一种KAP13‑1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用

摘要

本发明涉及一种KAP13‐1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用。根据牛KAP13‐1基因设计引物，以绵羊皮肤cDNA为模板，RT‐PCR绵羊KAP13‐1基因片段；根据绵羊KAP13‐1基因的氨基酸序列制备多克隆抗体，用免疫组化检测KAP13‐1基因在绵羊毛囊中表达量；(3)利用2A肽序列构建绵羊启动子驱动的共表达绵羊KAP13‐1和绿荧光蛋白的重组载体；以KAP13‐1基因和ZsGreen1‐1载体中绿荧光蛋白基因设计引物；融合PCR得到KAP13‐1‐2A‐ZSG，用连接酶将KAP13‐1‐2A‐ZSG连接到双酶切载体中；以绵羊脾脏基因组为模板扩增KAP11‐1基因启动子，酶切连接到中间载体中获重组载体(4)用重组载体转化昆明小鼠，鉴定转基因阳性小鼠毛纤维皮质部中的表达量，并检测距离毛囊底部130μm处毛纤维的直径。

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种KAP13-1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用。

背景技术

毛囊是一个复杂的微器官，其由外到内包括外根鞘、伴随层、内根鞘(亨利层、赫胥黎层、鞘小皮)、毛干(角质层、皮质层、髓质层)。此外，毛囊具有毛囊干细胞富集的膨大部、含有大量快速增殖细胞的毛母质和在信号交流中起重要作用的毛乳头。研究毛囊不同结构或细胞的功能有助于全面地了解毛囊生长发育过程进而提高毛纤维品质。毛纤维作为毛囊的最终产物，不仅对动物自身具有重要的保护作用而且具有很大的经济价值。毛纤维主要由外侧的鳞片层、中间的皮质层和内部的髓质层组成。皮质层由角蛋白和角蛋白关联蛋白组装成的纤维束构成，是毛纤维的重要组成部分。皮质层中的蛋白通过盐键、氢键及二硫键相互作用使毛纤维富有弹性、张力和韧性；皮质层含有色素细胞，决定毛纤维颜色的深浅；而且皮质层控制毛纤维的水分和曲直。因此，毛纤维的皮质部对毛纤维的物理特性具有重要作用。研究皮质部蛋白的功能可以揭示毛纤维的形成过程和各蛋白对毛纤维理化性质的影响。

毛纤维中的角蛋白关联蛋白(Kertain associated protein)是在皮质部中围绕角蛋白(Kertain)的不规则基质的重要组成部分(Rogers and Schweizer,2005)。许多研究者认为角蛋白关联蛋白在毛纤维形成过程中具有重要作用(Shimomura and Ito,2005；Fujikawa et al.,2012)。在毛纤维形成过程中，角蛋白关联蛋白好像“胶水”一样将各角蛋白结合起来(Rogers and Schweizer,2005)。根据氨基酸组成，角蛋白关联蛋白可以分为高硫、超高硫和高甘氨酸/酪氨酸角蛋白关联蛋白(Shimomura and Ito,2005)。高硫和超高硫角蛋白关联蛋白主要通过与角蛋白形成二硫键在毛纤维的形成中发挥作用；而高甘氨酸/酪氨酸角蛋白关联蛋白不仅可以与角蛋白相互作用而且还可以与细胞桥粒作用促进毛纤维的形成(Matsunaga et al.,2013)。角蛋白关联蛋白在哺乳动物中特异表达，并且具有许多特点。首先，不同种类的角蛋白关联蛋白与不同的毛纤维的特性有密切联系；其次，由于角蛋白关联蛋白半胱氨酸富集区段的重复导致长度的多态性，而半胱氨酸的含量差异导致了相应角蛋白关联蛋白对毛纤维形成作用的差异；不同角蛋白关联蛋白基因的多样性也影响了其表达量的不同(Wu et al.,2008；Khan et al.,2014)。因此，角蛋白关联蛋白的多样性很可能导致了哺乳动物毛纤维形态的多样性。

KAP13-1属于高硫角蛋白关联蛋白。公开号：CN103642806B的专利文献报道了绵羊KAP13-1在毛囊中高表达。在羊毛纤维的蛋白质组学研究中，KAP13-1的表达起始于羊毛纤维角质化部位(Plowman et al.,2015)。此外，在不同品种的绵羊群体中，KAP13-1在不同位点呈现出多态性，进一步的关联分析表明KAP13-1中的多态位点与产毛量、柔韧性及产绒性状存在紧密关联。上述结果表明KAP13-1对毛纤维的形成具有重要作用，但是其具体功能尚不清楚。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提高一种KAP13-1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用，检测绵羊KAP13-1对毛纤维细度的影响，利用该基因作为在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用。

本发明的技术方案如下所述：

(1)根据登陆号为NM_001080350.1的牛KAP13-1基因的核苷酸序列设计引物，其正向引物为CGTAACTCACATCACCTGCG，反向引物为：TGCTTCCGTATCGCATGTCT，以绵羊皮肤cDNA为模板，用RT-PCR方法扩增绵羊KAP13-1基因的部分核苷酸序列，然后纯化PCR产物、克隆并测序，获得如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列(即扩增得到的绵羊KAP13-1基因的部分核苷酸序列)；

(2)根据绵羊KAP13-1基因的氨基酸序列制备绵羊KAP13-1的多克隆抗体，然后通过免疫组化检测KAP13-1基因是否在绵羊毛囊中的表达模式(即检测KAP13-1基因在绵羊毛囊中的表达量)，KAP13-1基因的氨基酸序列是SEQ ID NO:1中第24-518碱基所对应的序列。

所示；

(3)利用2A肽序列(序列见SEQ ID NO:8)构建绵羊KAP11-1启动子驱动的共表达绵羊KAP13-1和绿荧光蛋白ZsGreen1的表达载体，申请人将获得的表达载体命名为重组载体pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG；根据SEQ ID NO:1所述的绵羊KAP13-1基因的核苷酸序列和SEQID NO:4所述的ZsGreen1-1载体中绿荧光蛋白基因ZsGreen1的核苷酸序列设计如下引物：

扩增KAP13-1基因：

正向引物：CCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTCCTACAACTGCTGCTCTGG，

反向引物:CTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCCCTCGTAGAAGCCAGATCCACA；

扩增GFP-ZSG基因：

正向引物：GATCTGGCTTCTACGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGCCCAGTCCAAG，

反向引物：GATTATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCAGGGCAAGG；

通过融合PCR方法扩增得到KAP13-1-2A-ZSG片段，该片段序列如SEQ ID NO:5所示，回收PCR产物，酶切后，利用连接酶将该KAP13-1-2A-ZSG片段连接入Sac II/Not I双酶切的pZsGreen1-1载体中，克隆、测序获得序列正确的KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1载体，该载体的序列如SEQ ID NO:6所示；

利用正向引物：CCGCTCGAGCCCCTGGATAGAAAGATCAGACCAA和反向引物：TCCCCGCGGCTTGGTGCTGGTGGAGAGATGT，以绵羊脾脏基因组为模板PCR扩增KAP11-1基因启动子序列，该启动子序列如SEQ ID NO:7所示，PCR产物回收后，酶切连接到已获得的KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1载体中，通过克隆、测序获得序列正确的重组载体pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(4)PiggyBac系统是一个能够有效介导基因编辑的转座系统(Wilson M H etal.,2007)，本发明利用PiggyBac系统将pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG重组片段随机整合到昆明小鼠的基因组上，获得pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus转基因小鼠，分别通过PCR在基因组水平鉴定阳性转基因小鼠，在荧光显微镜下检测转基因小鼠毛纤维中绿荧光蛋白ZsGreen1的表达量；同时检测绵羊KAP13-1蛋白在pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus转基因小鼠各组织中的表达量以及鉴定绵羊KAP13-1基因在pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus转基因小鼠毛纤维皮质部中的表达量；

(5)分别采集35日龄的pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus转基因小鼠、皮质部特异表达绿荧光蛋白的pKAP11-1-ZSG转基因小鼠和野生型昆明小鼠的Guard型毛纤维并测量距离毛囊底部130μm处毛纤维的直径；结果发现pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus转基因小鼠的Guard型毛纤维显著变细，表明KAP13-1能够影响毛纤维的细度。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是绵羊KAP13-1基因的核苷酸序列(1-753bp)；其中24-518bp是该基因的编码区(CDS)，即绵羊KAP13-1基因编码的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是绵羊KAP13-1基因编码的蛋白质序列，编码164个蛋白质。

序列表SEQ ID NO:3是pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG载体的核苷酸序列，序列长度为10596bp；

序列表SEQ ID NO:4是绿荧光蛋白基因ZsGreen1的核苷酸序列，序列长度为696bp；

序列表SEQ ID NO:5是重组片段KAP13-1-2A-ZSG的核苷酸序列，序列长度为1242bp；

序列表SEQ ID NO:6是KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1载体的核苷酸序列，序列长度为4672bp；

序列表SEQ ID NO:7是绵羊KAP11-1启动子的核苷酸序列，序列长度为5954bp；

序列表SEQ ID NO:8是2A肽序列的核苷酸序列，序列长度为54bp；

序列表SEQ ID NO:9-10是用于扩增绵羊KAP13-1基因的引物序列；

序列表SEQ ID NO:11-14是用于扩增KAP13-1-2A-ZSG片段的引物序列；

序列表SEQ ID NO:15-16是用于扩增绵羊KAP11-1启动子的引物序列；

序列表SEQ ID NO:17-18是用于鉴定阳性转基因小鼠的引物序列；

图1：绵羊KAP13-1基因在毛囊中的表达模式图。附图标记说明：图1中的a图和图1中的b图分别表示KAP13-1基因在绵羊毛囊中的表达；图1中的c图是阴性对照。

图2：本发明涉及的载体和载体构建示意图。附图标记说明：图2a是载体pZsGreen1-1的结构示意图；图2b是载体KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1的结构示意图；图2c是本发明构建的重组载体pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG的结构示意图；图2d是商业质粒(载体)pMD19-T的结构示意图。

图3：转基因小鼠在基因组水平的PCR检测结果。附图标记说明：图3中的DL2000泳道购自宝生物工程大连有限公司；图3中的2#泳道是2号转基因小鼠的基因组；图3中的4#泳道是4号转基因小鼠的基因组；图3中的6#泳道是6号小鼠的基因组；目的片段大小为1241bp。

图4：转基因小鼠的毛纤维在荧光显微镜下的检测图片。

图5：绵羊KAP13-1基因(sKAP13-1)在转基因小鼠中各组织中的表达模式。

图6:绵羊KAP13-1基因在转基因小鼠毛囊中的表达检测。

具体实施方案式

实施例1:绵羊KAP13-1编码序列的克隆及其在绵羊中的组织表达谱

根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布的牛的KAP13-1基因序列(登陆号NM_001080350.1)设计引物，以绵羊皮肤(含有毛囊)的cDNA为模板作PCR扩增，设计如下所示的引物序列：扩增KAP13-1基因的引物对:

正向引物：5’-CGTAACTCACATCACCTGCG-3’,

反向引物：5’-TGCTTCCGTATCGCATGTCT-3’。

PCR反应条件如表1所示：

表1 PCR扩增体系

取PCR反应液，经琼脂糖凝胶电泳后，用宝生物工程大连有限公司生产的胶回收试剂盒MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0进行回收纯化，然后连接至载体pMD19-T(购自宝生物工程大连有限公司，载体结构如图2d所示)，进行转化后于37℃恒温培养，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，选择阳性菌进行测序，序列测定委托北京擎科新业生物技术有限公司完成。

在NCBI网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件中对获得的绵羊KAP13-1核苷酸序列进行比对，其与牛的KAP13-1基因mRNA序列(登陆号为NM_001080350.1)同源性为97％；与预测的羊的KAP13-1基因mRNA序列(登陆号为XM_004002776.3)同源性为99％。

实施例2：KAP13-1基因在绵羊毛囊中的表达模式

1.样品采集：

采集2周岁的西藏羊(来源于西藏大学农牧学院)皮肤组织，浸泡于4％的多聚甲醛溶液中24h-48h进行固定。

2.石蜡切片的制作：

(1)漂洗：将皮肤组织置于脱水框中，用流水漂洗12-16h；

(2)脱水：将皮肤组织置于梯度酒精中脱水，70％，过夜；80％，2h；90％，2h；95％，2h；100％(I)，40min；100％(II)，40min；

(3)通透：将脱水的皮肤组织置于水杨酸甲酯中透明1h；

(4)浸蜡包埋：将通透的皮肤组织分别置于石蜡(I)2h；石蜡(II)3h；石蜡(III)3h，然后置于包埋框中进行包埋固定；

(5)切片：切取厚度5μm皮肤组织切片。

3.免疫组化：

(1)烘片脱蜡：将石蜡切片放于60℃烘箱中30min，然后分别浸入二甲苯I 15min，二甲苯II 15min进行脱蜡；

(2)复水：将切片依次置于梯度酒精中进行复水，100％酒精I 5min，100％II酒精5min，95％酒精 5min,90％酒精 5min，80％酒精 5min，75％酒精 5min，蒸馏水 5min；

(3)内源性过氧化物酶的消除：将切片浸泡于3％双氧水中，37℃25min；然后与蒸馏水中洗涤5min；

(4)微波修复：皮肤切片在0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液中修复，微波至沸腾后冷却5min，此步骤重复3次后冷却至室温；

(5)封闭：用PBS缓冲液(购自谷歌生物科技有限公司)洗涤皮肤切片3次，每次5min；在组织周围勾画疏水框，将5％BSA加入到疏水框内，37℃20min；

(6)一抗孵育：滴加藏绵羊KAP13-1抗体(按体积比1:500稀释)于疏水框内，4℃孵育过夜；

(7)二抗孵育：PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；滴加二抗(购于武汉博士德生物工程有限公司)于组织上，37℃孵育30min；

(8)链霉亲和素-生物素复合物SABC孵育：PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；加入SABC与组织上，37℃25min；

(9)显色：PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；将DAB试剂(购自武汉博士德生物工程有限公司)中的A,B,C液依次滴加一滴于1mL蒸馏水中，混匀后加入组织上进行显色；

(10)苏木素复染：在苏木素中染色20s，用1％盐酸酒精分化液分化2s；

(11)脱水封片：将切片置于烘箱中脱水10min，放入二甲苯I/II各15min，然后用中性树胶封片，风干后进行图像采集,结果如图1所示，结果表明KAP13-1基因在绵羊的皮质部表达。

实施例3：pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus载体的构建

1.KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1载体的构建

(1)KAP13-1-2A基因片段的扩增：

用Oligo7软件设计扩增KAP13-1-2A基因片段的融合PCR引物，引物的具体序列如下：

扩增KAP13-1-2A基因的引物对：

正向引物：5’-CCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGT

CCTACAACTGCTGCTCTGG-3’，

反向引物：5’-CTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTC

TGCCCTCGTAGAAGCCAGATCCACA-3’。

以上述的连接绵羊KAP13-1基因序列的T克隆载体为模板，PCR扩增KAP13-1-2A基因，反应体系剪表2。

表2 PCR反应体系

(2)2A-ZSG片段的扩增：

然后，根据宝生物工程大连有限公司的pZsGreen1-1载体中的绿荧光蛋白基因ZsGreen1的核苷酸序列设计融合PCR引物，引物对的DNA序列如下：

扩增2A-ZSG基因的引物对：

正向引物：5’-GATCTGGCTTCTACGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGA

CGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGCCCAGTCCAAG-3’，

反向引物：5’-GATTATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCAGGGCAAGG-3’。

以pZsGreen1-1载体为模板扩增2A-ZSG基因，PCR反应体系如表3。

表3 PCR反应体系

(3)KAP13-1-2A-ZSG片段的扩增：

取KAP13-1-2A PCR产物1μl和2A-ZSG PCR产物1μl于98μl dH₂O中并以其为模板通过融合PCR扩增KAP13-1-2A-ZSG载体序列，PCR反应如表4。

表4 PCR反应程序

通过胶回收试剂盒(宝生物工程大连有限公司，MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0)对PCR产物进行回收纯化，然后用SacII和NotI限制性内切酶(购自宝生物工程大连有限公司)分别对纯化产物KAP13-1-2A-ZSG片段和pZsGreen1-1载体(载体结构如图2a所示)进行酶切，通过T4连接酶(购自赛默飞世尔科技)将KAP13-1-2A-ZSG片段连接到pZsGreen1-1载体上，构建得到KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1载体(载体结构如图2b)。双酶切体系和连接体系如表5。

表5双酶切体系和连接体系

将5μl连接产物加入100μl感受态细胞中，冰上放置5min，42℃热激45s，随后将其涂到具有卡那霉素的LB固体培养基中，放置于37℃培养箱中培养12-16h。然后挑取单个菌落于具有卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220r/min培养过夜。通过上述扩增KAP13-1-2A片段的PCR反应鉴定阳性菌落，然后挑选阳性菌液测序，序列测定委托北京擎科新业生物技术有限公司完成。通过NCBI网站的BLAST软件比对获得序列正确的KAP13-1-2A-ZSG片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

2.pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG载体的构建

以藏绵羊的脾脏基因组为模板，通过PCR扩增约6kb的KAP11-1基因的启动子序列，命名为pKAP11-1。所用引物序列如下所示：

绵羊KAP11-1启动子序列：

正向引物：5’-CCGCTCGAGCCCCTGGATAGAAAGATCAGACCAA-3’，

反向引物：5’-TCCCCGCGGCTTGGTGCTGGTGGAGAGATGT-3’。

PCR反应程序见表6。

表6 PCR反应体系

然后，通过胶回收试剂盒(宝生物工程大连有限公司)对PCR产物进行回收纯化；利用XhoI/SacII酶切回收片段，然后将pKAP11-1序列连接到KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1载体中，申请人将这个载体命名为重组载体pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG(载体结构见图2c)，PCR反应体系见表7。

表7双酶切体系和连接体系

将连接产物转化入感受态细胞中并涂到具有卡那抗性的LB固体培养基中37℃培养12-16h；挑取阳性单克隆于具有卡那霉素LB液体培养基中，37℃，220r/min，培养过夜，序列测定委托北京擎科新业生物技术有限公司完成。通过NCBI网站的BLAST软件比对获得序列正确的绵羊KAP11-1启动子序列进而获得重组载体pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG(该载体序列如SEQ ID NO:3所示)。

实施例4：pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus转基因小鼠的构建及转基因小鼠的鉴定

1.转基因小鼠的制备

通过PiggyBac系统将pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG序列随机整合到昆明小鼠的基因组上，获得pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus转基因小鼠(简称Plus小鼠)，转基因小鼠的制备委托于北京唯尚立德生物科技有限公司完成。

2.转基因阳性小鼠的鉴定

通过Oligo7软件根据KAP13-1-2A-ZSG序列设计引物：

转基因小鼠鉴定引物：

正向引物：5’-GGTTCTAAGGCAAGCTGGTG-3’,

反向引物：5’-AGGTACATGCTCACGTCGC-3’。

对获得的转基因小鼠以基因组为模板进行PCR检测，PCR反应体系如表8所示。

表8 PCR反应体系

通过琼脂糖凝胶鉴定目的基因是否成功插入昆明小鼠基因组中，结果如图4所示，结果表明本发明共获得3只阳性转基因小鼠(如图3所示)。

为了进一步鉴定转基因阳性小鼠，申请人分别剪取三只转基因小鼠的背部毛纤维和胡须毛纤维，将毛纤维均匀平铺在装有水的12孔培养板中，然后在荧光显微镜下检测绿荧光蛋白ZSG的表达，结果如图4所示。结果表明编号为6号的转基因小鼠的毛纤维具有较强的绿荧光活性，编号为2号和4号的转基因小鼠毛纤维的绿荧光活性极弱，因此本发明将编号为6号的转基因小鼠用于后续研究中。

实施例5：KAP13-1在转基因小鼠中表达模式的鉴定

通过免疫组化和Western blotting方法检测绵羊KAP13-1在Plus小鼠中的表达模式，结果表明KAP13-1在Plus小鼠毛纤维的皮质部特异表达。具体操作步骤如下:

1.Western blotting：

(1)蛋白提取：采集出生后35:日龄的Plus小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肌、肠、胃、脑、皮、毛；除毛之外的组织在组织裂解液(购于上海碧云天生物技术有限公司)中破碎，12000rpm离心20min，吸取上清收集蛋白；通过姚金波等报道的优化还原C法(姚金波等.毛纺科技,2003)提取毛纤维的蛋白，将毛纤维置于裂解液(亚硫酸氢钠100％owf(对织物重)、脲300g/L、SDS 15g/L)，煮沸3h，12000rpm离心10min，吸取上清收集蛋白；

(2)电泳：将5×蛋白上样缓冲液(购自武汉博士德生物工程有限公司)加入到提取的蛋白中，煮沸10min变性；然后将样品加入到已制备好的聚丙酰胺凝胶中；在浓缩胶中恒压80V电泳，在分离胶中恒压100V电泳直至条带分开；

(3)转膜:以恒流250mA将聚丙烯胺凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上，转膜时间为40-50min；

(4)封闭:将转膜完毕的PVDF膜放置于5％的脱脂奶粉中封闭2-3h；

(5)一抗孵育：封闭完毕后，用5％脱脂奶粉按体积比为1:500的比例稀释藏绵羊KAP13-1抗体，同时以体积比为1:1000稀释内参抗体Beta-actin(购自上海碧云天生物技术有限公司)，然后分别将将PVDF膜置于稀释的抗体中4℃度孵育过夜；

(6)二抗孵育：在TBST漂洗液中洗涤PVDF膜，重复洗涤3-5次，每次5min。将辣根过氧化物(HRP)标记的二抗(购自武汉博士德生物工程有限公司)按体积比为1:1000的比例稀释于5％脱脂奶粉中，室温下孵育1h；

(7)显色：在TBST漂洗液中洗涤PVDF膜，重复洗涤3-5次，每次5min。用ECL化学发光底物试剂盒(购自Bio-Rad公司)对PVDF膜上的免疫印迹进行显色，通过ImageQuant LAS4000化学发光成像分析仪(GE healthcare)获得图像结果，如图5所示。

2.组织免疫组化

(1)样品采集：

采集出生后9天的Plus小鼠的皮肤组织，浸泡于4％的多聚甲醛溶液中24h-48h进行固定。

(2)石蜡切片的制作：

漂洗：将Plus小鼠皮肤组织置于脱水框中，用流水漂洗12-16h；

脱水：将皮肤组织置于梯度酒精中脱水，70％，过夜；80％，2h；90％，2h；95％，2h；100％(I)，40min100％(II)，40min；

通透：将脱水的皮肤组织置于水杨酸甲酯中透明40min；

浸蜡包埋：将通透的皮肤组织分别置于石蜡(I)2h；石蜡(II)3h；石蜡(III)3h，然后置于包埋框进行包埋固定；

切片：切取厚度5μm皮肤组织切片。

(3)免疫组化

烘片脱蜡：将石蜡切片放于60℃烘箱中30min，然后分别浸入二甲苯I 15min，二甲苯II 15min进行脱蜡；复水：将切片依次置于梯度酒精中进行复水，100％酒精I 5min，100％II酒精 5min,95％酒精 5min,90％酒精 5min，80％酒精 5min，75％酒精 5min，蒸馏水 5min；

内源性过氧化物酶的消除：将切片浸泡于3％双氧水中，37℃25min；然后与蒸馏水中洗涤5min；

微波修复：皮肤切片在0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液中修复，微波至沸腾后冷却5min，此步骤重复3次后冷却至室温；

封闭：用PBS缓冲液洗涤皮肤切片3次，每次5min；在组织周围勾画疏水框，将5％BSA加入到疏水框内，37℃20min；

一抗孵育：滴加藏绵羊KAP13-1抗体(体积比为1:200稀释)于疏水框内，4℃孵育过夜；

二抗孵育：PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；滴加购于武汉博士德生物工程有限公司的辣根过氧化物

(HRP)标记的羊抗兔二抗于组织上，37度孵育30min；

SABC孵育：PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；加入SABC与组织上，37℃25min；

显色：PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；将购自武汉博士德生物工程有限公司的DAB试剂中的A,B,C液依次滴加一滴于1mL蒸馏水中，混匀后加入组织上进行显色；

苏木素复染：在苏木素中染色20s，盐酸酒精分化2s；

脱水封片：将切片置于烘箱中脱水10min，放入二甲苯I/II各15min，然后用中性树胶封片，风干后进行图像采集，结果如图6所示。

实施例6：KAP13-1在转基因小鼠的生物功能验证

本实施例分别采集出生后35天的Plus小鼠、皮质部特异表达绿荧光蛋白的pKAP11-1-ZSG转基因小鼠和野生昆明小鼠的Guard型毛纤维，每种类型的小鼠各6只，其中雄性小鼠3只，雌性小鼠3只；每只小鼠采集约40-60根Guard型毛纤维。然后通过显微镜测量距离毛囊底部130μm处的毛纤维直径，然后进行统计分析，结果见表9。

表9 Guard型毛纤维直径统计分析结果

表9的说明：^**表示P<0.01,^*表示P<0.05。

由表9结果显示，在相同性别测试中，本发明的Plus小鼠的Guard型毛纤维比pKAP11-1-ZSG转基因小鼠和野生昆明小鼠Guard型毛纤维显著变细。证明KAP13-1基因能够显著影响毛纤维的细度。

主要参考文献：

1.Rogers M A,Schweizer J.Human KAP genes,only the half of it？Extensive size polymorphisms in hair keratin-associated protein genes[J].JInvest Dermatol,2005,124:vii-ix.

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9.姚金波等.还原C法制备羊毛角蛋白溶液的工艺优化[J].毛纺科技,2003,5:10-13。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种KAP13-1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用

<130>

<141> 2016-11-12

<160> 18

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 绵羊（Ovis aries）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(753)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (24)..(518)

<223>

<400> 1

cgtaactcac atcacctgcg aag atg tcc tac aac tgc tgc tct gga aac ttc 53

Met Ser Tyr Asn Cys Cys Ser Gly Asn Phe

1 5 10

tcc tcc cgc tcc ctc cgg gac cac ctg cgc tac tca ggc tcc tcc tgt 101

Ser Ser Arg Ser Leu Arg Asp His Leu Arg Tyr Ser Gly Ser Ser Cys

152025

ggc tcc tcc ttc ccc agc aac ctg gtc tac agg act gac ctc tac tct 149

Gly Ser Ser Phe Pro Ser Asn Leu Val Tyr Arg Thr Asp Leu Tyr Ser

303540

ccc agc tcc tgc cag ctg ggc tcc tct ctc tac agc cag gag acc tgc 197

Pro Ser Ser Cys Gln Leu Gly Ser Ser Leu Tyr Ser Gln Glu Thr Cys

455055

tgt gag ccc atc agg acc cag act gtg gtg tcc agt ccc tgc cag acg 245

Cys Glu Pro Ile Arg Thr Gln Thr Val Val Ser Ser Pro Cys Gln Thr

606570

tcc tgc tac cgc ccg agg acc tcc acg ttc ttc agt ccc tgc cag acg 293

Ser Cys Tyr Arg Pro Arg Thr Ser Thr Phe Phe Ser Pro Cys Gln Thr

75808590

act tgc tct gga tct ctg ggc ttc ggt tcc agt aac ttg caa tct gct 341

Thr Cys Ser Gly Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Asn Leu Gln Ser Ala

95100 105

ggt cat gtt ttc cca tct ctg ggc ttt gga tcc ggt ggt ttc caa tcc 389

Gly His Val Phe Pro Ser Leu Gly Phe Gly Ser Gly Gly Phe Gln Ser

110 115 120

gtg ggt cac agc ccc aac att ttc tca tcc cta agt tgt aga tcc agc 437

Val Gly His Ser Pro Asn Ile Phe Ser Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser

125 130 135

ttt tac cgt ccc acc ttc ttc tct tct agg agt ggt cag tct ctt tct 485

Phe Tyr Arg Pro Thr Phe Phe Ser Ser Arg Ser Gly Gln Ser Leu Ser

140 145 150

ttc caa ccg acc tgt gga tct ggc ttc tac taa tgtcatactt gaatacaata 538

Phe Gln Pro Thr Cys Gly Ser Gly Phe Tyr

155 160

catactacat ctagaattta atgcaatgct taactatatc gagatctaca ctatctgttg 598

acctcttgtt ttacctttag cttataaatt tgacttctgc tgttacctac actggataag 658

gaataatttg aataccggta actgaaaatg tattcattga agaaaggtgc cataactact 718

cccttgtagc tatatagaca tgcgatacgg aagca753

<210> 2

<211> 164

<212> PRT

<213> 绵羊

<400> 2

Met Ser Tyr Asn Cys Cys Ser Gly Asn Phe Ser Ser Arg Ser Leu Arg

1 5 1015

Asp His Leu Arg Tyr Ser Gly Ser Ser Cys Gly Ser Ser Phe Pro Ser

202530

Asn Leu Val Tyr Arg Thr Asp Leu Tyr Ser Pro Ser Ser Cys Gln Leu

354045

Gly Ser Ser Leu Tyr Ser Gln Glu Thr Cys Cys Glu Pro Ile Arg Thr

505560

Gln Thr Val Val Ser Ser Pro Cys Gln Thr Ser Cys Tyr Arg Pro Arg

65707580

Thr Ser Thr Phe Phe Ser Pro Cys Gln Thr Thr Cys Ser Gly Ser Leu

859095

Gly Phe Gly Ser Ser Asn Leu Gln Ser Ala Gly His Val Phe Pro Ser

100 105 110

Leu Gly Phe Gly Ser Gly Gly Phe Gln Ser Val Gly His Ser Pro Asn

115 120 125

Ile Phe Ser Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Phe Tyr Arg Pro Thr Phe

130 135 140

Phe Ser Ser Arg Ser Gly Gln Ser Leu Ser Phe Gln Pro Thr Cys Gly

145 150 155 160

Ser Gly Phe Tyr

<210> 3

<211> 10596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(10596)

<223>

<220>

<221> gene

<222> (6021)..(7262)

<223>

<220>

<221> promoter

<222> (37)..(5990)

<223>

<400> 3

tagttattac tagcgctacc ggactcagat ctcgagcccc tggatagaaa gatcagacca 60

agaacagttg cattgaaagg gcatcagcac aggtcagcta ggtgatgcta aagacaagat 120

ttaccttata cttctttctc tcacatagct cctattaata gcatccttat cctcctgggt 180

accaaggaga ccctgaataa ttctgtatca gggaaggata atacacttgt gtgactttgg 240

gccttctctc tggccctata cataaacgtt actcacgtct ggtcaaaggc gggttcactt 300

cttgttactt gaaagactgg gactggagca cataccagct acacatgtga tatcctgcaa 360

gagagtttgt ttggtctcca aacttgggaa tctacttact tttattgaga gcatcctgat 420

tctgatctcc aataaaagca ttcgtgaaaa aatacatgat tttgaaaaca ggcatgaaga 480

aagagaatgg cagttcaact ttggattttt caaccttaca ttatcctctg aggatttatt 540

tttctacaaa tcttgttgct ggtgattgct attttcaagt tctaaaagca gcaactattt 600

tgctggtctt tgcctgcttc tttcactttt ctgctttctg ccttacattt ccctccagcc 660

ccaaagattc aaacctttgt atgattgacg ctttttgaaa agagtttgga aaatgaattt 720

cagctcagtt ttggtgcaaa tcactcagcc tttggggggt ttataatgtc ttggttaata 780

agaattctgg agattcaagc tggaggtctg tgtgaagttg ggaaaaaatg gcagaacaat 840

tcagccaaga tgtattttgt ttttaaagca gtcattatgt tctgtcctta gaatttttca 900

attccctttt tatgtttttt aagatagaat gaatagcttt catttcagag tatgagcatc 960

ctggaaaagt gcaggatgac aaattctaat tttatgttta ttaatttttc agcaagttta 1020

atattgctcc attcgatgag actaggtgat ttttttttga accagcattg ataaacatta 1080

ttaccaattt tgtgataaaa aatatccttc ctgcatgtca aaacttcagc ctcccacaca 1140

tgcttaattc tttttactct caaacacttg gccttgtcag tgattgctgt gattcagttt 1200

tgagtgaaag aattgctcat ttccagtctg tgataattat tgtataaggc ttagattgtt 1260

ctatacaaac gagagcaaat tacccatcaa ggatgtagat aatgggtagt agtactttaa 1320

tctcctctca tcttctctca tcatatactc ctctcacttc acaccctgca gacacaggaa 1380

taatctttgc aaaccttttc gctgacttga agtttgatat tgcatataac tatctcgtga 1440

tagctgctgg atgcaaaatt ttttcttaca ttccaatgaa aggatgattt attgatttca 1500

cttagcaaca ctgtagactt agaatcatgt cttcaagctt catgttgctg tcagtgccta 1560

tttctttttt cttttggcaa attttagcat tgttttaatt aaggaacata gctgtttgaa 1620

acaggagatt ttaagctagt tgaatagaag caaagtgaaa gattcctcta ttaggatagc 1680

tgctatgaat aaaatcctta ctatgtggat ttgaattcca ttgtaaattt ggcactaaac 1740

aacactggtc taagccaaaa atttctcatt tttgtttaga agccctgaac attttctttc 1800

acatttaagg aggggaaagg gaagaaaagg aaaaggggaa aaaaagcact ctataataga 1860

atctcattag cttgataatg ggtatgctga ttgtaacttg gtactcccta aacaatttca 1920

gataatggca aacaacttaa aatgtaggtg agatgtgaat ttgcaaaaac ctctttcctt 1980

gatgtgcatg gttctttact tttgcatctt acactcaatt caaatgaaga atctagatgc 2040

tggcatttac atattgaatg tacaagagtg ttaagcagca attctagctc cttgtgtgtg 2100

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgct cagttgctgt catgtccaac tctttgtgac 2160

ccatggattt tagccccccg aggctcctct gtccttggga tttttccgta ggatattgta 2220

agacactagc ctttgctgtt tttcagagaa cttgccattt cgccggggct aaatattgag 2280

tagaaagcag tctattgatt agtgccttta gctctaacta tttaaagagt ctcttggttt 2340

tgcttacttt gtgacaggga gaaaactcta caatatcatc ttagagtgat tttgttaggg 2400

gaagcacact gactgaaact gcccaccctg gccaggccct ttagtaacca tttgcatgag 2460

ttattttatg accggagatc ctggtaagga atatggaact gataagccac cactaactgg 2520

aagagttcgg gaaaggtcaa aaggagacac cacgtgtcgg tccacttcca agaatccctc 2580

tcgctagcat ccatctaggc tgagcaatgc gtgcaccacc aggaaaaact ctgaattaga 2640

atgattggcc aaagaccacc ctgaaactaa tcctatcacc ataaaaccca agactgcaag 2700

ccacatggca gagcagttct cctgagttcc cctaccctgc taatctccac ctggttgccc 2760

tttcccaata aaatctcttg ctttgtcagc agatatgtct cctcggacaa ttcatttcca 2820

agtgttagac aagagcccag ttttgggctc tggaaggggt cccccttcct gcaacaattt 2880

cagaatttgt gagtcctgtt ttctcagagg agtcatgaca cctagatttc aaaactcaat 2940

tcacttctct attcttctct aataattagt tgtacatgtc accattaaaa ataatttcaa 3000

tttcaaattg tagctgcaag ctattaaagg ctttctgtct cttcctgctt tgtttgtagt 3060

gatcttgcac tttattctgt taggtagttg gaataggaaa aaggagtcca gcatggtggt 3120

ggctaaaaga caaggaaggg aaaagcccac taaaatagaa caaaggaagg tccaaggatt 3180

ggaatgagga cctcaggtag aacaaacagc actcctggct ggcccaattt acacaggaca 3240

agcccagggg gaggaggaaa gacatagaaa gaggagccaa agggcccagg ctctctgtct 3300

cttgtctttc tctctcttct ttttgcatct tttggtttgg catgccctca caccttgagg 3360

atgtattttc ctttattttc taaataagac agctgtaaca ctggtctatc tgagagctgt 3420

gacgcactga gggctttaac gtctgtcgct tcaaattttt gttgtgatga gacagaaccg 3480

aggaaattac acactcccct gacaattcta atgaagtaaa attatcaaaa ttatatatca 3540

tgaaaaaacc ctcataaagt ttaaagacag cagtgcttgt aacttactat ttaaaatttt 3600

atttattttt gttgttgtta attaatggaa ctggaataga cataaagact gtattctttg 3660

tggtgtcatc aataaaacat tgattacttg atttttcaaa taaatttttg cttgaacttt 3720

aatgaaggca tctcaccatg tttgaatatt cccagcatag gttcacaaca catgactctg 3780

ttttattcac atctcaactt agccaagtat aaactgtgtg actttggtta gtcattaaac 3840

ctccctgaac ttcagcttct ttatgtgaca tgatacctag tccttagggt tgctggatgc 3900

actctgttct gatggtgtat gtgaaatctc taatttaatg cctggaagag cctcaaaagt 3960

gttcatttcc tttccctctg aagctgaagg aagatgtttt ctagaatttt ttaaattatg 4020

atttttaact tttaatggaa aagagaaata aagacagagc aacagtttat acaaattctc 4080

ttccagaaat gtggcaatag gtattagaaa cttctcttgt gtcacttgac cactaacttc 4140

acattttcat gtggtcactt gattaattta cacaatgaag tacgtctcca cagctgtctg 4200

tgtatccctg gctggtagaa gcctgtaaac tacacatcca ttttcaaaga aggaagccag 4260

ctcctgtgac caggaccttg acctccaaac accaactggg aaattcccca tggttggaag 4320

agcatagtcc taaccttgtg gaaagtagtc atctctttaa tttctcccca tacccgagta 4380

catgtttgtg agccactgag ggagagacag tgtgatccct gggaattata atacgtccca 4440

cagcacagca tcgttttgtt ggggtgtatt attagcctcc aaattagagc cgtggggagc 4500

tcccaacatg gcttcagtgg gatgaataga gatgaataaa gcattcagca aaaggacttc 4560

tggtgagatc taacataaag ctgtttgctt tgtgcatgtt taaaatatag cctactacag 4620

ccctcaaata tatgtaaatt catcgctgtc actctttcct accccatgta agccagttta 4680

cataatgaat cagctcttac agctgttttg atgtagaaat atcaccaacc atttaagctg 4740

tgctgaagtg acttattttt ccagggttga aatggttttc tacagatgga tcacaaggct 4800

cagtcatttt ggcattggga actgaatccg ttgtagcaaa gtgaaatcac agagagaata 4860

tctttctatg gtttccccaa gaataaaaag aataattaaa tattacagcc cactgttcac 4920

acatccattc atcaccaaat attgattaag ggcctgtttc ctccactctc tcctcccttt 4980

atccttcatg tagacagtga ccctgaagag cctttgattt gtctgtgatg aaagtgcatc 5040

ctatctgtaa gtttttgtgt gaaaataaat gccttttgaa tatattgagc actttgagag 5100

aaagacatca tgccctttca aatgaacatt ataataattt aataaattaa ctaaacctgt 5160

tccactgaca cattgatgag tcatatgagt tgctcttatc cattgttaca agattaaaca 5220

ttttgggaat aaagctcatc caatttattg agaaagaaac ttggctacaa atgcagtccc 5280

acttaattag cttctgttcc aagttgccta gctgcttgaa cataaatggt gagtcccatt 5340

gccctctgag tttcctgggg gcatcttgct ctgatcactt aattgatttt ccaaaccagt 5400

ttgtactctg gatatatctt tgtgtccttt ttcagtcttg tcattatcat cttgaagcat 5460

attcaacaaa attctttgta gaagccccgt tagctatgga agagtgactg attaaattaa 5520

gcatattaag taccaacaac aatccaaaca gggtgtggct gtgtaatgag tcctggttag 5580

aagggagaga gggtgggatg gtagtgtgtt tggtgttact gtcagaggga cactcactgt 5640

atccacgcaa gatgaatgag ggatgaattg tgggctggga tgaccaatag ctttgaagct 5700

gtcaacccac ctccttaatc ctggaactaa gtacagtcca gaagcctttt gacttagtta 5760

ccaaactact aaactttctt tatgaggatg aaggcttttc aagagacaat taacctggaa 5820

attcacagga ggttctaagg caagctggtg tgagccaaag aagccaggaa ggtcagggtg 5880

ggagccccac ccaccagcaa gaatgtataa aagctcagaa gcctgaagtg gcattcacag 5940

ttcaagaacc agcctcagtg agttacccac atctctccac cagcaccaag ccgcgggccc 6000

gggatccacc ggtcgccacc atgtcctaca actgctgctc tggaaacttc tcctcccgct 6060

ccctccggga ccacctgcgc tactcaggct cctcctgtgg ctcctccttc cccagcaacc 6120

tggtctacag gactgacctc tactctccca gctcctgcca gctgggctcc tctctctaca 6180

gccaggagac ctgctgtgag cccatcagga cccagactgt ggtgtccagt ccctgccaga 6240

cgtcctgcta ccgcccgagg acctccacgt tcttcagtcc ctgccagacg acttgctctg 6300

gatctctggg cttcggttcc agtaacttgc aatctgctgg tcatgttttc ccatctctgg 6360

gctttggatc cggtggtttc caatccgtgg gtcacagccc caacattttc tcatccctaa 6420

gttgtagatc cagcttttac cgtcccacct tcttctcttc taggagtggt cagtctcttt 6480

ctttccaacc gacctgtgga tctggcttct acgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg 6540

gtgacgtgga ggagaatccc ggccctatgg cccagtccaa gcacggcctg accaaggaga 6600

tgaccatgaa gtaccgcatg gagggctgcg tggacggcca caagttcgtg atcaccggcg 6660

agggcatcgg ctaccccttc aagggcaagc aggccatcaa cctgtgcgtg gtggagggcg 6720

gccccttgcc cttcgccgag gacatcttgt ccgccgcctt catgtacggc aaccgcgtgt 6780

tcaccgagta cccccaggac atcgtcgact acttcaagaa ctcctgcccc gccggctaca 6840

cctgggaccg ctccttcctg ttcgaggacg gcgccgtgtg catctgcaac gccgacatca 6900

ccgtgagcgt ggaggagaac tgcatgtacc acgagtccaa gttctacggc gtgaacttcc 6960

ccgccgacgg ccccgtgatg aagaagatga ccgacaactg ggagccctcc tgcgagaaga 7020

tcatccccgt gcccaagcag ggcatcttga agggcgacgt gagcatgtac ctgctgctga 7080

aggacggtgg ccgcttgcgc tgccagttcg acaccgtgta caaggccaag tccgtgcccc 7140

gcaagatgcc cgactggcac ttcatccagc acaagctgac ccgcgaggac cgcagcgacg 7200

ccaagaacca gaagtggcac ctgaccgagc acgccatcgc ctccggctcc gccttgccct 7260

gagcggccgc gactctagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 7320

ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 7380

gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 7440

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 7500

tcttaaggcg taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta 7560

aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga 7620

atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa 7680

cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga 7740

accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc 7800

taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga 7860

agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg 7920

cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt 7980

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 8040

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtcc 8100

tgaggcggaa agaaccagct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc 8160

tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga 8220

aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 8280

accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 8340

tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 8400

tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaagat 8460

cgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 8520

ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 8580

ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 8640

gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct 8700

ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 8760

ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 8820

cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 8880

ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 8940

cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 9000

gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 9060

tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 9120

ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 9180

agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 9240

ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg 9300

ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc 9360

gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc 9420

cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccta gggggaggct aactgaaaca 9480

cggaaggaga caataccgga aggaacccgc gctatgacgg caataaaaag acagaataaa 9540

acgcacggtg ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc ggtcccaggg ctggcactct 9600

gtcgataccc caccgagacc ccattggggc caatacgccc gcgtttcttc cttttcccca 9660

ccccaccccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg ggcggcaggc 9720

cctgccatag cctcaggtta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 9780

tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 9840

gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat 9900

cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg 9960

gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 10020

gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 10080

tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt 10140

ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 10200

cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 10260

gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 10320

gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 10380

gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 10440

cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 10500

tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc 10560

cctgattctg tggataaccg tattaccgcc atgcat 10596

<210> 4

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(696)

<223>

<400> 4

atggcccagt ccaagcacgg cctgaccaag gagatgacca tgaagtaccg catggagggc 60

tgcgtggacg gccacaagtt cgtgatcacc ggcgagggca tcggctaccc cttcaagggc 120

aagcaggcca tcaacctgtg cgtggtggag ggcggcccct tgcccttcgc cgaggacatc 180

ttgtccgccg ccttcatgta cggcaaccgc gtgttcaccg agtaccccca ggacatcgtc 240

gactacttca agaactcctg ccccgccggc tacacctggg accgctcctt cctgttcgag 300

gacggcgccg tgtgcatctg caacgccgac atcaccgtga gcgtggagga gaactgcatg 360

taccacgagt ccaagttcta cggcgtgaac ttccccgccg acggccccgt gatgaagaag 420

atgaccgaca actgggagcc ctcctgcgag aagatcatcc ccgtgcccaa gcagggcatc 480

ttgaagggcg acgtgagcat gtacctgctg ctgaaggacg gtggccgctt gcgctgccag 540

ttcgacaccg tgtacaaggc caagtccgtg ccccgcaaga tgcccgactg gcacttcatc 600

cagcacaagc tgacccgcga ggaccgcagc gacgccaaga accagaagtg gcacctgacc 660

gagcacgcca tcgcctccgg ctccgccttg ccctga 696

<210> 5

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1242)

<223>

<400> 5

atgtcctaca actgctgctc tggaaacttc tcctcccgct ccctccggga ccacctgcgc 60

tactcaggct cctcctgtgg ctcctccttc cccagcaacc tggtctacag gactgacctc 120

tactctccca gctcctgcca gctgggctcc tctctctaca gccaggagac ctgctgtgag 180

cccatcagga cccagactgt ggtgtccagt ccctgccaga cgtcctgcta ccgcccgagg 240

acctccacgt tcttcagtcc ctgccagacg acttgctctg gatctctggg cttcggttcc 300

agtaacttgc aatctgctgg tcatgttttc ccatctctgg gctttggatc cggtggtttc 360

caatccgtgg gtcacagccc caacattttc tcatccctaa gttgtagatc cagcttttac 420

cgtcccacct tcttctcttc taggagtggt cagtctcttt ctttccaacc gacctgtgga 480

tctggcttct acgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 540

ggccctatgg cccagtccaa gcacggcctg accaaggaga tgaccatgaa gtaccgcatg 600

gagggctgcg tggacggcca caagttcgtg atcaccggcg agggcatcgg ctaccccttc 660

aagggcaagc aggccatcaa cctgtgcgtg gtggagggcg gccccttgcc cttcgccgag 720

gacatcttgt ccgccgcctt catgtacggc aaccgcgtgt tcaccgagta cccccaggac 780

atcgtcgact acttcaagaa ctcctgcccc gccggctaca cctgggaccg ctccttcctg 840

ttcgaggacg gcgccgtgtg catctgcaac gccgacatca ccgtgagcgt ggaggagaac 900

tgcatgtacc acgagtccaa gttctacggc gtgaacttcc ccgccgacgg ccccgtgatg 960

aagaagatga ccgacaactg ggagccctcc tgcgagaaga tcatccccgt gcccaagcag 1020

ggcatcttga agggcgacgt gagcatgtac ctgctgctga aggacggtgg ccgcttgcgc 1080

tgccagttcg acaccgtgta caaggccaag tccgtgcccc gcaagatgcc cgactggcac 1140

ttcatccagc acaagctgac ccgcgaggac cgcagcgacg ccaagaacca gaagtggcac 1200

ctgaccgagc acgccatcgc ctccggctcc gccttgccct ga1242

<210> 6

<211> 4672

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(4672)

<223>

<220>

<221> gene

<222> (97)..(1338)

<223>

<400> 6

tagttattac tagcgctacc ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg 60

acggtaccgc gggcccggga tccaccggtc gccaccatgt cctacaactg ctgctctgga 120

aacttctcct cccgctccct ccgggaccac ctgcgctact caggctcctc ctgtggctcc 180

tccttcccca gcaacctggt ctacaggact gacctctact ctcccagctc ctgccagctg 240

ggctcctctc tctacagcca ggagacctgc tgtgagccca tcaggaccca gactgtggtg 300

tccagtccct gccagacgtc ctgctaccgc ccgaggacct ccacgttctt cagtccctgc 360

cagacgactt gctctggatc tctgggcttc ggttccagta acttgcaatc tgctggtcat 420

gttttcccat ctctgggctt tggatccggt ggtttccaat ccgtgggtca cagccccaac 480

attttctcat ccctaagttg tagatccagc ttttaccgtc ccaccttctt ctcttctagg 540

agtggtcagt ctctttcttt ccaaccgacc tgtggatctg gcttctacga gggcagagga 600

agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag aatcccggcc ctatggccca gtccaagcac 660

ggcctgacca aggagatgac catgaagtac cgcatggagg gctgcgtgga cggccacaag 720

ttcgtgatca ccggcgaggg catcggctac cccttcaagg gcaagcaggc catcaacctg 780

tgcgtggtgg agggcggccc cttgcccttc gccgaggaca tcttgtccgc cgccttcatg 840

tacggcaacc gcgtgttcac cgagtacccc caggacatcg tcgactactt caagaactcc 900

tgccccgccg gctacacctg ggaccgctcc ttcctgttcg aggacggcgc cgtgtgcatc 960

tgcaacgccg acatcaccgt gagcgtggag gagaactgca tgtaccacga gtccaagttc 1020

tacggcgtga acttccccgc cgacggcccc gtgatgaaga agatgaccga caactgggag 1080

ccctcctgcg agaagatcat ccccgtgccc aagcagggca tcttgaaggg cgacgtgagc 1140

atgtacctgc tgctgaagga cggtggccgc ttgcgctgcc agttcgacac cgtgtacaag 1200

gccaagtccg tgccccgcaa gatgcccgac tggcacttca tccagcacaa gctgacccgc 1260

gaggaccgca gcgacgccaa gaaccagaag tggcacctga ccgagcacgc catcgcctcc 1320

ggctccgcct tgccctgagc ggccgcgact ctagatcata atcagccata ccacatttgt 1380

agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat 1440

gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 1500

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 1560

caaactcatc aatgtatctt aaggcgtaaa ttgtaagcgt taatattttg ttaaaattcg 1620

cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 1680

cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 1740

gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 1800

atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag 1860

cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 1920

acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 1980

tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg 2040

cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 2100

tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 2160

gaaaaaggaa gagtcctgag gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 2220

tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 2280

agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 2340

tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 2400

gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 2460

cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 2520

aggcttttgc aaagatcgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 2580

atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 2640

cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 2700

cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag 2760

cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 2820

ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 2880

ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 2940

cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 3000

gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 3060

tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg 3120

tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 3180

gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 3240

cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 3300

gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 3360

gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 3420

tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 3480

cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctagggg 3540

gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta tgacggcaat 3600

aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg gggttcggtc 3660

ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat acgcccgcgt 3720

ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc tcgcagccaa 3780

cgtcggggcg gcaggccctg ccatagcctc aggttactca tatatacttt agattgattt 3840

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 3900

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 3960

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 4020

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 4080

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 4140

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 4200

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 4260

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 4320

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 4380

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 4440

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 4500

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 4560

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 4620

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgccatgc at 4672

<210> 7

<211> 5954

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(5954)

<223>

<400> 7

cccctggata gaaagatcag accaagaaca gttgcattga aagggcatca gcacaggtca 60

gctaggtgat gctaaagaca agatttacct tatacttctt tctctcacat agctcctatt 120

aatagcatcc ttatcctcct gggtaccaag gagaccctga ataattctgt atcagggaag 180

gataatacac ttgtgtgact ttgggccttc tctctggccc tatacataaa cgttactcac 240

gtctggtcaa aggcgggttc acttcttgtt acttgaaaga ctgggactgg agcacatacc 300

agctacacat gtgatatcct gcaagagagt ttgtttggtc tccaaacttg ggaatctact 360

tacttttatt gagagcatcc tgattctgat ctccaataaa agcattcgtg aaaaaataca 420

tgattttgaa aacaggcatg aagaaagaga atggcagttc aactttggat ttttcaacct 480

tacattatcc tctgaggatt tatttttcta caaatcttgt tgctggtgat tgctattttc 540

aagttctaaa agcagcaact attttgctgg tctttgcctg cttctttcac ttttctgctt 600

tctgccttac atttccctcc agccccaaag attcaaacct ttgtatgatt gacgcttttt 660

gaaaagagtt tggaaaatga atttcagctc agttttggtg caaatcactc agcctttggg 720

gggtttataa tgtcttggtt aataagaatt ctggagattc aagctggagg tctgtgtgaa 780

gttgggaaaa aatggcagaa caattcagcc aagatgtatt ttgtttttaa agcagtcatt 840

atgttctgtc cttagaattt ttcaattccc tttttatgtt ttttaagata gaatgaatag 900

ctttcatttc agagtatgag catcctggaa aagtgcagga tgacaaattc taattttatg 960

tttattaatt tttcagcaag tttaatattg ctccattcga tgagactagg tgattttttt 1020

ttgaaccagc attgataaac attattacca attttgtgat aaaaaatatc cttcctgcat 1080

gtcaaaactt cagcctccca cacatgctta attcttttta ctctcaaaca cttggccttg 1140

tcagtgattg ctgtgattca gttttgagtg aaagaattgc tcatttccag tctgtgataa 1200

ttattgtata aggcttagat tgttctatac aaacgagagc aaattaccca tcaaggatgt 1260

agataatggg tagtagtact ttaatctcct ctcatcttct ctcatcatat actcctctca 1320

cttcacaccc tgcagacaca ggaataatct ttgcaaacct tttcgctgac ttgaagtttg 1380

atattgcata taactatctc gtgatagctg ctggatgcaa aattttttct tacattccaa 1440

tgaaaggatg atttattgat ttcacttagc aacactgtag acttagaatc atgtcttcaa 1500

gcttcatgtt gctgtcagtg cctatttctt ttttcttttg gcaaatttta gcattgtttt 1560

aattaaggaa catagctgtt tgaaacagga gattttaagc tagttgaata gaagcaaagt 1620

gaaagattcc tctattagga tagctgctat gaataaaatc cttactatgt ggatttgaat 1680

tccattgtaa atttggcact aaacaacact ggtctaagcc aaaaatttct catttttgtt 1740

tagaagccct gaacattttc tttcacattt aaggagggga aagggaagaa aaggaaaagg 1800

ggaaaaaaag cactctataa tagaatctca ttagcttgat aatgggtatg ctgattgtaa 1860

cttggtactc cctaaacaat ttcagataat ggcaaacaac ttaaaatgta ggtgagatgt 1920

gaatttgcaa aaacctcttt ccttgatgtg catggttctt tacttttgca tcttacactc 1980

aattcaaatg aagaatctag atgctggcat ttacatattg aatgtacaag agtgttaagc 2040

agcaattcta gctccttgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgctcagttg 2100

ctgtcatgtc caactctttg tgacccatgg attttagccc cccgaggctc ctctgtcctt 2160

gggatttttc cgtaggatat tgtaagacac tagcctttgc tgtttttcag agaacttgcc 2220

atttcgccgg ggctaaatat tgagtagaaa gcagtctatt gattagtgcc tttagctcta 2280

actatttaaa gagtctcttg gttttgctta ctttgtgaca gggagaaaac tctacaatat 2340

catcttagag tgattttgtt aggggaagca cactgactga aactgcccac cctggccagg 2400

ccctttagta accatttgca tgagttattt tatgaccgga gatcctggta aggaatatgg 2460

aactgataag ccaccactaa ctggaagagt tcgggaaagg tcaaaaggag acaccacgtg 2520

tcggtccact tccaagaatc cctctcgcta gcatccatct aggctgagca atgcgtgcac 2580

caccaggaaa aactctgaat tagaatgatt ggccaaagac caccctgaaa ctaatcctat 2640

caccataaaa cccaagactg caagccacat ggcagagcag ttctcctgag ttcccctacc 2700

ctgctaatct ccacctggtt gccctttccc aataaaatct cttgctttgt cagcagatat 2760

gtctcctcgg acaattcatt tccaagtgtt agacaagagc ccagttttgg gctctggaag 2820

gggtccccct tcctgcaaca atttcagaat ttgtgagtcc tgttttctca gaggagtcat 2880

gacacctaga tttcaaaact caattcactt ctctattctt ctctaataat tagttgtaca 2940

tgtcaccatt aaaaataatt tcaatttcaa attgtagctg caagctatta aaggctttct 3000

gtctcttcct gctttgtttg tagtgatctt gcactttatt ctgttaggta gttggaatag 3060

gaaaaaggag tccagcatgg tggtggctaa aagacaagga agggaaaagc ccactaaaat 3120

agaacaaagg aaggtccaag gattggaatg aggacctcag gtagaacaaa cagcactcct 3180

ggctggccca atttacacag gacaagccca gggggaggag gaaagacata gaaagaggag 3240

ccaaagggcc caggctctct gtctcttgtc tttctctctc ttctttttgc atcttttggt 3300

ttggcatgcc ctcacacctt gaggatgtat tttcctttat tttctaaata agacagctgt 3360

aacactggtc tatctgagag ctgtgacgca ctgagggctt taacgtctgt cgcttcaaat 3420

ttttgttgtg atgagacaga accgaggaaa ttacacactc ccctgacaat tctaatgaag 3480

taaaattatc aaaattatat atcatgaaaa aaccctcata aagtttaaag acagcagtgc 3540

ttgtaactta ctatttaaaa ttttatttat ttttgttgtt gttaattaat ggaactggaa 3600

tagacataaa gactgtattc tttgtggtgt catcaataaa acattgatta cttgattttt 3660

caaataaatt tttgcttgaa ctttaatgaa ggcatctcac catgtttgaa tattcccagc 3720

ataggttcac aacacatgac tctgttttat tcacatctca acttagccaa gtataaactg 3780

tgtgactttg gttagtcatt aaacctccct gaacttcagc ttctttatgt gacatgatac 3840

ctagtcctta gggttgctgg atgcactctg ttctgatggt gtatgtgaaa tctctaattt 3900

aatgcctgga agagcctcaa aagtgttcat ttcctttccc tctgaagctg aaggaagatg 3960

ttttctagaa ttttttaaat tatgattttt aacttttaat ggaaaagaga aataaagaca 4020

gagcaacagt ttatacaaat tctcttccag aaatgtggca ataggtatta gaaacttctc 4080

ttgtgtcact tgaccactaa cttcacattt tcatgtggtc acttgattaa tttacacaat 4140

gaagtacgtc tccacagctg tctgtgtatc cctggctggt agaagcctgt aaactacaca 4200

tccattttca aagaaggaag ccagctcctg tgaccaggac cttgacctcc aaacaccaac 4260

tgggaaattc cccatggttg gaagagcata gtcctaacct tgtggaaagt agtcatctct 4320

ttaatttctc cccatacccg agtacatgtt tgtgagccac tgagggagag acagtgtgat 4380

ccctgggaat tataatacgt cccacagcac agcatcgttt tgttggggtg tattattagc 4440

ctccaaatta gagccgtggg gagctcccaa catggcttca gtgggatgaa tagagatgaa 4500

taaagcattc agcaaaagga cttctggtga gatctaacat aaagctgttt gctttgtgca 4560

tgtttaaaat atagcctact acagccctca aatatatgta aattcatcgc tgtcactctt 4620

tcctacccca tgtaagccag tttacataat gaatcagctc ttacagctgt tttgatgtag 4680

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tttctacaga tggatcacaa ggctcagtca ttttggcatt gggaactgaa tccgttgtag 4800

caaagtgaaa tcacagagag aatatctttc tatggtttcc ccaagaataa aaagaataat 4860

taaatattac agcccactgt tcacacatcc attcatcacc aaatattgat taagggcctg 4920

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atttgtctgt gatgaaagtg catcctatct gtaagttttt gtgtgaaaat aaatgccttt 5040

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atttaataaa ttaactaaac ctgttccact gacacattga tgagtcatat gagttgctct 5160

tatccattgt tacaagatta aacattttgg gaataaagct catccaattt attgagaaag 5220

aaacttggct acaaatgcag tcccacttaa ttagcttctg ttccaagttg cctagctgct 5280

tgaacataaa tggtgagtcc cattgccctc tgagtttcct gggggcatct tgctctgatc 5340

acttaattga ttttccaaac cagtttgtac tctggatata tctttgtgtc ctttttcagt 5400

cttgtcatta tcatcttgaa gcatattcaa caaaattctt tgtagaagcc ccgttagcta 5460

tggaagagtg actgattaaa ttaagcatat taagtaccaa caacaatcca aacagggtgt 5520

ggctgtgtaa tgagtcctgg ttagaaggga gagagggtgg gatggtagtg tgtttggtgt 5580

tactgtcaga gggacactca ctgtatccac gcaagatgaa tgagggatga attgtgggct 5640

gggatgacca atagctttga agctgtcaac ccacctcctt aatcctggaa ctaagtacag 5700

tccagaagcc ttttgactta gttaccaaac tactaaactt tctttatgag gatgaaggct 5760

tttcaagaga caattaacct ggaaattcac aggaggttct aaggcaagct ggtgtgagcc 5820

aaagaagcca ggaaggtcag ggtgggagcc ccacccacca gcaagaatgt ataaaagctc 5880

agaagcctga agtggcattc acagttcaag aaccagcctc agtgagttac ccacatctct 5940

ccaccagcac caag 5954

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(54)

<223>

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<210> 9

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<212> DNA

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<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 9

cgtaactcac atcacctgcg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 10

tgcttccgta tcgcatgtct 20

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(53)

<223>

<400> 11

ccgcgggccc gggatccacc ggtcgccacc atgtcctaca actgctgctc tgg53

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(60)

<223>

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ctcctccacg tcaccgcatg ttagaagact tcctctgccc tcgtagaagc cagatccaca 60

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(83)

<223>

<400> 13

gatctggctt ctacgagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 60

ccggccctat ggcccagtcc aag 83

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(36)

<223>

<400> 14

gattatgatc tagagtcgcg gccgctcagg gcaagg 36

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(34)

<223>

<400> 15

ccgctcgagc ccctggatag aaagatcaga ccaa 34

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(31)

<223>

<400> 16

tccccgcggc ttggtgctgg tggagagatg t31

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 17

ggttctaagg caagctggtg 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<223>

<400> 18

aggtacatgc tcacgtcgc19