一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法

摘要

本发明公开一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法。该方法包括扇蕨无菌幼孢子囊群外植体的获得、绿色球状体的诱导、绿色球状体的增殖、绿色球状体的分化、组培苗培养和生根。本发明直接以扇蕨无菌幼孢子囊群为外植体诱导出扇蕨绿色球状体仅需为42天～50天，缩短了绿色球状体的诱导周期，且繁殖效率高，绿色球状体诱导率达96～100％，增殖倍数达6.21～7.47倍，绿色球状体的分化率达100％，生根率达100％，繁殖周期短，对于珍稀濒危植物扇蕨种群数量的扩大，以及扇蕨野生资源的可持续开发利用具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属植物组织培养领域，具体涉及一种以幼孢子囊为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法。

背景技术

扇蕨[Neocheiropteris palmatopedata(Barker)Christ],隶属水龙骨科(Polypodiaceae)扇蕨属，草本植物。根状茎粗壮横走，密被鳞片；叶片扇形，鸟足状掌形分裂，形态奇特，具有较高观赏价值。为中国特产的蕨类植物，产于云南、四川、贵州，生长于海报1500-2700米的密林或山崖林下。扇蕨不仅具有观赏价值，还在蕨类植物系统发育中具有重要研究价值，但由于生境的破坏，其野外分布种群数量急剧减少，《国家重点保护野生植物名录(第一批)》将其列为国家二级重点保护野生植物。

野外调查中发现，扇蕨通过孢子繁殖产生的实生孢子体较少，大部分都过根状茎繁殖来维持种群。有性生殖周期长及配子体发育形成孢子体的百分率低是扇蕨主要的濒危原因，自然生境的破坏更加剧了濒危程度。

蕨类植物组培快速繁殖方法主要包括：(1)孢子无菌培养，即：以孢子为外植体进行组培繁殖，繁殖周期较长，部分蕨类种类形成孢子体的百分率较低。(2)以孢子体为外植体的组培繁殖，其中以孢子体为外植体诱导绿色球状体，并构建绿色球状体繁殖途径，是目前蕨类植物组培快速繁殖中最为高效的方法，但需要经过大量的试验才能筛选到适宜的外植体和激素组合，因此，已构建绿色球状体组培繁殖途径的蕨类植物种类十分有限。

目前，已有扇蕨组织培养的相关报道，但现有技术以无菌孢子体为外植体的扇蕨组培繁殖方法，主要是以通过孢子无菌培养获得的无菌孢子体幼苗为外植体，其先从成熟孢子播种到诱导出无菌孢子体幼苗至少需要5～6个月，且无菌孢子体幼苗的诱导率仅30％左右，获得外植体的周期较长，繁殖效率低。尚未见以幼孢子囊群直接为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法的相关报道。

发明内容

为解决扇蕨自然繁殖力低、现有扇蕨组培培养从成熟孢子萌发形成原叶体→原叶体增殖→原叶体诱导获得无菌孢子体幼苗为外植体至少需要5～6个月，且无菌孢子体幼苗的诱导率仅30％左右，繁殖周期长，繁殖效率低，适宜的无菌孢子体外植体难以获得的技术问题，本发明提供一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法。

本发明提供的一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法，包括以下步骤：

(1)扇蕨无菌幼孢子囊群外植体的获得

选择带有扇蕨幼孢子囊群的扇蕨叶片，用软的毛刷蘸1％体积分数的洗洁精水对扇蕨幼孢子囊群表面进行清洗，除去扇蕨幼孢子囊群表面的小鳞片和杂物，直至可见黄绿色的扇蕨幼孢子囊，然后用手术刀片将扇蕨幼孢子囊群从叶片上剥离，放置于烧杯中，流动水冲洗1～1.5小时，再在无菌条件，将扇蕨幼孢子囊群用5％体积分数的次氯酸钠溶液消毒12～15分钟，无菌水冲洗5～6次，每次冲洗5分钟，即得扇蕨无菌幼孢子囊群外植体；所述扇蕨幼孢子囊为黄绿色，且其孢子囊壁完整，孢子囊外壁覆盖有棕褐色鳞片的扇蕨孢子囊；

(2)扇蕨绿色球状体的诱导

将步骤(1)中获得的扇蕨无菌幼孢子囊群切成小块，接种于绿色球状体诱导培养基上，20℃～25℃暗培养48小时，然后转入光照培养，培养时间为40～48天，得到扇蕨绿色球状体，光照培养条件为：20℃～25℃,每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx；所述绿色球状体诱导培养基为：1/4MS～1/2MS+TDZ 0.5～1.0mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(3)扇蕨绿色球状体的增殖

将步骤(2)诱导获得的扇蕨绿色球状体切割成块，接种于绿色球状体增殖培养基上，培养时间为30天，得到增殖的扇蕨绿色球状体，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同；所述绿色球状体增殖培养基为：1/2MS～MS+6-BA 0.3～0.5mg/L+NAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(4)扇蕨绿色球状体的分化

将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色球状体切割成块，接种于绿色球状体分化培养基上，培养时间为30天，得到分化幼苗，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同，所述绿色球状体分化培养基为：1/4MS～1/2MS+KT0.1～0.2mg/L+水解酪蛋白100～180mg/L+活性炭1～2g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(5)扇蕨组培苗的培养和生根

将步骤(4)得到的分化幼苗接种于组培苗培养和生根培养基上，培养时间为60天，每30天更换一次组培苗培养和生根培养基，得到植株高度为1.5cm以上的生根组培苗，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同，所述组培苗培养和生根培养基为：1/2MS～MS+NAA 0.2～0.3mg/L+活性炭1～2g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

2.根据技术方案1所述的一种以幼孢子囊群为外植体的扇蕨组培快速繁殖方法，步骤(2)中所述的将步骤(1)中获得的无菌扇蕨幼孢子囊群切成小块的大小为1mm～2mm×1mm～2mm×1mm～2mm；步骤(3)中所述的将步骤(2)诱导获得的扇蕨绿色球状体切割成块的大小为1～3mm×1～3mm×1～3mm；步骤(4)中所述的将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色球状体切割成块大小为1～3mm×1～3mm×1～3mm。

与现有技术相比，本发明的主要创新点及有益效果：

1、本发明方法大幅度地缩短了扇蕨组培苗的繁殖时间。

本发明方法直接用扇蕨无菌幼孢子囊群为外植体诱导出扇蕨绿色球状体，仅需为42～50天，克服了现有技术扇蕨组织培养仅仅获得无菌孢子体幼苗外植体至少需要5～6个月，繁殖周期长的缺陷，因此，本发明方法大幅度地缩短了扇蕨组培苗的繁殖时间。

2、本发明方法大幅度地提高了扇蕨组培繁殖效率。本发明方法诱导出扇蕨绿色球状体的诱导率达96％～100％，增殖倍数高达到6.21-7.49倍，而现有获得无菌孢子体幼苗外植体的诱导率仅为30％左右。

3、与现有技术相比，本发明方法产生了预料不到的技术效果。

附图说明

图1是扇蕨幼孢子囊群。图中的线段为比例尺，表示的长度为1cm。

图2是本发明方法以扇蕨无菌幼孢子囊群为外植体诱导形成扇蕨绿色球状体图。图中线段为比例尺，表示长度为 1mm。

图3是本发明方法诱导出的扇蕨绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为1mm。

具体实施方法

以下的实施例便于更好地理解本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料均为市售。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下各实施例培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含量混合后，用pH计调pH为该培养基要求的pH值并按常规植物组织培养的培养基消毒灭菌后即制成。

实施例1本发明方法

(1)扇蕨无菌幼孢子囊群外植体的获得

选择长势良好且带有扇蕨幼孢子囊群的扇蕨叶片，用柔软的细毛刷蘸1％体积分数的洗洁精水对扇蕨幼孢子囊群表面进行清洗，除去扇蕨幼孢子囊群表面的小鳞片和杂物，直至可见黄绿色的扇蕨幼孢子囊，然后用手术刀片小心的将扇蕨幼孢子囊群从叶片上剥离，放置于烧杯中，流动水冲洗1小时。然后，在无菌条件将扇蕨幼孢子囊群用5％体积分数的次氯酸钠溶液消毒12分钟，无菌水冲洗5次，每次冲洗5分钟，即得扇蕨无菌幼孢子囊群外植体。

所述扇蕨幼孢子囊群是扇蕨幼孢子囊成群聚生在一起的扇蕨幼孢子囊群体。所述扇蕨幼孢子囊为黄绿色，且孢子囊壁完整，孢子囊外壁覆盖有棕褐色鳞片的扇蕨孢子囊(成熟扇蕨孢子是从成熟扇蕨孢子囊散出的孢子。成熟扇蕨孢子囊是黄色，孢子囊壁开始破裂，孢子囊外壁无棕褐色鳞片)。

(2)扇蕨绿色球状体的诱导

将步骤(1)中获得的扇蕨无菌幼孢子囊群切成大小为1mm～2mm×1mm～2mm×1mm～2mm的小块，接种于绿色球状体诱导培养基上，20℃暗培养48小时，然后转入光照培养，培养时间为40天，得到扇蕨绿色球状体，光照培养条件为：20℃，每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx。所述绿色球状体诱导培养基为：1/4MS+TDZ 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。接种数为50个幼孢子囊群小块。

经诱导培养后，幼孢子囊表面膨胀形成绿色球状体，绿色球状体的诱导率为96.00％。

诱导率＝(产生绿色球状体的幼孢子囊群的块数/接种的幼孢子囊群的块数)×100％

(3)扇蕨绿色球状体的增殖

将步骤(2)诱导获得的扇蕨绿色球状体切割成大小为1～3mm×1～3mm×1～3mm的块，接种于绿色球状体增殖培养基上，培养时间为30天，得到增殖的扇蕨绿色球状体，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同。所述绿色球状体增殖培养基为：1/2MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。该2mm的扇蕨绿色球状体鲜重为7mg，接种数为50个。

扇蕨绿色球状体增殖培养30天后，鲜重增加为52.30mg，增殖倍数为7.47倍。增殖培养的次数可根据生产上需要的组培苗数量确定。

(4)扇蕨绿色球状体的分化

将步骤(3)增殖得到的扇蕨绿色球状体切割成大小为1～3mm×1～3mm×1～3mm的块，接种于绿色球状体分化培养基上，培养时间为30天，得到分化幼苗，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同。所述绿色球状体分化培养基为：1/4MS+KT 0.1mg/L+水解酪蛋白 100mg/L+活性炭1g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。该2mm的绿色球状体鲜重约为7mg，接种数为50个。

扇蕨绿色球状体分化培养30天后，分化率为100.00％。

分化率＝(发生分化的扇蕨绿色球状体数量/接种的扇蕨绿色球状体的数量)×100％。

(5)扇蕨组培苗的培养和生根

将步骤(4)得到的分化幼苗接种于组培苗培养和生根培养基上，培养时间为60天，每30天更换一次组培苗培养和生根培养基，得到植株高度为1.5cm以上的生根组培苗，培养条件与步骤(2)中所述的光照培养条件相同。所述组培苗培养和生根培养基为：1/2MS+NAA 0.2mg/L+活性炭1g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。接种的分化幼苗数为50株。

经过60天的培养，扇蕨组培苗的平均株高为1.8cm，生根率100％，5～7根/株，所培养的苗根多、苗壮。

实施例2和实施例3均为本发明方法

实施例2和实施例3除表1所列措施不同外，其余措施均与实施例1相同，不再赘述。

表1实施例2-实施例3各步骤与实施例1的区别

实施例1-3的繁殖效果见表2。

表2实施例1-实施例3的繁殖效果

以上各实施例中一个2mm的扇蕨绿色球状体一次分化可以得到15～20株扇蕨组培苗，其扇蕨组培苗繁殖率特别高。

上述实施例1至实施例3表明：本发明直接以扇蕨无菌幼孢子囊群为外植体，诱导出扇蕨绿色绿色球状体仅需42天～50天，省略了现有技术以扇蕨无菌孢子体为外植体，需先从成熟孢子萌发形成原叶体→原叶体增殖→原叶体诱导获得无菌孢子体幼苗为外植体的步骤，并节省了现有技术从成熟孢子萌发形成原叶体→原叶体增殖→原叶体诱导获得无菌孢子体幼苗为外植体至少需要5～6个月的时间，克服了现有技术扇蕨组培繁殖周期长的缺陷，本发明整个扇蕨组培繁殖时间仅需162天～170天，大幅度地缩短了扇蕨组培苗的繁殖时间。同时，大幅度地提高了扇蕨组培繁殖效率，本发明方法诱导出扇蕨绿色球状体的诱导率达96％～100％，增殖倍数高达到6.21～7.49倍，绿色球状体的分化率100％，生根率100％，而现有技术扇蕨组培繁殖效率低，获得无菌孢子体幼苗外植体的诱导率仅为30％左右，与现有技术相比，本发明方法产生了预料不到的技术效果。