用于扩增人线粒体基因组高可变区的引物、方法及试剂盒

摘要

本发明提供一种对于各种来源的人线粒体基因组均能够高品质地进行PCR扩增的引物组、包含该引物组的PCR扩增用试剂盒以及使用该引物组的PCR扩增方法。本发明的引物组由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于PCR扩增的引物组。具体而言，本发明涉及用于PCR扩增人线粒体基因组的高度可变区的引物组、包含该引物组的试剂盒及使用该引物组的PCR扩增方法。

背景技术

线粒体是真核细胞内的重要细胞器，是能量产生与转换的场所，还参与脂肪酸的合成以及少量蛋白质的合成。正常的线粒体功能依赖于核基因和线粒体基因的共同作用，任一基因组中的突变都可能引起线粒体功能障碍。因此，有些情况下需要测定样本中不同线粒体(例如正常的与突变的)的比例。

人线粒体基因组是长度为16,569bp的双链环状DNA分子(也称为线粒体DNA)，由编码区和非编码区构成。其中，编码区包括37个基因。非编码区，又叫控制区或D环区(Displacement-loop region，D-Loop)，由1,122bp组成，在该区域存在有2个长度各为400bp的高度可变区，即HVI区(hypervariable region I，16,024–16,569)和HVII区(hypervariable region II，1–576)。最新研究发现，通过测序手段对编码区域和高度可变区的序列进行分析可以提高线粒体DNA数据的可靠性。

对人线粒体基因组高度可变区进行测序的前提是将该高度可变区从包含它的样本中扩增出来。如果扩增出的该高度可变区的品质不够高，这会给后续的测序用文库构建及二代测序带来不利影响。

若要高品质地扩增出的该高度可变区，扩增用引物是关键。但，对于该高度可变区而言，理论上能够作为其扩增引物的序列多如牛毛，从这些引物中选择出一组能够高品质扩增该高度可变区的引物组并非易事。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种对人线粒体基因组的高度可变区进行高品质PCR扩增的引物组、包含该引物组的PCR扩增用试剂盒以及使用该引物组的PCR扩增方法。

本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：使用由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物组成的引物组作为引物，能够高品质地对人线粒体基因组进行PCR扩增，从而完成了本发明。

即，本发明包括：

1.一种引物组，其由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据项1所述的引物组，其用于扩增人线粒体基因组的高度可变区，所述高度可变区是HVI区和HVII区。

3.一种用于扩增人线粒体基因组的高度可变区的试剂盒，其包含项1或2所述的引物组。

4.一种扩增人线粒体基因组的高度可变区的方法，其使用项1或2所述的引物组作为引物进行PCR扩增。

5.根据项4所述的方法，其使用人线粒体基因组作为模板。

6.根据项4或5所述的方法，其中，所述PCR扩增的变性温度为93℃-98℃。

7.根据项4～6中任一项所述的方法，其中，所述PCR扩增的退火温度为52℃-62℃。

8.根据项4～7中任一项所述的方法，其中，所述PCR扩增的延伸温度为72℃。

发明效果

通过使用本发明的引物组，能够对人线粒体基因组的高度可变区高品质地进行PCR扩增。

附图说明

图1为显示使用实施例1的引物组对11种人线粒体DNA样本进行PCR扩增的结果，最左侧泳道为分子量标准DL2000。

图2为使用对比例1的引物组对11种人线粒体DNA样本进行PCR扩增的结果，最左侧泳道为分子量标准DL2000。

发明的具体实施方式

在一个方面中，本发明提供一种引物组(本发明的引物组)，其由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：1

5’-ATTGGACAAGTAGCATCCG-3’

SEQ ID NO：2

5’-TGTGAGCCCGTCTAAACAT-3’

所述引物组可以在针对人线粒体基因组的高度可变区的PCR扩增中作为引物使用。在本说明书中，所述人线粒体的高度可变区是人类线粒体基因组的HVI区(hypervariable region I，16,024–16,569)和HVII区(hypervariable region II，1–576)。

在另一个方面中，本发明提供一种用于扩增人线粒体基因组的高度可变区的试剂盒(本发明的试剂盒)，其包含本发明的引物组。对于本发明的试剂盒而言，本发明的引物组是必须的，其中，上游引物和下游引物可以分别装在不同容器内，也可以装在同一容器内。除了包含本发明的引物组以外， 本发明的试剂盒还可以包含例如用于PCR扩增的其他试剂，包括但不限于选自dNTP_S、MgC1₂、Taq酶、PCR反应缓冲液、双蒸水(ddH₂O)等中的至少一种，本领域技术人员可根据需要适当选择。

本发明的引物组可适用于各种来源的人线粒体基因组的高度可变区的PCR扩增，并能够得到高品质的扩增产物。这里，“高品质”是指：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检查时，条带单一(例如目的条带占99％以上、优选99.5％以上、更优选基本上100％)、且无弥散。因此，在另一个方面中，本发明提供一种扩增人线粒体基因组的高度可变区的方法(本发明的扩增方法)，其使用本发明的引物组作为引物进行PCR扩增。

PCR(聚合酶链反应)扩增是本领域技术人员熟知的，其一般通过一定的PCR反应程序(温度循环)来实现。所述PCR反应程序一般变性、退火、延伸等步骤。

对本发明的扩增方法而言，变性步骤可以在93-98℃(优选94-96℃)进行0.1～10分钟(优选0.5～2分钟)；退火步骤可以在52-62℃(优选54-56℃)进行0.1～10分钟(优选0.5～2分钟)；延伸步骤可以在72℃进行0.1～10分钟(优选1～5分钟)；由上述变性、退火、延伸步骤组成的循环可以进行10-50次(优选25-35次)。优选地，经历上述温度循环前的模板可以在93-98℃(优选94-96℃)进行1～60分钟(优选5～20分钟)的热处理，经历上述温度循环后的扩增产物可以于4℃保温0-12小时。

本发明的扩增方法可以使用各种样本作为模板来进行。在本说明书中，样本是指：包含人线粒体基因组的高度可变区的试样。对所述样本没有特殊限制，只要其包含人线粒体基因组的高度可变区即可，样本可以是例如人线粒体基因组(线粒体DNA)，也可以是例如包含线粒体DNA的动植物组织、动植物细胞或细胞团、微生物等，具体例如血液、肝脏、肌肉组织、卵母细胞等。优选地，所述样本为人线粒体基因组。

通常可以将线粒体从包含它的样本中提取出来并进行纯化，使之成为更适于进行扩增的状态。从动植物组织、动植物细胞或微生物中提取线粒体的方法是本领域技术人员已知的(例如可以参考“王文、施立明，一种改进的动物线粒体DNA提取方法，动物学研究，1993(2)”)。此外，从线粒体中提取线粒体DNA的方法是本领域技术人员已知的(例如可以参考“臧莹安、丁发源等，从动物组织中提取线粒体的方法。中国兽医杂志，2006年(42)2:61-65”；或者参考碧云天公司细胞线粒体分离试剂盒(货号：C3601)的产品说明书)。当然，也可以不提取线粒体DNA、而直接使用所述样本本身或来自样本的线粒体进行PCR扩增。

实施例

以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是用于解释本发明，并非对本发明的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1使用本发明的引物组PCR扩增线粒体DNA的高度可变区

线粒体DNA的高度可变区的PCR扩增按下述方法进行。

根据线粒体DNA的高度可变区的全长序列，设计了一对特异性引物，核酸序列如下：

HV-F：5-attggacaagtagcatccg-3(SEQ ID NO：1)

HV-R：5-tgtgagcccgtctaaacat-3(SEQ ID NO：2)

采用上述引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应体系如表1:

表1

成分>使用量(μL)>10×buffer(Mg²⁺free)>2.5>dNTP(2.5mM)>2>MgCl₂1.5>Taq酶>0.2>HV-F>1>HV-R>1>ddH₂O>15.8>线粒体DNA(50ng/μL)>1>Total>25>

PCR反应程序：95℃10分钟；(95℃1分钟，55℃45秒，72℃2分钟)30cycles；72℃10分钟。

PCR扩增结果如图1所示。从电泳结果上可以看到，对于准备的11种人线粒体DNA样本，均扩增得到了目的条带，且条带单一、无弥散。

对比例1使用其他引物组PCR扩增线粒体DNA的高度可变区

像实施例那样，对所述11种人线粒体DNA样本进行了PCR扩增，不同的是，将扩增引物变更为

HV-F：ACTAATACACCAGTCTTGTAAA

HV-R：ATGCTTGCATGTGTAATCTTAC

PCR扩增结果如图2所示。从电泳结果上可以看到，对于所述11种人线粒体DNA样本，有些未能扩增得到目的条带，有些虽然扩增得到了目的条带，但条带不单一、有弥散。

还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征 的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

工业实用性

根据本发明，提供一种对于各种来源的人线粒体基因组均能够高品质地进行PCR扩增的引物组、包含该引物组的PCR扩增用试剂盒以及使用该引物组的PCR扩增方法。