三种来源于脊尾白虾ALF的环状多肽及其应用和抗菌剂

摘要

本发明涉及三种环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3及其抗菌应用。本发明所涉及的环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3分别具有序列列表中SEQ ID No.1、2、3所示的氨基酸序列及结构特征；环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3分别衍生自序列列表中SEQ ID No.4、5、6所示脊尾白虾抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS结合结构域；经对本发明涉及的环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3进行生物功能体外验证，证实其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长或增殖具有抑制作用。

说明书

技术领域

本发明涉及三种环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3及其抗菌应用，具体地说是三种合成的衍生自脊尾白虾抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS结合结构域的环状多肽及其抗菌应用。

背景技术

对虾的养殖在我国的水产养殖业中占有重要地位，近些年来，对虾养殖过程中的病害问题已经严重阻碍了其养殖生产的健康发展，抗生素的滥用与环境的恶化使海水养殖动物的病害难以从根本上得到控制。

抗菌肽(蛋白)被认为是鱼、虾、贝等防御细菌、病毒等外源病原感染的重要效应分子，在动物的先天免疫过程中发挥重要作用。目前从甲壳动物中发现的抗菌肽种类繁多，抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)就是其中一种重要的抗菌肽。1982年，Tanaka等首次从中国鲎(Tachypleus tridentatus)和北美鲎(Limulus polyphemus)的血细胞中分离得到ALF，并发现其能抑制LPS介导的凝血反应的激活。1985年，Morita等发现ALF还具有很强的抗革兰氏阴性菌活性。之后，人们相继在斑节对虾(Penaeus monodon)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、桃红对虾(Farfantepenaeus duorarum)等多种甲壳动物中发现ALF基因的存在，并证实ALF的重组蛋白具有抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长的活性。另外，研究还发现对虾白斑综合征病毒(WSSV)预先与重组表达的ALF蛋白一起孵育后再注射入虾体中，能抑制注入虾体中WSSV的复制。

与传统抗生素的作用机理不同，ALF直接中和细菌细胞壁的脂多糖，溶解细菌，因此不易产生细菌的耐药性。ALF对病毒的作用机理目前仍不清楚。随着抗生素的应用，许多病原菌对现有抗生素逐步产生耐药性，而新型抗生素的发现又极其困难，因此，ALF的研究为开发新型抗菌药物开辟了新的思路。

研究发现，ALF氨基酸序列中的两个保守半胱氨酸之间形成二硫键，两个半胱氨酸之间的氨基酸共同形成一段阴离子多肽，具有与LPS结合的能力，这段保守的结构域被命名为LPS结合结构域，被认为是ALF降解革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖的功能域。2011年，SachinSharma等研究了根据锯缘青蟹(Scylla serrata)ALF的LPS结合结构域合成的具24个氨基酸残基的多肽在抗菌免疫过程中的作用，发现合成多肽SsALF24具有结合LPS的活性并且对大肠杆菌都具有明显的抑制作用，其最小抑制浓度为16.16-32.32uM(Sharma S，YederyRD，Patgaonkar MS，Selvaakumar C，Reddy KV.Antibacterial activity of a syntheticpeptide that mimics the LPS binding domain of Indian mud crab，Scylla serrataanti-lipopolysaccharide factor(SsALF)also involved in the modulation ofvaginal immune functions through NF-kB signaling.Microbial pathogenesis 2011；50：179-191.)。

前期研究发现，中国明对虾中ALF的LPS结合结构域具有不同的抗菌抗病毒作用，通过对中国明对虾ALF的LPS结合结构域改造获得的LBDv多肽分子表现出很强的抗菌抗病毒作用(Yang H，Li SH，Li FH，Xiang JH.Structure and bioactivity of a modifiedpeptide derived from the LPS-binding domain of an anti-lipopolysaccharidefactor(alf)of shrimp.Mar.Drugs 2016，14，96；doi：10.3390/md14050096.)。在脊尾白虾中也发现多种抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3，基于EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS结合结构域序列信息，本发明利用化学合成的方法获得了环状多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3，它们显示出明显的抗菌生物学活性，具有重要的应用前景。

发明内容

本发明旨在提供三种环状合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3，它们具有明显的抗菌活性。

本发明的技术方案如下：

利用化学合成的方法获得了环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3，分别具有SEQ ID No.1、2、3所示的氨基酸序列，其序列特征分别为：

SEQ ID No.1：Ac-Qc(CNYRVDPKIKRFQLYFKGRMWC)P-NH₂；

SEQ ID No.2：Ac-Vc(CTVDVKPTLRRFKLIFIGTMYC)P-NH₂；

SEQ ID No.3：Ac-Vc(CSFQVKPKIKRWQLYFIGTMYC)P-NH₂。

所述的环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3序列具有二硫键结构。其结构特征在于：合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3序列氨基端第二个半胱氨酸(C)和羧基端第二个半胱氨酸(C)之间具有二硫键结构；多肽的氨基端C的氨基被乙酰化(Ac-)，羧基端C的羧基被酰胺化(-NH₂)。

所述的环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3衍生自脊尾白虾抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS结合结构域，EcALF1、EcALF2、EcALF3分别具有序列列表中SEQID No.4、5、6所示的氨基酸序列。

所述的环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3具有明显的抗菌活性。具体为：对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长或增殖具有明显的抑制作用。

所述环状的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3可作为抗菌的活性成份，可用于制备抗菌的药物或制剂中。

本发明有如下优点：

1、本发明确定了三种衍生自脊尾白虾抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS结合结构域的抗菌多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3及其结构特征。

2、通过本发明可开发有效的细菌类疾病的防治药物。

附图说明

图1合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的空间结构图；

图2中，(a)(b)(c)分别为合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的HPLC纯度检测图；

图3中，(a)(b)(c)分别为合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的MS质谱鉴定图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

三种化学合成的具有明显抗菌活性的脊尾白虾环状多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3，它们的序列及来源序列信息如下：

(1)SEQ ID No.1、2、3的信息

(a)序列特征

*长度：24氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：环形，两个半胱氨酸之间形成二硫键

*空间结构：两个半胱氨酸之间通过二硫键相连接，形成环状结构，具有1)图1所示空间结构：多肽序列形成两个相连的β折叠结构。

(b)分子类型：蛋白

序列描述：

SEQ ID No.1

Ac-Qc(CNYRVDPKIKRFQLYFKGRMWC)P-NH₂

SEQ ID No.2

Ac-Vc(CTVDVKPTLRRFKLIFIGTMYC)P-NH₂

SEQ ID No.3

Ac-Vc(CSFQVKPKIKRWQLYFIGTMYC)P-NH₂

其中括号内的氨基酸为成环的氨基酸，括号外左侧的小写c表示括号内的氨基酸为形成环状结构氨基酸；Ac-表示氨基酸C的氨基被乙酰化；-NH₂表示氨基酸C的羧基被酰胺化。

(2)SEQ ID No.4的信息

(a)序列特征

*长度：125氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.4

MKLSLLLGIVLVGVMTSSLFPTCEAQAWQAVAAAVAEKIAGLWVNDEMELLGHTCNYRVDPKIKRFQLYFKGRMWCPGWTPIRGEAETRSRSGVVGKTTSDFVTKAFKSGLISEDDARAWLNSKK

(3)SEQ ID No.5的信息

(a)序列特征

*长度：134氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.5

MRPSTCFFVLAGFILLSCSVFDKAEGQGLTDLLGGLSGDSILDAVEAELNGLWSTSDIEFLGHVCTVDVKPTLRRFKLIFIGTMYCPIWTTIRGTSETTSRTNVVHLASADFVRNAVAAELITEEQGKEWLKYN

(2)SEQ ID No.6的信息

(a)序列特征

*长度：134氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.6

MRPSTCFFVLAGFILLSCSVFDKAEGQGLTDLLGGLSGESLVDAVASQIVGLWGSGDIEFLDHVCSFQVKPKIKRWQLYFIGTMYCPGWTPIRGTSETRSRTNVVNLATADFVRKAIGEGLITEEQAREWLRHQ

所述抗菌多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的合成、环化、纯化、鉴定及生物活性分析：

通过人工化学合成途径，利用固相合成方法获得粗品多肽，经固相环化、质谱鉴定和液相色谱纯化获得含有二硫键的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3。具体为：

1)多肽合成

采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，从C端向N端方向合成。用10mg Rink-Amide-Resin树脂(AAPPTec，货号RRZ001)作为载体，依靠载体本身的活性基团与5mg被Fmoc进行氨基保护的第一个氨基酸(Fmoc-Pro-NH₂)的羧基相连(详细方法参考文献：PanagiotisStathopoulos，Serafim>

用N-甲基毗咯皖酣(NMP)冲洗树脂除去多余保护氨基酸，向反应器(固相合成器)中加入20％哌啶/NMP溶液(体积分数)脱除Fmoc基团，反应20min，排空反应器，用5mL NMP振荡冲洗树脂，重复3次，脱除第一个氨基酸残基的Fmoc保护；裸露出的活性氨基基团与下一个被Fmoc进行氨基保护的氨基酸(5mg)的羧基相连，形成第一个肽键(Pro-Cys)。此段的以上步骤循环进行(不同之处在于：只是每次需采用对应的被Fmoc进行氨基保护的氨基酸)直至多肽序列Ac-Qc(CNYRVDPKIKRFQLYFKGRMWC)P-NH₂合成完毕，得约20mg线性多肽。通过相同方法合成多肽序列Ac-Vc(CTVDVKPTLRRFKLIFIGTMYC)P-NH₂和Ac-Vc(CSFQVKPKIKRWQLYFIGTMYC)P-NH₂，分别获得约20mg线性多肽。

2)多肽环化

20mg线性多肽偶联完最后一个氨基酸后，配置0.1mol/L的I₂溶液(I₂溶于体积比1∶1的甲醇∶DMF混合溶液中)，加入10mL至固相合成器中，氮气吹拂反应，约6小时。

3)多肽纯化和鉴定

用50mL切肽试剂三氟乙酸∶苯甲硫醚∶苯酚∶乙二硫醇∶双蒸水(体积比82.5∶5∶5∶2.5∶5)将20mg环化后的多肽从载体树脂上裂解下来，2小时后，加入4℃预冷的乙醚100ml使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤3遍，真空抽干，得到的多肽粗品经反向液相色谱纯化，纯化后的多肽冻干后进行HPLC纯度检测(图2)和质谱鉴定(图3)。检测HPLC色谱柱为250*4.6mm，Kromasil-C18-5μm；流动相A：0.1％TFA/乙腈，流动相B：0.1％TFA/H₂O；线性洗脱梯度：15％A-100％A；流速为1ml/min，检测波长为220nm；一次进样量为10μl。HPLC和MS检测结果显示，合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的纯度分别为95.87％、95.42％、95.24％，分子量分别为3116.76、2840.54、2975.66，与预测分子量(分别为3116.75、2840.53、2975.66)基本一致。

4)抑菌试验

合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3分别用50mmol/LpH7.4的PBS溶解至浓度为640μmol/L的溶液，同时以50mmol/LpH7.4的PBS为阴性对照。采用最低抑菌浓度(MIC)方法检测合成多肽对革兰氏阴性菌包括哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae subsp.piscicida)和革兰氏阳性菌包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)等细菌的抑菌活性。即：将待测表皮葡萄球菌、藤黄微球菌分别在37℃，200r/min培养条件下于LB培养基中培养至1×10⁸cells/mL，哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌、溶藻弧菌分别在30℃，200r/min培养条件下于TSB培养基中培养至1×10⁸cells/mL；培养的细菌分别加入到48孔培养板中，用新鲜的LB或TSB培养基将待测菌液稀释至终浓度1×10⁶cells/mL；向48孔培养板中分别加入梯度稀释的多肽溶液至终体积为200μl，多肽H终浓度依次为64μmol/L、32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L和1μmol/L；用PBS作为阴性对照，终浓度58μmol/L的氨苄青霉素(表皮葡萄球菌、藤黄微球菌)或88μmol/L的卡那霉素(哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌、溶藻弧菌)分别作为阳性对照；在37℃或28℃条件下培养3h后，分别加入300μl新鲜LB或TSB培养基，继续培养18h，测定每孔中细菌的OD600吸光值，计算细菌浓度。

结果表明，8-16μmol/L的合成多肽EcLBD1、4-8μmol/L的合成多肽EcLBD2和16-32μmol/L的合成多肽EcLBD3都能够有效抑制哈维氏弧菌的生长，32-64μmol/L的合成多肽EcLBD1能够有效抑制美人鱼发光杆菌的生长，8-16μmol/L的合成多肽EcLBD2和2-4μmol/L的合成多肽EcLBD3都能够有效抑制溶藻弧菌的生长，32-64μmol/L的合成多肽EcLBD1、8-16μmol/L的合成多肽EcLBD2和4-8μmol/L的合成多肽EcLBD3都能够有效抑制藤黄微球菌的生长，16-32μmol/L的合成多肽EcLBD2能够有效抑制表皮葡萄球菌的生长。结果说明合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3具有明显的抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性。

合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的发现及生物活性鉴定，在新型抗菌药物的开发上具有重要的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 三种来源于脊尾白虾ALF的环状多肽及其应用和抗菌剂

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2和23位C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 1

Gln Cys Asn Tyr Arg Val Asp Pro Lys Ile Lys Arg Phe Gln Leu Tyr

1 5 1015

Phe Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro

20

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2和位位氨基酸C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 2

Val Cys Thr Val Asp Val Lys Pro Thr Leu Arg Arg Phe Lys Leu Ile

1 5 1015

Phe Ile Gly Thr Met Tyr Cys Pro

20

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2和23位氨基酸C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 3

Val Cys Ser Phe Gln Val Lys Pro Lys Ile Lys Arg Trp Gln Leu Tyr

1 5 1015

Phe Ile Gly Thr Met Tyr Cys Pro

20

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(125)

<400> 4

Met Lys Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ile Val Leu Val Gly Val Met Thr

1 5 1015

Ser Ser Leu Phe Pro Thr Cys Glu Ala Gln Ala Trp Gln Ala Val Ala

202530

Ala Ala Val Ala Glu Lys Ile Ala Gly Leu Trp Val Asn Asp Glu Met

354045

Glu Leu Leu Gly His Thr Cys Asn Tyr Arg Val Asp Pro Lys Ile Lys

505560

Arg Phe Gln Leu Tyr Phe Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro Gly Trp Thr

65707580

Pro Ile Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Ser Arg Ser Gly Val Val Gly

85 90 95

Lys Thr Thr Ser Asp Phe Val Thr Lys Ala Phe Lys Ser Gly Leu Ile

100 105 110

Ser Glu Asp Asp Ala Arg Ala Trp Leu Asn Ser Lys Lys

115 120 125

<210> 5

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(134)

<400> 5

Met Arg Pro Ser Thr Cys Phe Phe Val Leu Ala Gly Phe Ile Leu Leu

1 5 1015

Ser Cys Ser Val Phe Asp Lys Ala Glu Gly Gln Gly Leu Thr Asp Leu

202530

Leu Gly Gly Leu Ser Gly Asp Ser Ile Leu Asp Ala Val Glu Ala Glu

354045

Leu Asn Gly Leu Trp Ser Thr Ser Asp Ile Glu Phe Leu Gly His Val

505560

Cys Thr Val Asp Val Lys Pro Thr Leu Arg Arg Phe Lys Leu Ile Phe

65707580

Ile Gly Thr Met Tyr Cys Pro Ile Trp Thr Thr Ile Arg Gly Thr Ser

859095

Glu Thr Thr Ser Arg Thr Asn Val Val His Leu Ala Ser Ala Asp Phe

100 105 110

Val Arg Asn Ala Val Ala Ala Glu Leu Ile Thr Glu Glu Gln Gly Lys

115 120 125

Glu Trp Leu Lys Tyr Asn

130

<210> 6

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(134)

<400> 6

Met Arg Pro Ser Thr Cys Phe Phe Val Leu Ala Gly Phe Ile Leu Leu

1 5 1015

Ser Cys Ser Val Phe Asp Lys Ala Glu Gly Gln Gly Leu Thr Asp Leu

202530

Leu Gly Gly Leu Ser Gly Glu Ser Leu Val Asp Ala Val Ala Ser Gln

354045

Ile Val Gly Leu Trp Gly Ser Gly Asp Ile Glu Phe Leu Asp His Val

505560

Cys Ser Phe Gln Val Lys Pro Lys Ile Lys Arg Trp Gln Leu Tyr Phe

65707580

Ile Gly Thr Met Tyr Cys Pro Gly Trp Thr Pro Ile Arg Gly Thr Ser

859095

Glu Thr Arg Ser Arg Thr Asn Val Val Asn Leu Ala Thr Ala Asp Phe

100 105110

Val Arg Lys Ala Ile Gly Glu Gly Leu Ile Thr Glu Glu Gln Ala Arg

115 120 125

Glu Trp Leu Arg His Gln

130