.2μL引物F4，0.25μL引物F5，0.25μL引物F6，0.2μLSpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板DNA，17.2μL无菌双蒸水。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。

3、向步骤2得到的PCR扩增产物中加入1μL 100×SYBR Green I，于362nm紫外波长下检测荧光，根据结果进行如下判断：

如果扩增产物加入1μL 100×SYBR Green I后进行检测可以产生绿色荧光，则待测样本中含有人参或三七或西洋参，如果扩增产物加入1μL 100×SYBR Green I后进行检测不能产生绿色荧光，则待测样本中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参。

实施例4、鉴定方法验证

待测样本：表1中的人参属植株材料。

分别采用实施例3建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法对待测样本进行鉴定，PCR反应体系中，模板的DNA含量均为10ng。

部分采用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定的结果见图2。将图1中泳道1-7的247bp的目的条带测序，测序结果均如序列7所示。将图1中泳道8-13的492bp的目的条带测序，测序结果均如序列8所示。将图1中泳道14-20的1088bp的目的条带测序，测序结果均如序列9所示。混合样本均得到247bp、492bp和1088bp的三条目的条带。其余样本(竹节参、珠子参和羽叶三七)均未得到条带。结果表明，采用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定的结果均与实际情况相符，检测准确率高达100％。

采用荧光染色法进行鉴定的结果均与实际情况相符，检测准确率高达100％。

综上所述，采用实施例3建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法均能够成功鉴定人参、三七和西洋参三种人参属植物材料。

实施例5、灵敏度

待测样品为：表1中编号为1的人参样本、编号为5的10的三七样本、编号为16的西洋参样本。

1、提取待测样品的基因组DNA，得到DNA溶液；

2、用ddH₂O稀释步骤1得到的DNA溶液，得到各稀释液；

3、取步骤2到的各稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合分别按照实施例3中的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法进行鉴定；

由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：

反应体系1中，待测样品基因组DNA初始含量为：20ng；

反应体系2中，待测样品基因组DNA初始含量为：4ng；

反应体系3中，待测样品基因组DNA初始含量为：0.8ng；

反应体系4中，待测样品基因组DNA初始含量为：0.16ng；

反应体系5中，待测样品基因组DNA初始含量为：0.032ng。

结果显示，模板DNA含量最低为0.032ng时，采用实施例3建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法均能够成功鉴定人参、三七、西洋参三种人参属植物材料。

实施例6、掺伪检测限

待测样本为：人参(表1中的序号为1)、三七(表1中的序号为10)、西洋参(表1中的序号为16)。

1、取待测样本粉末，以不同质量比混合，得到混合样本。

2、取待测样本和步骤1得到的混合样本，提取基因组DNA，得到DNA溶液。

3、分别采用实施例3建立的琼脂糖凝胶电泳法对步骤2得到的DNA溶液进行鉴定，PCR反应体系中，模板的DNA含量均为10ng。

结果如图3所示。结果表明，利用本发明的方法鉴定掺伪混合样本，人参的质量占混合样本质量的0.5％以上即可检出，三七的质量占混合样本质量的1％以上即可检出，西洋参的质量占混合样本质量的0.5％以上即可检出。

综合上述结果表明，利用本发明的方法对人参、西洋参、三七中任意两者相互掺伪的检出限均达到1％。

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用

<160> 9

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

taacaatacc gggctgatac 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ccagttaagg acaggag 17

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

agggatgagg ggtgcgtag 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

cgacatgaga agagggcttt ta 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

aaatgcgggt tatgacaaa 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ttctgcatat acgcccaaat t 21

<210> 7

<211> 247

<212> DNA

<213> 人参（Panax ginseng C. A. Mey.）

<400> 7

taacaatacc gggctgatac agtctggtaa ttggaatgag tacaatctaa atcccttaac 60

gaggatccat tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaattccag ctccaatagc 120

gtatatttaa gttgttgcag ttaaaaagct cgtagttgga ctttgggttg ggtcggccgg 180

tccgcctctc ggtgtgcacc gatcgtctcg tcccttctgc cggcgatgcg ctcctgtcct 240

taactgg 247

<210> 8

<211> 492

<212> DNA

<213> 三七（Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen）

<400> 8

agggatgagg ggtgcgtagg ctccccaagt tgcaaaccca tggtcgggga ccgcccttgg 60

gtggccctcg tccgaacaac gaccccccgg cgcggaatgc gccaaggaaa tcaaattgaa 120

cygcacgcgt cccccccgtt tgcgggcggc ggaagcgtct ttctaaaaca caaacgactc 180

tcggcaacgg atatctcggc tctcgcatcg atgaagaacg tagcgaaatg cgatacttgg 240

tgtgaattgc agaatcccgt gaatcatcga gtctttgaac gcaagttgcg cccgaagcca 300

ttaggccgag ggcacgtctg cctgggcgtc acgcatcgcg tcgcccccca acccatcatt 360

ccctcgcggg agtcgatgcg gaggggcgga taatggcctc ccgtgtctca ccgcgcggtt 420

ggcccaaatg cgagtccttg gcgatggacg tcacgacaag tggtggttgt taaaagccct 480

cttctcatgt cg 492

<210> 9

<211> 1088

<212> DNA

<213> 西洋参（Panax quinquefolius L.）

<400> 9

aaatgcgggt tatgacaaaa aattcagttt actaattgtg aaacgtttaa ttgctcgaat 60

gtatcaacag aatcatttga ttctttctac taatgattct aaccaaaata gatttttgag 120

gcgcaacaag aatttgtatt ctcaaatgat atcagagggg tttgcagtca ttgtggaaat 180

tccattttat ctacaattaa aatcttccct agaaagcaaa gggatagtca aatctcataa 240

tttacgatca attcattcaa tatttccttt tttagaggac aaaatttcac atttaattta 300

tggtttagag atactaatac cctacccagt ccatctggaa atcttggttc aaactcttcg 360

ctactgggta aaagatgctt cttctttgca tttattacga ttctttctcc acgagtattg 420

taattggaat actccaaata aagccggttc ttctttttca aaaagaaatc aaagactatt 480

cttcttacta tataattctc atctatgtga atacgaatcc atcttcatct ttctccgtaa 540

ccaatcttct catttacgct caacatcttc tggaaccctt cttgaacgaa tctatttcta 600

tggaaaaata aaatatcttg taaaagtctt tgttaaggct tttcaagtca atctattgtt 660

gttgaaggat cctttcatgc attatgttag gtatcaagga aaatcaattc tcgcttcaaa 720

agggacgccc tttttgatga aaaaatggac atattacttt gttaatttat ggcaatgtca 780

tttttacctg tggtctcaac cgggaaggat ctgtataaac caattataca atcattccct 840

cgacattctg ggctatctat caagtgcgcg gctaaaccct tcaatggtac gcggtcaaat 900

gctagaaaat tcatttctaa ttgataatgc tattaataag ttcgatgcta ttgttccaat 960

tattcctctg attggatcat tggctaaagc gaaattttgt aacgtattgg ggcatcctat 1020

tagtaaggcg gtttggaccg atttatcaga ttctgatatt attgaccaat ttgggcgtat 1080

atgcagaa 1088