一株链霉菌菌株以及利用该菌株制备棘霉素的方法

摘要

本发明公开了一株链霉菌菌株以及利用该菌株制备棘霉素的方法。本发明提供的链霉菌菌株为采集自山东省威海市的海泥样品中分离得到的N12W0310，该菌株保藏编号为CGMCC No.12922。利用该菌株制备棘霉素的方法为：制备链霉菌N12W0310的种子液与发酵液，发酵液经过离心或过滤得到菌丝体，菌丝体通过浸提、浓缩、洗涤、柱色谱制备得到棘霉素精品。在本发明提供的发酵条件下，棘霉素发酵单位大于1500 mg/L，远高于目前已报道的棘霉素发酵单位。本发明公开的棘霉素分离工艺简便，质量稳定可控，产物总收率可达到60 %以上，适于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一株链霉菌菌株以及利用该菌株制备棘霉素的方法。

背景技术

棘霉素（Echinomycin，Quinomycin A）是由多刺链霉菌（Streptomyces>echinatus）产生的一种喹喔啉类化合物，是一个DNA双插入剂，能够与肿瘤细胞的DNA发生相互作用，从而抑制其复制和转录，自1998年以来一直作为抗肿瘤药物在进行Ⅱ期临床试验（陈念,>

除了上述在抗肿瘤、抗菌方面的研究和应用，近年来，棘霉素发色团的荧光性质也逐渐引起人们的关注，利用其喹喔啉环发色团在插入双链DNA后能引起电信号发生变化的性质，可用来研制电化学DNA传感器，用于鉴别单链和双链DNA。另外，棘霉素还有望作为一种高灵敏度和专一性的DNA荧光探针，用于与核酸分子成像有关的研究。

与上述研究进展相比，棘霉素的生产相对落后，国内报道的发酵单位仅为61.82mg/L（张立新, 宋福行, 陈彩霞, 等. 中国专利, ZL201210245954.X），国外报道发酵单位最高为418 mg/L（Steinerová N, Lipavská H, Stajner K, et al. Folia Microbiol,1987, 32: 1-5），且棘霉素发酵过程还有一些副产物如醌霉素B，C，D，E等含量较高（Tadashi Yoshida, Ken katagiri. J Bacteriol, 1967, 93(4): 1327-1331），影响棘霉素的产量及收率。因此，寻找发酵单位高、副产物少、提取收率高的棘霉素高效菌株及其制备方法已成为亟待解决的重要课题之一。

发明内容

本发明的目的就是提供一种棘霉素发酵单位高、副产物少的高效菌株，同时提供一种利用该菌株制备棘霉素的方法。

本发明所提供的棘霉素高效菌株为链霉菌菌株，其保藏名称为链霉菌（Streptomyces>

本发明所提供的链霉菌（Streptomyces>

本发明所提供的棘霉素菌株分离自山东省威海市海泥样品，样品采集后保存于4℃，并尽快分离。分离方法采用本课题组发表的微波分离海泥方法（丁彦博, 蔡超靖, 穆云龙, 等. 微生物学通报, 2012, 39(3): 407-414）。菌株纯化后培养于ISP2斜面培养基。

菌株N12W0310在ISP2斜面培养基上28 ℃培养14 d左右，用20 %甘油保存菌体于-80 ℃。

所述菌株N12W0310的16S rDNA序列（1401 bp），经分析属于链霉菌属（Streptomyces>

采用本发明所述应用方法，其棘霉素的发酵单位可达到1500 mg/L以上，故其可在制备棘霉素中得到应用。

本发明所提供的链霉菌菌株在制备棘霉素中的应用方法，包括以下步骤：

a、制备链霉菌N12W0310的种子液

将菌株N12W0310的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，27-32℃、转速180-220rpm培养48-72 h获得种子液；

其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-40.0克、葡萄糖0.5-5.0克，蛋白胨1.0-10.0克、牛肉膏1.0-10.0克、酵母浸粉1.0-10.0克，加水定容至1000 mL；pH值7.0-7.2，121 ℃灭菌30 min。

b、制备链霉菌N12W0310的发酵液

将上述种子液以体积百分比2-15 %的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵温度26-30 ℃、发酵时间96-192 h，得到发酵液；

其中所述的发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖30.0-60.0克、脱脂大豆粉10.0-30.0克、NaCl 1.0-5.0克、FeSO₄·7H₂O>3>3>

c、将上述发酵液进行过滤或离心，得到菌丝体，上清液舍弃。

d、用有机溶剂对菌丝体浸提，浸提2-4次，每次2-4 h，合并得浸提液，浸提液减压浓缩，除去溶剂，得到粗提物。

e、用非极性有机溶剂洗涤上述粗提物，洗涤1-3次，洗涤液弃去，剩余部分减压浓缩得到棘霉素粗品。

其中步骤e获得棘霉素粗品中压色谱分离；色谱条件：流动相：乙腈:乙酸铵水溶液体积比为45:55-55:45；色谱介质C18，30-80 μm，100 Å；接收目的色谱峰的流出液，合并，减压浓缩除去乙腈，棘霉素析出，过滤除去水相，干燥，得棘霉素精品。

其中流动相中所述乙酸铵水溶液为每百毫升水含乙酸铵50-200 mg。

其中步骤b中所述的摇瓶发酵，其转速为180-220 rpm。

其中步骤b中所述的发酵罐发酵，其罐压为0.05±0.01 Mpa、通气量为10-30 L/min，搅拌速度为400-500 rpm。

其中步骤d、e所述的减压浓缩在30-50 ℃进行。

其中步骤d所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种。

其中步骤e所述的非极性有机溶剂为石油醚、正己烷中的一种。

其中获得的棘霉素粗品溶于氯仿、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的任意一种溶剂后，进行中压色谱分离。

上述优选条件，其所获得的棘霉素产量更高。

采用本发明所提供的链霉菌N12W0310制备棘霉素，其发酵单位高，且发酵组分较为单一，易于分离纯化，适于工业化生产。

利用该菌株制备棘霉素的方法，其棘霉素产物总收率可达到60 %以上。

附图说明

图1 为菌株在ISP2培养基上培养14 d的菌落解剖显微镜形态；

图2 为菌株在ISP3培养基上培养14 d的菌落解剖显微镜形态；

图3 为菌株在ISP4培养基上培养14 d的菌落解剖显微镜形态；

图4 为菌株在ISP5培养基上培养14 d的菌落解剖显微镜形态；

图5 为菌株在ISP6培养基上培养14 d的菌落解剖显微镜形态；

图6 为菌株在ISP7培养基上培养14 d的菌落解剖显微镜形态；

图7 为菌株在ISP2培养基上培养14 d的光学显微镜形态；

图8 为菌株在ISP2培养基上培养14 d的扫描电子显微镜形态；

图9 为粗提物的HPLC分析色谱图；

图10 为棘霉素精品的紫外光谱图；

图11 为棘霉素精品的ESI-MS图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市购产品。

实施例1、菌株的分离及鉴定

（a）菌株分离

海泥样品采集自山东省威海市，样品采集后保存于4 ℃，并尽快分离。

分离方法采用本课题组发表的微波分离海泥方法（丁彦博, 蔡超靖, 穆云龙,等. 微生物学通报, 2012, 39(3): 407-414）。即海泥样品1 g于无菌试管中，加入10 mL无菌水，涡旋振荡1 min使得样品充分混匀，获得悬浊液放入盛有冰水混合物的烧杯中，120W、2450 MHz微波处理3 min, 微波过程中, 每1 min停止一次, 更换冰水混合物, 避免因温度升高而产生的热效应。将处理好的海泥样品悬液用10倍梯度稀释法稀释至10⁻²，充分混匀后分别吸取0.1>

（b） 菌株鉴定

形态观察：

菌株在ISP2-ISP7等不同培养基平板上28 ℃培养14 d，菌落呈现灰色，在OlympusSZX7解剖显微镜下观察形态照片（图1-6）。基丝生长良好、不断裂，气丝形成孢子链，孢子链顶端有螺旋。在ISP2培养基上培养14 d的形态，在光学显微镜（100×）下观察形态照片（图7），用扫描电子显微镜（5000×）观察形态照片，孢子近圆形、表面多刺（图8）。

培养特征：

将菌株N12W0310接种在ISP2-ISP7等不同培养基平板上，于28 ℃培养，分别于7 d、14d、21 d观察其生长情况。菌株在不同培养基上的培养状态如表1所示。

表1、菌株N12W0310在不同培养基上的生长状态（14 d）

注：+++表示生长很好，++表示生长良好，+表示生长一般。

生理生化特征：

参考《放线菌系统学》（徐丽华, 李文均, 刘志恒, 等. 放线菌系统学——原理、方法及实践[M]. 北京:科学出版社, 2007）进行生理生化特征实验。

菌株N12W0310对葡萄糖、蔗糖利用最好，木糖、果糖、阿拉伯糖次之，对甘露糖、肌醇利用较差，不利于蔗糖、鼠李糖、棉籽糖、纤维素。氧化酶实验阳性，过氧化氢酶实验阴性，VP实验阳性，尿酶实验阳性，明胶液化，牛奶凝固阴性，淀粉水解阳性，硝酸盐还原阳性，产生H₂S，耐受2>

细胞壁化学组成：

采用微晶纤维素薄层层析法进行全细胞氨基酸及全细胞水解液糖型分析。菌株N12W0310细胞壁类型型，糖型C（含LL-DAP，无特征性糖）。

16S rDNA序列含有1401 bp，测定结果见说明书序列表。

根据菌株的形态特征、培养状态、生理生化特征、细胞壁化学组成及其16S rDNA序列分析，将菌株N12W0310鉴定为链霉菌属（Streptomyces>

实施例2、50 L罐发酵棘霉素的制备

（a）制备链霉菌N12W0310种子液

将链霉菌N12W0310接种于种子培养基，32 ℃、转速220 rpm培养48 h获得种子液。

种子培养基的制备方法为：玉米淀粉40.0克、葡萄糖0.5克，蛋白胨5.0克、牛肉膏8.0克、酵母浸粉5.0克，加自来水溶解、定容至1000 mL，pH值7.0，121 ℃灭菌30 min。

（b）制备链霉菌N12W0310发酵液

将种子液以体积百分比2 %的接种量接种装有发酵培养基的50 L发酵罐，罐温26 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气量30 L/min，500 rpm搅拌，发酵96 h。发酵培养基的制备方法为：葡萄糖60.0克、脱脂大豆粉20.0克、NaCl 3.0克、FeSO₄·7H₂O>3>3>

（c）取上述发酵液36 L，3000 rpm离心15 min，获得菌丝体约8 L，上清液舍弃。

（d）菌丝体中加入16 L工业乙醇，浸提2 h，浸提3次，合并浸提液，50 ℃减压蒸干。

（e）500 mL石油醚洗涤菌体粗提物3次，剩余部分减压蒸干得到棘霉素粗品82.0克。

实施例3、精制棘霉素

将实施例2所制备的棘霉素粗品82.0克溶于600 mL乙酸乙酯中，采用中压色谱（汉邦NP7000 & NU3000色谱系统）分离。色谱条件：流动相：55 %乙腈水（含0.05 %乙酸铵）；色谱柱：苏州汇通，100×460 mm，C18，50 μm，300 Å；流速：300 mL/min；检测器：UV254 nm；接收目的色谱峰（RT≈14-18 min）的流出液合并，减压浓缩除去乙腈，棘霉素析出，过滤除去水相，蒸干固体物中水分后得产物棘霉素精品33.8克，含量99.2 %，总收率62.0 %。

对产物进行鉴定，其结果如下：

（a）外观：白色疏松粉末或玻璃状固体。

（b）溶解性：溶于氯仿、乙腈、乙酸乙酯，甲醇、乙醇溶解度差，难溶于水和正己烷。

（c）紫外光谱

产物紫外光谱（Waters PDA996）如图10所示。在202.3 nm、243.4 nm、323.9 nm（MeOH）处有最大吸收峰，与文献（Aaron M. Socha, Kerry L. LaPlante, David J. Russell, etal. Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19: 1504–1507）报道的棘霉素的紫外光谱特征一致。

（d）质谱

产物ESI-MS（Waters Xevo TQMS）图谱如图11所示。其分子离子峰[M+H]⁺为1101.19，[M-H]^-为1099.02，与文献（同上）报道的棘霉素的结果一致。

（e）核磁共振信号归属以及与文献的比较

核磁共振测试仪器为Varian Inova 500 MHz，所制备的产物¹³C信号归属及与文献（Aaron>

表2、所制备的产物¹³C信号归属以及与文献的比较

综上所制备的产物可确认为棘霉素，分子式：C₅₁H₆₄N₁₂O₁₂S₂，结构式如式1所示。

（f）所制备的产物的其他几个理化参数

熔点：222-224 ℃，旋光[α]₂₅^D>

实施例4、摇瓶发酵棘霉素的制备

（a）制备链霉菌N12W0310种子液

将链霉菌N12W0310的孢子保藏液接种于种子培养基，27 ℃、转速200 rpm培养72 h获得种子液。

种子培养基的制备方法为：玉米淀粉20.0克、葡萄糖5.0克，蛋白胨1.0克、牛肉膏10.0克、酵母浸粉1.0克，加自来水溶解，定容至1000 mL，pH值7.2，121 ℃灭菌30 min。

（b）制备链霉菌N12W0310发酵液

将种子液以体积比为15 %的接种量接种装有发酵培养基的摇瓶，30 ℃、转速220 rpm，发酵192 h，得到链霉菌N12W0310发酵液。

发酵培养基的制备方法为：葡萄糖30.0克、脱脂大豆粉10.0克、NaCl 5.0克、FeSO₄·7H₂O>3>3>

（c）将链霉菌N12W0310的5 L发酵液，抽滤，得到菌丝体约1.2 L。

（d）菌丝体用2.5 L丙酮浸提4 h，浸提2次，合并浸提液，减压蒸干。

（e）菌丝粗提物用50 mL正己烷洗涤2次，剩余部分减压蒸干得到棘霉素粗品13.2克。

取样进行HPLC分析，色谱条件：色谱柱，苏州纳微UniSil 10-120 C18 4.6×150mm；流动相，体积比50 %的乙腈水溶液（含0.1 %三乙胺）；流速1 mL/min；进样量10 μL；UV254 nm检测。棘霉素发酵粗提物HPLC分析图谱见图9，棘霉素的保留时间为5.08 min。

（f）将棘霉素粗品溶于50 mL甲醇中，中压柱制备。色谱系统：汉邦NP7000 &NU3000；色谱条件：流动相：50 %乙腈水（含0.1 %乙酸铵）；色谱柱：26×310 mm，C18，30 μm，100 Å；流速：25 mL/min；检测器：UV254 nm；接收目的色谱峰（RT≈13-17 min）的流出液合并，减压浓缩除去乙腈，白色固体物析出，过滤除去水相，蒸干固体物中水分后得产物棘霉素精品4.9克，含量99.4 %，总收率61.0 %。

实施例5、摇瓶发酵棘霉素的制备

（a）制备链霉菌N12W0310种子液

将链霉菌N12W0310的斜面培养物接种于种子培养基，30 ℃、转速180 rpm培养60 h获得种子液。

种子培养基的制备方法为：玉米淀粉35.0克、葡萄糖3.0克，蛋白胨10.0克、牛肉膏1.0克、酵母浸粉10.0克，加自来水溶解，定容至1000 mL，pH值7.1，121 ℃灭菌30 min。

（b）制备链霉菌N12W0310发酵液

将种子液以体积比为7 %的接种量接种装有发酵培养基的摇瓶，28 ℃、转速220 rpm，发酵144 h，得到链霉菌N12W0310发酵液。

发酵培养基的制备方法为：葡萄糖45.0克、脱脂大豆粉32.0克、NaCl 1.0克、FeSO₄·7H₂O>3>3>

（c）将链霉菌N12W0310的2 L发酵液，抽滤，得到菌丝体约0.5 L。

（d）菌丝体用1 L乙醇浸提3 h，浸提2次，合并浸提液，减压蒸干。

（e）菌丝粗提物用20 mL正己烷洗涤1次，剩余部分减压蒸干得到棘霉素粗品5.1克。

（f）将棘霉素粗品溶于20 mL乙醇中，中压柱制备。色谱系统：汉邦NP7000 &NU3000；色谱条件：流动相：50 %乙腈水（含0.2 %乙酸铵）；色谱柱：26×310 mm，C18，30 μm，100 Å；流速：25 mL/min；检测器：UV254 nm；接收目的色谱峰的流出液合并，减压浓缩除去乙腈，白色固体物析出，过滤除去水相，蒸干固体物中水分后得产物棘霉素精品2.1克，含量99.1 %，总收率61.2 %。

SEQUENCE LISTING

<110> 华北制药集团新药研究开发有限责任公司

<120> 一株链霉菌菌株以及利用该菌株制备棘霉素的方法

<130> 无

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> Streptomyces sp.

<400> 1

cgatgaagcc cttcggggtg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc 60

cctgcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatatgag ccggaaccgc 120

atggttctgg ttgtaaagct ccggcggtgc aggatgagcc cgcggcctat cagcttgttg 180

gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac 240

actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa 300

tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc 360

tctttcagca gggaagaagc gaaagtgacg gtacctgcag aagaagcgcc ggctaactac 420

gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 480

gagctcgtag gcggcttgtc acgtcgattg tgaaagcccg aggcttaacc tcgggtctgc 540

agtcgatacg ggctagctag agtgtggtag gggagatcgg aattcctggt gtagcggtga 600

aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg atctctgggc cattactgac 660

gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 720

aacggtggga actaggtgtt ggcgacattc cacgtcgtcg gtgccgcagc taacgcatta 780

agttccccgc ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc 840

gcacaagcgg cggagcatgt ggcttaattc gacgcaacgc gaagaacctt accaaggctt 900

gacatacacc ggaaagcatt agagatagtg ccccccttgt ggtcggtgta caggtggtgc 960

atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1020

ttgttctgtg ttgccagcat gcccttcggg gtgatgggga ctcacaggag accgccgggg 1080

tcaactcgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg ccccttatgt cttgggctgc 1140

acacgtgcta caatggccgg tacaatgagc tgcgataccg tgaggtggag cgaatctcaa 1200

aaagccggtc tcagttcgga ttggggtctg caactcgacc ccatgaagtc ggagtcgcta 1260

gtaatcgcag atcagcattg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1320

tcacgtcacg aaagtcggta acacccgaag ccggtggccc aaccccttgt gggagggagc 1380

tgtcgaaggt gggactggcg a 1401

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