一种内源性β‑葡萄糖苷酶的编码基因、编码的蛋白质及其表达载体和应用

摘要

本发明公开了一种台湾乳白蚁内源性β‑葡萄糖苷酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO:1所示。该编码基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了台湾乳白蚁内源性β‑葡萄糖苷酶的编码基因的原核表达载体。本发明所述台湾乳白蚁内源性β‑葡萄糖苷酶的编码基因对温度敏感性低，经实验证实，低温与高温胁迫不会影响该基因的表达。本发明所述台湾乳白蚁内源性β‑葡萄糖苷酶的编码基因对农药胁迫作出响应，可用于研究白蚁纤维素酶基因表达调控机理；该基因编码的β‑葡萄糖苷酶可用于纤维素降解；该基因及其表达酶类可用于纤维素乙醇燃料、食品与饲料工业的开发应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因、该基因编码的蛋白质、相应的表达载体和应用。

技术背景

能源短缺是全球面临的严重问题，然而在混合燃料中所使用的绝大部分乙醇源于谷物发酵，存在与人争粮的问题。木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源（园林绿化垃圾、谷物秸秆、杂草、木屑及一些动物的固体粪便等），如果用纤维素酶生物降解木质纤维素产生还原糖，再进一步发酵产生乙醇，不仅提供了大量纤维素乙醇燃料，并且有助于生态环境的保护（邓天福等，2010）。

此外，纤维素酶在食品、纺织、饲料、洗涤剂和中草药提取等行业或领域都有应用的广泛：提高食品的品质、缩短酒精、酱油发酵时间、提高果汁提取率和促进汁液澄清（闫训友等，2004）；纤维素酶作为饲料添加剂，可明显提高饲料的营养价值，强化消化系统的酶解功能，促进动物生长发育（胡轶和孙波，2006）；改善纺织工业棉织物的手感和外观，并且基本解决了石磨水洗工艺中存在的环境污染等问题（吴大付等，2007）。纤维素是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷键组成的多聚糖，包括内切葡聚糖酶（endo-β-1,4-glucanases, EGs, EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（exo-β-1,4-glucanases, C1）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases,BGs, EC 3.2.1.21）三种主要的类型。外切葡聚糖酶水解纤维素产生纤维二糖和葡萄糖，而多数内切葡聚糖酶作用后产生纤维二糖、少量葡萄糖和纤维三糖，β-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖及低分子量的纤维寡糖的非还原端，水解生成葡萄糖（Klesov, 1991; Watanabe etal., 2010）。β-葡萄糖苷酶是降解纤维素的关键酶系。

目前从自然界中寻找高活性的纤维素酶，进行生物降解是解决纤维素酶效率和降低成本的有效途径。一些植食性昆虫特别是木食性昆虫（xylophagous insects）能通过纤维素酶高效降解纤维素类物质，并满足自身生长发育的需要（Watanabe and Tokuda,2001; 2010），如食木白蚁、天牛幼虫、木蜂幼虫及鳞翅目幼虫等。其中，白蚁（等翅目Isoptera，现有证据支持其并入蜚蠊目Blattodea）是消化纤维素最有效的昆虫类群，被认为是地球上最小的高效生物反应器（Ohkuma, 2003），每年消化的纤维素类物质总量巨大。

台湾乳白蚁（Coptotermes> Shiraki）属鼻白蚁科（Rhinotermitidae）、乳白蚁属（Coptotermes），对农林树木、建筑结构造成严重危害（Lin,1987；Rust>

目前用纤维素酶降解纤维素的工艺中，困难在于纤维素酶效率低，对环境条件要求苛刻，而且成本高，从白蚁体内挖掘新的纤维素酶基因加以利用，是解决这一问题的有效途径之一。此外纤维素酶基因作为白蚁防治药物靶标，也是未来白蚁生物防治的发展方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在不同温度下相对稳定表达的β-葡萄糖苷酶的编码基因。

本发明另一目的在于提供上述编码基因编码的蛋白质。

本发明还有一个目的在于提供上述编码基因的原核表达载体。

本发明还有一个目的在于提供上述编码基因的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO:1所示。

上述台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因所编码的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

一种原核表达载体，用于表达台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因。

本发明所述台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因对温度敏感性低，经实验证实，低温与高温胁迫不会影响该基因的表达。本发明所述台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因对农药胁迫作出响应，经试验证实，台湾乳白蚁取食吡虫啉后该基因表达第三天开始作出明显响应，第四天该基因表达量显著上调。该基因可用于研究白蚁纤维素酶基因表达调控机理；该基因编码的β-葡萄糖苷酶可用于纤维素降解；该基因及其表达酶类可用于纤维素乙醇燃料、食品与饲料工业的开发应用；该基因及其表达酶类可用作为白蚁防治的靶标。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种新的β-葡萄糖苷酶的编码基因、引物及载体。可用于纤维素的降解、纤维素乙醇燃料、食品与饲料工业的开发应用，所述β-葡萄糖苷酶的编码基因及其表达酶类可用作为白蚁防治的靶标。

附图说明

图1为基因CfBG-Ib的3’RACE和5’RACE>

图2为基因CfBG-Ib编码的氨基酸序列信号肽预测。

图3为CfBG-Ib的三维结构（注：基于模板构建的CfBG-Ib蛋白的三维结构，模板覆盖84%的氨基酸，可信度大于90%）。

图4为重组蛋白的原核表达（1、2、4是诱导的pET-32a-CfBG-Ib的原核表达，3是未诱导的pET-32a-CfBG-Ib的原核表达）。

图5为温度胁迫处理24h后CfBG-Ib基因表达水平（所有数据为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05））。

图6为温度胁迫处理24h后Glu1B基因表达水平（所有数据为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05））。

图7为吡虫啉处理后CfBG-Ib基因表达水平（所有数据为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05））。

图8为吡虫啉处理后Glu1B基因表达水平（所有数据为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05））。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步阐述。但实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

1.白蚁总RNA的提取

台湾乳白蚁总RNA的提取按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa公司）使用说明进行。

2.第一链cDNA合成

第一链cDNA的合成使用PrimeScript^TMII>

3.简并引物设计

采用CODEHOP（Consensus Degenerate Hybrid Oligonuleotide Primers）在线软件程序设计β-葡萄糖苷酶的简并引物，可以得到数对由有简并性的核苷酸链组成的简并引物序列（其中R = A/G，Y = C/T，M = A/C，K = G/T，S = C/G，W = A/T，H = A/C/T，B = C/G/T，V= A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T）。

PCR扩增后，取5µl产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测后剩余的产物用作切胶回收目的DNA片段。

PCR产物连接采用pMD^{> 18-T Vector Cloing Kit。}

质粒的转化

4.1大肠杆菌感受态细胞的制备：

1)从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3 ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜；

2)取0.5 ml上述菌液转接到含有50 mL LB液体培养基的三角烧瓶中，37℃下250 rpm摇床培养2-3 h，测定OD₅₅₀为0.6左右；

3)将菌液转移至50 ml离心管中，冰上放置10 min，然后于4℃，5000 rpm离心5 min；

4)将离心管倒置以倒尽上清液，加入25 ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl₂溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30>

5)弃上清液后，用2.5 ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl₂溶液重悬，每份100μl分装细胞，可以直接用作转化。

4.2热击法转化大肠杆菌感受态细胞：

1)取两管制备好的100 μl DH5α感受态细胞，其中一管加入10 μl连接产物，另一管作阴性对照，两管轻轻混匀后冰上放置30 min；

2) 42℃水浴中45 s进行热激转化，然后迅速放回冰中，静置3 min；

3) 向上述管中分别加入400 μl LB液体培养基轻轻混匀，37℃震荡培养1 h；

4) 在超净工作台中取上述转化混合液100 μl，滴到含氨苄青霉素（100 ug/ml）的固体LB平板上，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀后，封口膜将培养皿密封；

5) 在涂好的培养皿上做上标记， 37℃倒置过夜培养。

转化子筛选及验证

5.1 菌液PCR鉴定

在超净工作台中挑取5个单菌落，分别接种至5 ml LB液体培养基（含100 μg/ml氨苄青霉素）的10ml摇菌管中，37℃，250 rpm摇菌过夜培养，至OD₅₅₀为0.6左右。取1>

在PCR管中加入以下体系：

组分使用量Premix Taq10 μlpMD 18T-simple primers0.5+0.5 μlcDNA模板1 μldH₂Oup to 20 μl

将上述菌落PCR反应体系混匀，进行PCR扩增后，取5µl产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，经鉴定呈阳性的菌液抽提重组质粒，部分菌液4℃保存备用。

质粒酶切鉴定

质粒DNA的提取与纯化采用Plasmid Mini Kit I（Omega Bio-Tek），具体步骤如下：

1)用离心管收集1.5-5 ml经菌落PCR鉴定呈阳性的菌液，12000 rpm，室温离心1 min，弃去上清，收集菌体于1.5 ml离心管中；

2)加入250 μl预冷的Solution Ⅰ（已加RNase A），充分悬浮菌体沉淀；

3)加入250 μl Solution Ⅱ，温和充分地上下颠倒离心管，至液体澄清，室温放置2min；

4)加入350 μl Solution Ⅲ，温和充分地上下颠倒离心管8-9次，至白色沉淀不再形成，12000 rpm，室温离心10 min；

5)把一干净HiBind® DNA Minicolumn 置于一2 ml收集管中，将上述离心上清液转移至HiBind® DNA Minicolumn中，12000 rpm，室温离心1 min；

6)弃滤液，加入500 μl Buffer HB，12000 rpm，室温离心1 min；

7)弃滤液，加入750 μl Wash Buffer（已加无水乙醇），12000 rpm，室温离心1 min；

8)重复操作步骤7；

9)弃滤液，12000 rpm，室温离心1 min；

10)将HiBind® DNA Minicolumn 置于一新的离心管中，加入50-100 μl灭菌去离子水或TE Buffer至Silica膜中央，12000 rpm，室温离心1 min洗脱质粒DNA。

质粒双酶切反应体系如下：

组分使用量质粒DNAx μlQuickCut EcoR>1 μlQuickCut Sal>1 μl10× QuickCut Green Buffer5 μldH₂Oup to 20 μl

轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温15min。酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。

测序鉴定

将酶切鉴定呈阳性的菌液送华大基因进行测序，序列去载体拼接后提交至NCBI进行BLAST比对分析。

纤维素酶基因全长序列的克隆

6.1 cDNA文库的构建

为了获取白蚁纤维素酶cDNA的全长序列，采用快速扩增cDNA末端（RACE）的方法。

应用SMARTer® RACE cDNA Amplification Kit（Clontech公司）构建cDNA全长文库，用作RACE PCR 的模板，具体步骤如下：

1)在PCR管（A管）中加入以下体系(Mixture B)：

组 分使用量5×First-Strand Buffer4 μlDTT （100mM）0.5 μldNTPs（20mM）1 μlTotal5.5 μl

轻轻混匀后瞬时离心，室温放置备用；

2)在另一PCR管中加入以下体系（5’-RACE和3’-RACE分开进行）：

5’-RACE（B1管）3’-RACE（B2管）5 μl RNA5 μl RNA1 μl 5’-CDS Primer A1 μl 3’-CDS Primer A5 μl RNase free dH₂O6 μl RNase free dH₂OTotal 11 μlTotal 12 μl

轻轻混匀后瞬时离心；

3) 将B1管和B2管置于PCR仪上，72℃，3min；42℃，2min，冷却后14000g，离心10s；

4) B1管中加入1μl SMARTer II A Oligonucletide；

5) 配制以下反应体系：

5’-RACE cDNA3’-RACE cDNA5.5 μl Buffer Mix from tube A5.5 μl Buffer Mix from tube A12 μl Buffer Mix from tube B112 μl Buffer Mix from tube B20.5 μl RNase Inhibitor（40U/μl）0.5 μl RNase Inhibitor（40U/μl）2.0 μl SMARTScribe Reverse Transcriptase2.0 μl SMARTScribe Reverse TranscriptaseTotal 20 μlTotal 20 μl

轻轻混匀后瞬时离心；

6)置于PCR仪上，42℃，90min；70℃，10min；

7)加入90μl的Tricine-EDTA Buffer稀释上述反应产物RACE cDNA，分装后-20℃保存。

6.2基因特异引物的设计

将简并引物扩增获得的中间片段序列输入Genbank中，进行序列比对，选出含有纤维素酶基因保守序列的序列，按照SMARTer® RACE 5’/3’ Kit（Clontech公司）提供的引物设计说明，设计5’-RACE 和3’RACE的基因特异引物GSPs和NGSPs。所述5’-RACE 和3’RACE的基因特异引物GSPs和NGSPs名称及对应的序列如下表所示：

引物名称引物序列（5’-3’）GSP-BG12RGATTACGCCAAGCTTCCACAACGATTTCAGGGACACACAAGCGSP-BG11FGATTACGCCAAGCTTAGCTCGAATTGCACGGCTCTCTCCGSP-BG22 RGATTACGCCAAGCTTGCCGATGCCTGGTGACTTGATTGCGSP-BG23FGATTACGCCAAGCTTTCAACGAACCGCTTACTTTCATGGGAGGNGSP-BG11RGATTACGCCAAGCTTGCCAGAACAATGCTGCTTGCTCACGNGSP-BG13FGATTACGCCAAGCTTGCTGAGGCAAATCCCAGTGGTACATCGNGSP-BG21RGATTACGCCAAGCTTCGATGCCCGCCAGGTTCACTTTATTGNGSP-BG22FGATTACGCCAAGCTTAATGTACGCTCACCCCATCTTCAGCACUPM LongTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTUPM ShortCTAATACGACTCACTATAGGGC

6.3 RACEPCR

用上述合成的cDNA作为RACE PCR 的模板，采用SMARTer^®>

1)在PCR管（C管）中加入以下体系(Master Mix )：

组分使用量PCR-Grade H₂O15.5 μl2×SeqAmp Buffer25 μlSeqAmp DNA Polymerase1 μlTotal41.5 μl

轻轻混匀后瞬时离心，放置备用；

2)在PCR管中加入以下体系(Mixture C)：

5’-RACE3’-RACE2.5 μl 5’-RACE cDNA2.5 μl 3’-RACE cDNA10×UPM Long10×UPM Long5’GSP（10μM）3’GSP（10μM）41.5 μl Master Mix from tube C41.5 μl Master Mix from tube CTotal 50 μlTotal 50 μl

3)将上述PCR反应体系轻轻混匀瞬时离心后，进行PCR扩增。

4)如果RACE PCR扩增产物没有明显条带或产物出现弥散条带，则要进行nestedPCR。

a.取5 μl RACE PCR扩增产物，用245μl的Tricine-EDTA Buffer稀释后备用；

b.重复步骤1-3，其中，5 μl 稀释后的RACE PCR 扩增产物代替RACE cDNA，UPM Short代替UPM Long，NGSP代替GSP，PCR反应程序设置为：94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸3min，循环20次。

基因全长的拼接

应用软件Lasergene中的Seqman程序对简并PCR获取的中间片段，以及5’RACE和3’RACEPCR获取的5’和3’末端进行拼接，最终获取纤维素酶基因的cDNA全长序列，并登录至NCBI数据库中。

生物信息学分析

利用SingalP4.1在线软件预测信号肽序列，用NetOGlyc分析N-连接糖基化位点，用Phyre 2预测蛋白质立体模型。从BLAST核酸数据库中选取22条来自β-葡糖苷酶，利用MEGA5.1分析上述24条β-葡糖苷酶氨基酸序列和本研究1条β-葡糖苷酶，CfBG-Ib的氨基酸序列，构建系统发育树。

基因的原核表达

1 原核表达载体的构建

1.1 特异引物的设计

根据克隆得到的β-葡糖苷酶基因CfBG-Ib的cDNA，选取基因的ORF作为原核表达的片段，设计特异性引物。同时根据选取的原核表达载体pET-32a(+)图谱序列，在设计的特异性引物的5’端添加合适的酶切位点Sac>I和XhoI（下划线标示），以及保护碱基，引物名称及序列如下：

引物名称引物序列（5’-3’）Ex-bgFCGAGCTCGTCATGTTAAGTGGAGCAGEx-bgRCCACTCGAGTCATAACGGAATCGTCGG

1.2原核表达目的片段的PCR扩增、切胶回收、连接、转化以及测序分析

1.3原核表达目的片段及原核表达载体pET-32a(+)的双酶切反应

将经测序正确的目的片段和pET-32a(+)空载体分别进行双酶切反应，以得到具有相同粘性末端的片段。

双酶切反应体系如下：

组分使用量目的基因片段/pET-32a(+)空载体x μlQuickCut Sac>I1 μlQuickCut Xho>1 μl10× QuickCut Green Buffer5 μldH₂Oup to 20 μl

轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温30min。双酶切反应完全后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，然后切胶回收。

连接及阳性重组质粒的筛选

将上述切胶回收的具有相同粘性末端的目的片段和pET-32a(+)载体连接，连接体系如下：

组分使用量带粘性末端目的基因片段10 μl带粘性末端的pET-32a(+)载体4 μlT4 DNA Ligase1 μl10 × T4 DNA连接缓冲液2 μldH₂Oup to 20 μl

轻轻混匀后瞬时离心，16℃连接过夜；再将连接产物转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，用菌液PCR及双酶切反应筛选阳性克隆，并测序，步骤参照2.2.1.3.6。将测序鉴定正确的重组质粒转化至大肠杆菌表达型菌株Rosetta(DE3)感受态细胞中，并筛选阳性单克隆。

重组蛋白的诱导表达及细菌总蛋白的提取

诱导表达：

1） 吸取10μl测序验证过的菌液至10mL新鲜的LB液体培养基中（含100 μg/ml氨苄青霉素）

37℃，250 rpm摇菌过夜培养；

2） 吸取1mL过夜培养的菌液至100mL新鲜的LB液体培养基中（含100 μg/ml氨苄青霉素），37℃，250 rpm摇菌培养，至OD₅₅₀为0.6左右；

3） 向上述菌液中加入IPTG至终浓度为1mM，23℃诱导表达16h；

细菌总蛋白的提取：

蛋白样品的制备采用细菌蛋白抽提试剂盒提取，具体步骤如下：

1） 取l ml菌液，在4℃，5000×g条件下离心10 min，弃上清，收集菌体；

2） 按照每克菌体沉淀加入20mL细菌蛋白抽提试剂的比例，向菌体沉淀中加入抽提液，充分涡旋至菌体完全重悬；

3） 重悬后，室温孵育10min；

4） 15000×g条件下离心5min，转移上清至新的离心管中，即为细菌总蛋白。

电泳

1） 配制12%的分离胶，加入凝胶模具中，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水

层，使凝胶表面保持平整，静置45min，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，去除覆盖在分离胶上的水层；

2） 配制5%的浓缩胶，加至分离胶上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端，将梳子插入凝胶内，避免产生气泡，待凝胶聚合后，小心拔掉梳子；

3） 取10μl蛋白样品，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水加热变性5min，泠却至室温后，3000rpm的条件下离心30s，取适量上清加入SDS-PAGE凝胶加样孔内；

4） 接通电源，首先80V电压电泳30min后，使蛋白样品进入浓缩胶，再将电压转成120V恒压电泳直至溴酚蓝到达距离凝胶底端0.5-1cm处即可停止电泳。

5） 将电泳后的凝胶切除浓缩胶后，放入容器中，加入适量蒸馏水，加热至沸腾后停止；

6） 弃去蒸馏水，加入适量ProteinShow-G250蛋白快速染色液，加热至沸腾，继续在脱色摇床上摇动5min；

7） 弃去染色液，加入适量蒸馏水，加热至沸腾后停止，弃去蒸馏水，重复此步骤脱色至背景清晰；

结果与分析

1.白蚁总RNA的提取

按照试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取台湾乳白蚁总RNA，微量分光光度计检测OD260/OD280的值在1.8-2.2之间，达到了反转录的要求，用于第一链cDNA的合成。

β-糖苷酶基因全长序列的克隆

利用Multalin序列比对软件，将得到的中间片段与已克隆得到的台湾乳白蚁β-葡糖苷酶基因（Glu>，Glu>，Glu>，Glu>）进行核酸序列比对，发现存在显著性差异核酸序列，该β-葡糖苷酶基因中间片段分别长817bp，分别命名为CfBG-Ib。

3’RACE和5’RACE PCR（图1）扩增CfBG-Ib的中间片段，得到台湾乳白蚁β-葡糖苷酶基因完整的cDNA，这个cDNA全长由包括多聚腺苷酸尾巴（poly>

β-葡糖苷酶的序列分析

根据蛋白序列，结合其它已知物种的β-葡糖苷酶三维结构，推测CfBG-Ib三维结构图（图3）。三维结构图显示CfBG-Ib具有糖基水解酶家族1的典型结构，8个（β/α）结构围成的桶状结构，2个催化活性中心：亲核中心（nucleophilic residue）Glu244和酸碱催化中心（acid/base residue）Glu453，2个顺式肽键（cis-peptide bond）：Ala259-Pro260和Trp495-Ser496。

基于BLAST搜索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）蛋白查找表明CfBG-Ib编码蛋白属于糖苷水解酶家族1（GHF1），同时存在相应的催化位点和底物结合位点。同源性分析同样显示基因CfBG-Ib属于GHF1家族。

β-糖苷酶基因的原核表达

1.重组原核表达载体pET-32a-CfBG-Ib的构建

经过PCR扩增，回收目的片段及pET-32a空载体的双酶切反应，带有相同粘性末端的目的片段及载体的连接，重组质粒的转化等一系列反应后，通过菌液PCR验证，扩增的PCR片段大小符合预期的大小。测序结果显示重组原核表达载体中的目的基因片段与CfBG-Ib基因ORF核酸序列一致，并且预测的蛋白序列也一致，没有发生突变和读码框移码的现象。因此，重组原核表达载体pET-32a-CfBG-Ib构建成功，可以用于进一步的重组蛋白的诱导表达。

重组原核表达载体pET-32a-CfBG-Ib的诱导表达

转化重组表达载体后的大肠杆菌Rosetta 2(DE3)经1 mM IPTG诱导后，CfBG-Ib>CfBG-Ib的细菌细胞总蛋白显示出一条明显的条带，相对分子质量约82kD的融合蛋白（图4）。而预测的β-葡糖苷酶基因CfBG-Ib编码蛋白的分子质量为64.02>

实施例2 逆境胁迫下β-葡萄糖苷酶基因表达差异

1温度处理

取台湾乳白蚁工蚁设置4℃、27℃、38℃三个温度梯度的温度胁迫处理，于相对湿度75%人工气候箱中培养24h。

药剂处理

供试白蚁的饥饿处理：取直径为150mm的玻璃培养皿，放入台湾乳白蚁工蚁120头，兵蚁10头，放入温度27℃，相对湿度75%的人工气候箱中饥饿培养24h。

吡虫啉不同时间处理：取2×2cm的滤纸片，分别用60μL的丙酮和浓度为0.1mg/L的吡虫啉浸湿，室温下放置一天，使丙酮充分挥发。取直径为90mm的玻璃培养皿，每组放入丙酮充分挥发后的滤纸2片，每组放入饥饿处理后白蚁，于温度27℃，相对湿度75%的人工气候箱中培养4d，每处理24h，取10头工蚁提取RNA。

荧光定量PCR

3.1白蚁总RNA的提取

提取各逆境胁迫处理组和对照的白蚁总RNA。

第一链cDNA合成

第一链cDNA的合成使用PrimeScript^TM>

1） 基因组DNA的去除

在PCR管中加入以下体系（Mixture D）：

组分使用量Total RNAx μl5 ×gDNA Eraser Buffer2 μlgDNA Eraser1 μlRNase free dH₂Oup to 10 μl

x根据所测Total RNA的浓度计算，使用量在1 μg以下。

42℃反应5 min后，4℃保存备用。

2） 反转录反应

将以下试剂加入上述体系Mixture D中：

组分使用量Mixture D10 μl5×PrimeScript Buffer4 μlPrimeScript RT Enzyme Mix>1 μlRT Primer Mix1 μlRNase free dH₂Oup to 20 μl

缓慢摇匀，37℃下反应15 min后，85℃终止反应5 s。反应产物即第一链cDNA，短时离心后存放于-20℃下，用于qPCR反应。

稀释度的确定

有效的定量PCR结果其进入平台期的Ct值最好在15-30之间。采用序列稀释方法稀释cDNA，以便其Ct值落在15-30之间。稀释的浓度梯度为1，1/10，1/100，1/1000，1/10000，五个浓度梯度。

定量PCR引物的设计

通过上述胁迫处理，用荧光定量PCR检测克隆得到的基因CfBG-Ib的差异性表达情况，同时参照已发表的台湾乳白蚁β-葡萄糖苷酶基因Glu1B表达情况比较分析。用于荧光定量PCR检测的特异性引物和内参引物如下：

引物名称扩增基因引物序列（5’-3’）qPCR-BGFCfBG-IbGCCTTTCCTCTGCATTCACTGqPCR -BGRCfBG-IbCCTCAGCCCCTTCAAGACATTqPCR –Glu1B-FGlu1BTTGCCTCGTCGTCTTTGTGAqPCR>Glu1BCCTTTCCATCCGCATCCCAT18S-F18SCGAGATTGAGCAATAACAGGTC18S-R18SACGTAATCAACGCGAGCTTATG

3.5定量PCR反应

1） 在PCR管中加入以下体系（冰上操作）：

组分使用量cDNA1 μlSYBR Premix Ex Taq^TM(2×)10 μlPCR Forward Primer (10 μM )0.5 μlPCR Reverse Primer (10 μM )0.5 μlRNase free dH₂Oup to 20 μl

2） 应用Stratagene Mx3000P运行PCR反应，反应程序如下：

95℃，30s，1个循环；95℃，10s，55℃，10s，72℃，20s，40个循环。在每个循环的延伸阶段收集荧光信号，进行实时监测。

3）反应结束后，先加热到95℃ 1min，每升高1℃，记录一次荧光信号，得出扩增产物的溶解曲线。

荧光定量PCR的数据分析

反应结束后，确认扩增曲线和溶解曲线，采用2^-△△Ct的方法进行目的基因的相对表达量分析。

结果与分析

1 温度胁迫下台湾乳白蚁β-葡萄糖苷酶基因差异性表达结果

提取温度胁迫处理组和对照组的台湾乳白蚁的总RNA，反转录为cDNA后，作为模板进行荧光定量PCR。以18S基因为内参基因，检测β-葡萄糖苷酶基因CfBG-Ib>Glu1B在不同温度胁迫下的表达情况。

实时荧光定量PCR结果显示（图5~6），温度胁迫处理，β-葡萄糖苷酶的三个基因CfBG-Ib和Glu1B的相对表达量趋势一致。在低温和高温胁迫下，基因CfBG-Ib的相对表达量不存在显著差异。

吡虫啉胁迫下台湾乳白蚁β-葡萄糖苷酶基因差异性表达结果

提取吡虫啉胁迫处理组和对照组的台湾乳白蚁的总RNA，反转录为cDNA后，作为模板进行荧光定量PCR。以18S基因为内参基因，检测β-葡萄糖苷酶基因CfBG-Ib和Glu1B在吡虫啉胁迫下的表达情况。

实时荧光定量PCR结果显示（图7~8），吡虫啉胁迫处理β-葡萄糖苷酶的三个基因CfBG-Ib和Glu1B的相对表达量趋势基本一致。前3天，三个基因的相对表达量与对照组下的相对表达量相差不大，处理的第4天，三个基因的相对表达量均明显高于对照组的相对表达量。

SEQ ID NO:1

GAATTAGTTGAAGTTGGCGTCATATTTGACAAGTTTACAACTTGACGGCTTCCCATGGCGACTGGATAGGACGCAGATT

GTGTAAGATTGAGAATATCACCGGCAACTCAAGTCATGTTAAGTGGAGCAGGTGCTTGGAGATGTTTCTTACTTTCAGTA

CTGTTGCTGAATTTATCAGCTACTGCCAGCGGTCGCCTTATTTCTAATATTTTGAATCCCATTTTAAGTAGTCTCGGCCT

AAACTCCCAAAGTACCAAGAACACTGTTGCCCCTTCCCAATATAATGTTGTTACTACTCCCAAGAACACTGTTGCCCCTT

CCCAAAGTAACACCGATCCTACCAAGAAGAACTTCACTTTTCCCGAAGACTTCTACTTTGCAGCTGCAACGGCGGCTTAC

CAAGCCGAAGGAGGTTGGAACGCAGACGGGAAAGGTCCTAATATCTGGGACACACTGACACACAACCATCCAGACTACAT

ATCCGACTTCTCGAATGGTGACGTAGCAGCGGACTCCTACCACAAGTACACTGAAGACATCAAATTACTCAAGGACATTG

GGGTGCAGTTTTACAGATTTTCCATATCCTGGTCACGGATACTTCCTAAGGGAAGTGTGGCAGCCATTAATCAGGCTGGT

GTCGACTACTATAACAACATCATTAATGGTCTGCTAGCCGTCGGAATTCAGCCCATGGTTACGATGTACCACTGGGATTT

GCCTCAGCCCCTTCAAGACATTGGAGGATGGGCCAATGATTCCATAGCCGATTTCTTCAAGGACTACGCCAGGCTTCTAT

ATAGATTTTTCGGCGATAGAGTGAAATGGTGGATACCAATAAATGAGCCTTTCATGATAGCTAACGGATACAGTGAATGC

AGAGGAAAGGCGCCGTCCCTCTGCCAGCCTGGGACGGCAGATTACCTGGCAGCCAGAACAATGCTGCTTGCTCACGCAAA

AGCCTATCACGTCTACCACAACGATTTCAGGGACACACAAGCAGGTAAAGTGAGCACCTCGTTTAGCATCGACTGGCACG

AACCGCGCACCAACAGTACGGCAGATATTTTAGCAGCGGAGAGAGCCGTGCAATTCGAGCTAGGGATGTTCGCTCATCCC

ATCTACAGTACCTCGGGGGACTATCCACCGGAAGTAAGAGCCAGAGTCGATAACAACAGCAGAGCTGAGGGCTACAATAC

TTCCCGCCTGCCGAAATTCACCCAAGAGGAGATAGATTACATTAAAGGGACGTGGGACTTCTTCGCATTAAATCATTACA

CAACTTATTGGGCCCAGGATGGACTGCAAGGGCCGGACCCTTCCCGACAGCGCGATTCGGGTGTCATGAAATCGCAAGAC

CCCAGCTGTCCTGAGACCAGCTCTCCGTGGTTTAGGGTTGTTCCCTGGGGATTCAGGAAGATACTGCGTTGGGTGAAGAA

AGAATACAACAATCCCCCAATATTCATCACAGAGTCCGGTTACTCTGACGATGGTCGTCTCCAGGATACGGGACGGATTA

AGTATTACGTAGACTACATCCGTGAGCTGCTGAAGGCAAAATACGAAGATGGATGTCAAATAATTGGCTACACTGCTTGG

AGTCTAATTGACAATTTTCAATGGGAAGAAGGCTATGAGAGTAAGTTTGGGCTGGTCTACGTCAACTTCAGTGACCCTGC

AAGAACTCGGATCATCAAGCAGTCAGCAAGGTTGTACAGCGAGATCATCCGCACAAGAAAAGTTCCGGACCGCTACCCGC

AGTACAGCTATGACACGCAGGAATGTCACCCGACGATTCCGTTATGAAAGCTATATGAATCATAGTTCCTCACTATCGAT

GTTTACGAAAGAGCGCGTGCCTATGGAATTACGATGGGGAAGAATTTTTCTATTGCGTGTAAACGATTCAGACTATTAAG

TGTATTATGAGAACAGAAAAATCATGAAAATATCGAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:2

MLSGAGAWRCFLLSVLLLNLSATASGRLISNILNPILSSLGLNSQSTKNTVAPSQYNVVTTPKNTVAPSQSNTDPTKKNF

TFPEDFYFAAATAAYQAEGGWNADGKGPNIWDTLTHNHPDYISDFSNGDVAADSYHKYTEDIKLLKDIGVQFYRFSISWS

RILPKGSVAAINQAGVDYYNNIINGLLAVGIQPMVTMYHWDLPQPLQDIGGWANDSIADFFKDYARLLYRFFGDRVKWWI

PINEPFMIANGYSECRGKAPSLCQPGTADYLAARTMLLAHAKAYHVYHNDFRDTQAGKVSTSFSIDWHEPRTNSTADILA

AERAVQFELGMFAHPIYSTSGDYPPEVRARVDNNSRAEGYNTSRLPKFTQEEIDYIKGTWDFFALNHYTTYWAQDGLQGP

DPSRQRDSGVMKSQDPSCPETSSPWFRVVPWGFRKILRWVKKEYNNPPIFITESGYSDDGRLQDTGRIKYYVDYIRELLK

AKYEDGCQIIGYTAWSLIDNFQWEEGYESKFGLVYVNFSDPARTRIIKQSARLYSEIIRTRKVPDRYPQYSYDTQECHPT

IPL

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