一种溴化乙锭衍生物及其制备与在抗肿瘤中的应用

摘要

本发明公开了一种溴化乙锭衍生物及其制备与在抗肿瘤中的应用，属于医药技术领域。本发明溴化乙锭衍生物的结构通式如下所示，式中R为H或卤族元素。本发明的溴化乙锭衍生物可以实现对肿瘤细胞的靶向富集，并且具备线粒体靶向的作用，对肿瘤细胞具有良好的选择性抑制的作用，可用于制备抗肿瘤药物。本发明的溴化乙锭衍生物制备简单高效，具有极大的医用应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种溴化乙锭衍生物及其制备与在抗肿瘤中的应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，肿瘤靶向治疗是临床医学，生物医药和生命科学研究领域的重大课题。药物治疗是实现肿瘤生长抑制以及提高患者生活质量的有效方法，在肿瘤临床治疗中被广泛使用。传统的抗肿瘤药物包括阿霉素、紫杉醇、顺铂、喜树碱等。但是，这些抗肿瘤药物对肿瘤治疗的选择性较差，从而在治疗过程中导致较大的毒副作用。并且，这些治疗药物不能有效的到达作用靶点，导致较低的治疗效果。为了提高对肿瘤的治疗效果，通常采取提高给药量的方法，而进一步导致肿瘤细胞产生多药耐药，最终导致肿瘤治疗的失败。因此，提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞以及对其作用位点靶向富集的能力，开发出高效的抗肿瘤药物将极大的推进肿瘤治疗的进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种溴化乙锭衍生物及其制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种溴化乙锭衍生物，其结构通式如下所示：

其中，R为H或卤族元素，所述的卤族元素为F、Cl、Br。优选的，R为H或Cl。

所述的溴化乙锭衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)溴化乙锭(EB)溶解在体积比为0.005-0.05:0.5-2:3-5的三氟乙酸/乙腈/二氯甲烷混合溶剂中，通氮气保护，在0-4℃条件下搅拌5-10分钟。

(2)将亚硝酸钠加入到步骤(1)所得混合物中，保持0℃-4℃反应5-10分钟。

(3)将氨基磺酸加入到步骤(2)所得反应液中，保持0-4℃反应5-10分钟。

(4)将N,N-二乙基苯胺或者N,N-双(2-氯乙基)苯胺溶解在体积比为0.005-0.05:0.5-2:3-5的三氟乙酸/乙腈/二氯甲烷混合溶剂中，加入到步骤(3)所得反应液中，保持0-4℃反应60-120分钟得到溴化乙锭衍生物。

上述三氟乙酸/乙腈/二氯甲烷混合溶剂中三氟乙酸、乙腈、二氯甲烷的体积比优选为0.01:1:4。

一种上述溴化乙锭衍生物药学上可接受的盐。所述的溴化乙锭衍生物对肿瘤细胞及其亚细胞器具有良好的靶向作用，并能有效的抑制肿瘤细胞的生长。基于此，所述的溴化乙锭衍生物或其药学上可接受的盐可用于制备抗肿瘤药物。

一种抗肿瘤药物，包含上述溴化乙锭衍生物或其药学上可接受的盐，还包含所述溴化乙锭衍生物药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：本发明的溴化乙锭衍生物可以实现对肿瘤细胞的靶向富集，并且具备线粒体靶向的作用，对肿瘤细胞具有良好的选择性抑制的作用，通过改变线粒体的膜电势，提高细胞内的氧化自由基水平，降低细胞内的还原性谷胱甘肽水平，降低细胞内的ATP水平，导致线粒体内的细胞色素C的释放，最终诱导细胞凋亡。另外，此类分子制备简单高效，具有极大的医用应用价值。

附图说明

图1是化合物1的电喷雾质谱图。

图2是化合物2的电喷雾质谱图。

图3是乳腺癌细胞和非洲绿猴肾细胞用含抗肿瘤化合物2的培养基培养后以Hoechst33342标记的荧光显微图。

图4是乳腺癌细胞用含抗肿瘤化合物2的培养基培养后以MitoTracker Green标记的荧光显微图。

图5是EB、抗肿瘤化合物1和抗肿瘤化合物2分别对(A)乳腺癌细胞和(B)非洲绿猴肾细胞的细胞活性抑制图。

图6是乳腺癌细胞用含抗肿瘤化合物2的培养基培养不同时间后以JC-1染料标记的荧光显微图。图中从左至右1-4分别为：1为JC-1单体荧光共聚焦，2为JC-1聚合物荧光共聚焦，3为1和2的重叠，4为相对应的3中箭头处的JC-1的荧光强度。

图7是乳腺癌细胞用含抗肿瘤化合物2的培养基培养不同时间后以JC-1染料标记的荧光的统计分析图。图A是乳腺癌细胞经抗肿瘤化合物1或抗肿瘤化合物2处理不同时间后细胞内JC-1单体和JC-1聚合物的荧光比例，图B是乳腺癌细胞分别经EB、抗肿瘤化合物1或抗肿瘤化合物2处理6小时后细胞内JC-1单体的荧光强度。

图8是乳腺癌细胞用分别含EB、抗肿瘤化合物1和抗肿瘤化合物2的培养基培养后以DCFH-DA染料检测的荧光显微图。

图9是乳腺癌细胞用分别含EB、抗肿瘤化合物1和抗肿瘤化合物2的培养基培养后以DCFH-DA染料检测的荧光统计分析图。

图10是乳腺癌细胞用分别含EB、抗肿瘤化合物1和抗肿瘤化合物2的培养基培养后细胞内还原性谷胱甘肽的含量分析图。

图11是乳腺癌细胞用分别含EB、抗肿瘤化合物1和抗肿瘤化合物2的培养基培养后细胞内的ATP含量分析图。

图12是乳腺癌细胞用含抗肿瘤化合物1的培养基培养后胞细胞质中的细胞色素C相对含量分析图。

图13是乳腺癌细胞用含抗肿瘤化合物1的培养基培养后线粒体中的细胞色素C相对含量分析图。

图14是乳腺癌细胞用分别含EB、抗肿瘤化合物1和抗肿瘤化合物2的培养基培养后细胞内凋亡酶-3相对含量分析图。

图15是用PBS、EB、抗肿瘤化合物1或抗肿瘤化合物2治疗造瘤小鼠后小鼠培养13天内肿瘤体积随时间的变化图。

图16是用PBS、EB、抗肿瘤化合物1或抗肿瘤化合物2治疗造瘤小鼠后小鼠培养13天后的肿瘤图。

图17是用PBS、EB、抗肿瘤化合物1或抗肿瘤化合物2治疗造瘤小鼠后小鼠培养13天后的肿瘤重量图。

图18是用PBS、EB、抗肿瘤化合物1或抗肿瘤化合物2治疗造瘤小鼠后小鼠培养13天内的小鼠体重随时间的变化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗肿瘤药物化合物1的合成：

(1)EB(230mg)溶解在50mL体积比为0.01:1:4的三氟乙酸/乙腈/二氯甲烷混合溶剂中，该混合物通氮气保护，在0℃条件下搅拌10分钟。

(2)将亚硝酸钠(150mg)加入到步骤(1)所得混合物中，保持0℃条件下搅拌反应5分钟。

(3)将氨基磺酸(200mg)加入到步骤(2)所得反应液中，保持0℃条件下搅拌反应10分钟。

(4)将N,N-二乙基苯胺(200μL)溶解在2mL体积比为0.01:1:4的三氟乙酸/乙腈/二氯甲烷混合溶剂中，加入到步骤(3)所得反应液中，保持0℃搅拌反应60分钟。

(5)反应结束后，将步骤(4)所得反应液用二氯甲烷稀释，用水洗三次，将有机相收集起来，用二氯甲烷干燥过夜。

(6)将获得的产品用柱层析方法提纯，淋洗剂为体积比为1:9的甲醇/二氯甲烷混合溶剂。

(7)用电喷雾质谱表征化合物分子结构，并将获得的产品在-20℃避光条件下保存。

电喷雾质谱结果如图1所示，证明化合物1的成功合成。

实施例2

抗肿瘤药物化合物2的合成：

(1)EB(230mg)溶解在50mL体积比为0.01:1:4的三氟乙酸/乙腈/二氯甲烷混合溶剂中，该混合物通氮气保护，在0℃条件下搅拌5分钟。

(2)将亚硝酸钠(150mg)加入到步骤(1)所得混合物中，保持0℃搅拌反应10分钟。

(3)将氨基磺酸(200mg)加入到步骤(2)所得反应液中，保持0℃搅拌反应5分钟。

(4)将N,N-双(2-氯乙基)苯胺(200μL)溶解在2mL体积比为0.01:1:4的三氟乙酸/乙腈/二氯甲烷混合溶剂中，加入到步骤(3)所得反应液中，保持0℃搅拌反应60分钟。

(5)反应结束后，将步骤(4)所得反应液用二氯甲烷稀释，用水洗三次，将有机相收集起来，用二氯甲烷干燥过夜。

(6)将获得的产品用柱层析方法提纯，淋洗剂为体积比为1:9的甲醇/二氯甲烷混合溶剂。

(7)用电喷雾质谱表征化合物分子结构，并将获得的产品在-20℃避光条件下保存。

电喷雾质谱结果如图2所示，证明化合物2的成功合成。

实施例3

将乳腺癌细胞(4T1细胞)和非洲绿猴肾细胞(COS7细胞)分别以1×10⁵个细胞/孔的密度接种到共聚焦小皿中，37℃条件下在1mL>

结果如图3所示，相对于非洲绿猴肾细胞，抗肿瘤化合物2对乳腺癌细胞具有更好的富集作用，说明抗肿瘤化合物2对肿瘤细胞具有良好的靶向富集作用。

实施例4

将乳腺癌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种共聚焦小皿中，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，将抗肿瘤化合物2溶解在培养基中，向乳腺癌细胞中加入1mL含有抗肿瘤化合物2(20μmol/L)的培养基。培养2小时后，将含有抗肿瘤化合物2的培养基吸出，PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次后用线粒体染料(MitoTracker>

结果如图4所示，肿瘤细胞内抗肿瘤化合物2的荧光与线粒体染料荧光重合良好，证明抗肿瘤化合物2具有肿瘤细胞线粒体靶向的作用。

实施例5

乳腺癌细胞和非洲绿猴肾细胞分别以6000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，用100μL培养基培养24小时。然后，将用培养基配制的不同浓度的分别含EB、抗肿瘤化合物2、抗肿瘤化合物1的溶液100μL分别加入到各孔中。所有细胞在避光条件下37℃培养48小时。随后在每个孔中加入20μL 5mg/mL的MTT(MTT溶解在PBS缓冲液中)。共培养4小时后，吸出培养基，加入150μL二甲亚砜。酶标仪测量每个孔中570纳米处的吸光值，计算细胞存活率，进而得到EB、抗肿瘤化合物2、抗肿瘤化合物1对乳腺癌细胞和非洲绿猴肾细胞的毒性。

结果如图5所示，抗肿瘤化合物2、抗肿瘤化合物1对乳腺癌细胞和非洲绿猴肾细胞具有极大的毒性。并且相对于非洲绿猴肾细胞，抗肿瘤化合物2、抗肿瘤化合物1对乳腺癌细胞具有更大的毒性；抗肿瘤化合物1相对于抗肿瘤化合物2具备更大的细胞毒性。从而证明抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1对肿瘤细胞具有更高的毒性。

实施例6

将乳腺癌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在共聚焦小皿中，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，将抗肿瘤化合物(2或1)溶解在培养基中，向乳腺癌细胞加入1mL含有抗肿瘤化合物(20μmol/L)的培养基。培养1小时后，将含有抗肿瘤化合物的培养基吸出，PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次，将细胞分别再培养1小时、2小时、6小时、12小时和23小时后，用线粒体染料(JC-1)染色半小时，然后用激光共聚焦显微镜观察细胞内的JC-1荧光的分布。与此同时，用ImageJ分析细胞内JC-1荧光强度随时间的变化。

结果如图6所示，抗肿瘤化合物2与细胞作用较短时间时，肿瘤细胞线粒体膜电势没有变化，而随培养时间增加肿瘤细胞的线粒体膜的破坏增强。与此同时，如图7A所示，抗肿瘤化合物1对癌细胞线粒体膜较抗肿瘤化合物2有更强的破坏作用。因此，抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1都具备破坏线粒体膜电位的作用。

实施例7

将乳腺癌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在六孔板中，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，分别将EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1溶解在培养基中，向乳腺癌细胞中分别加入1mL含EB、抗肿瘤化合物2或抗肿瘤化合物1(20μmol/L)的培养基或者只加入空白培养基作为空白对照。培养1小时后，将含有EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1的培养基、空白培养基吸出，PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次，将细胞分别再培养6小时后，用线粒体染料(JC-1)染色半小时，然后用流式细胞仪分析细胞内的JC-1单体荧光的分布。

结果如图7B所示，抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1有更高的JC-1单体荧光，而EB几乎与空白对照组相同，从而再次证明抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1具有线粒体膜电位破坏的能力。

实施例8

将乳腺癌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在共聚焦小皿中，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，分别将EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1溶解在培养基中，向乳腺癌细胞中分别加入1mL含EB、抗肿瘤化合物2或抗肿瘤化合物1(20μmol/L)的培养基或者只加入空白培养基作为空白对照。培养1小时后，将含有EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1的培养基、空白培养基吸出，PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次，将细胞分别再培养6小时后与活性自由基探针DCFH-DA共培养半小时，然后激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度。与此同时，用ImageJ分析不同条件下细胞内荧光强度。

结果如图8所示，空白细胞和与EB共培养后的细胞中的荧光强度较低，而与抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1共培养后的细胞中的荧光强度较高，从而证明抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1具有增强细胞内活性自由基的能力。与此同时，如图9所示，与抗肿瘤化合物1作用后的细胞内的活性自由基高于与抗肿瘤化合物2作用后的活性自由基，证明与抗肿瘤化合物1具备更强的抗肿瘤作用。

实施例9

将乳腺癌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在六孔板中，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，分别将EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1溶解在培养基中，向乳腺癌细胞中加入1mL含EB、抗肿瘤化合物2或抗肿瘤化合物1(20μmol/L)的培养基或者只加入空白培养基作为空白对照。培养1小时后，将含有EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1的培养基、空白培养基吸出，PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次，将细胞分别再培养24小时后将细胞裂解，6000转/分钟离心5分钟后，取上清液50μL加入到200μL>

结果如图10所示，抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1作用后的肿瘤细胞细胞内的还原性谷胱甘肽水平明显降低，再次证明抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1具备调节细胞内氧化还原内压的能力。

实施例10

将乳腺癌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在六孔板中，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，分别将EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1溶解在培养基中，向乳腺癌细胞中加入1mL含EB、抗肿瘤化合物2或抗肿瘤化合物1(20μmol/L)的培养基或者只加入空白培养基作为空白对照。培养1小时后，将含有EB，抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1的培养基、空白培养基吸出，PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次，将细胞分别再培养24小时后将细胞裂解，用ATP检测试剂盒检测不同样品中的ATP含量。

结果如图11所示，抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1作用后的肿瘤细胞细胞内的ATP水平明显降低，证明抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1具备抑制肿瘤细胞内ATP合成的能力。

实施例11

将乳腺癌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在六孔板中，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，将抗肿瘤化合物1溶解在培养基中，向乳腺癌细胞中加入1mL含抗肿瘤化合物1(20μmol/L)的培养基或者只加入空白培养基作为空白对照。培养6小时后，将含有抗肿瘤化合物1的培养基、空白培养基吸出，PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次，将细胞分别再培养24小时后提取蛋白，western>

结果如图12所示，与抗肿瘤化合物1作用后的肿瘤细胞细胞质中的细胞色素C水平高于对照空白细胞。与此同时，如图13所示，与抗肿瘤化合物1作用后的肿瘤细胞线粒体中的细胞色素C水平低于对照空白细胞。以上结果说明，抗肿瘤化合物可以诱导细胞色素C从线粒体中释放出来。

实施例12

将乳腺癌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在六孔板中，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，分别将EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1溶解在培养基中，向乳腺癌细胞中加入1mL含EB、抗肿瘤化合物2或抗肿瘤化合物1(20μmol/L)的培养基或者只加入空白培养基作为空白对照。培养6小时后，将含有EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1的培养基、空白培养基吸出，PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次，将细胞分别再培养24小时后提取蛋白，western>

结果如图14所示，与抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1作用后的肿瘤细胞中激活凋亡酶-3的表达提高，证明抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1可以诱导肿瘤细胞程序凋亡。

实施例13

5～6周小白鼠(BALB/c)在大腿外侧皮下注射100μL含细胞个数为1×10⁶的乳腺癌细胞PBS悬液造瘤，当肿瘤体积长到约200mm³时。将小鼠随机分为4组。PBS和EB、抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1。分别在第一天和第五天注射相对的材料。每隔一天测量肿瘤体积，称量小鼠体重变化。肿瘤体积按照V＝W²×L/2公式计算，其中W为较短的肿瘤宽度，L为较长的肿瘤宽度，通过相对肿瘤体积(V/V₀，V为实时肿瘤体积，V₀为治疗前肿瘤体积)来反映肿瘤体积的变化情况。在小鼠培养到第13天后，将小鼠肿瘤剥离，分别计量小鼠肿瘤重量。

结果见图15、图16和图17，经抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1治疗后的小鼠肿瘤生长受到抑制，并且抗肿瘤化合物1相对于肿瘤化合物2有更优越的肿瘤抑制作用。与此同时，如图18所示，小鼠重量随治疗效果没有大幅变化，说明抗肿瘤化合物2和抗肿瘤化合物1对小鼠没有强毒副作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。