一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法

摘要

本发明公开了一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，先制备梯度聚丙烯酰胺凝胶两块，按常规方法配制浓缩胶，不加梳子，制得两块相同的凝胶板块；然后将2块分别插进完全相同的两个电泳槽中，在向每个电泳槽加预处理好的尖吻蝮蛇毒，其中一块电泳板正常电泳，另一块电泳板正、负极对调，二块板同时电泳，正常电泳板中溴酚蓝到达凝胶底部后，电泳同时结束，取下两块凝胶先染色在用蒸馏水脱色，直到清晰地出现蛋白质蓝色条带为止，将每个蛋白质条带切割下来，加人生理盐水于研钵中磨细，再注射到小鼠腹部皮下，1h后解剖，观察有几条出血明显的条带，即表示尖吻蝮蛇含多少种出血毒素。本发明方法检测过程方便、结果稳定，检测时间短。

说明书

技术领域

一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，属于生物化学领域。

背景技术

尖吻蝮蛇(Agkistrodon>)俗称五步蛇,属于蝮亚科、蝮属，分布于我国长江以南地区（包括台湾），是我国特有剧毒蛇。该蛇毒为血循环型毒蛇, 其主要毒素为出血毒素，前人从不同产地的尖吻蝮蛇毒中分离出不同种类的出血毒素，有人从皖南产尖吻蝮蛇毒中分离出至少4种低分子量出血毒素，分别命名为出血毒素Ⅰ（AaH Ⅰ）、出血毒素Ⅱ（AaH Ⅱ）、出血毒素Ⅲ（AaH Ⅲ）和出血毒素Ⅳ（AaH Ⅳ）；有人从湖南尖吻蝮蛇毒中分离出3种出血毒素，分别命名为DaHT-1、DaHT-2和DaHT-3。有人从福建产尖吻蝮蛇毒中分离出1种出血毒素，命名为AA-MP-I。有人分别从台湾产尖吻蝮蛇毒中纯化出5种出血毒素，分别命名为AC-1、AC-2 、AC-3、AC-4和AC-5。产地不同、甚至不同环境、不同生长阶段的尖吻蝮蛇产生的出血毒素种数都不同，确定出血毒素的种数是研究出血毒素的一项基础工作。

发明内容

本发明提供了一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简单方法。

本发明方法利用现有的染色试剂盒并进行改良，找出一种鉴定尖吻蝮蛇出血毒素种数的简单方法。本发明使用的试剂盒为生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（Protein Stains H，产品编号：C510041）”，该试剂盒由染色液A、染色液B和脱色液组成，染色液A含考马斯亮蓝R-250，染色液B含离子对，可使考马斯亮蓝R-250与蛋白质的结合较快，而与胶的结合程度较低，染色液A、染色液B混合后组成染色液，染色液能够快速与蛋白质结合，与凝胶结合疏松，染色后保留蛇毒蛋白的原有活性，因试剂盒中的脱色液含乙酸和甲醇，乙酸和甲醇是蛋白质的变性剂，本发明不用。本发明用染色液A和染色液B组成的混合液染色，用蒸馏水脱色，确保蛇毒蛋白保存原有的活性。

具体方案如下：

一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、制备梯度聚丙烯酰胺分离胶二块，凝固后的胶从上到下浓度逐渐增大，凝胶的孔径逐渐减小，按常规方法配制浓缩胶，上端留1cm的空间作为加样品的空间，不加梳子；

b、将制好的电泳板，每个电泳槽加浓度40-60mg/mL 尖吻蝮蛇毒1.0 mL，一块电泳板正常电泳（酸性蛋白质进入凝胶），另一块电泳板正、负极对调（碱性蛋白质进入凝胶），二块板同时电泳，正常电泳板中溴酚蓝到达凝胶底部后，电泳同时结束，取下凝胶，放塑料盒中待染色；

c、用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（产品编号：C510041）”染色，染色时间从30分钟缩短为6分钟，用蒸馏水脱色代替试剂盒中的脱色液，直到清晰地出现蛋白质蓝色条带为止；

d、对每个蛋白质条带，用手术刀切下约2.5 cm蛋白条带，加0.2 mL生理盐水于研钵中磨细，将凝胶悬浮液注射到小鼠腹部皮下，1h后解剖观察是否出血，出血明显的条带既为一种出血毒素，总共有多少出血明显出血条带表示尖吻蝮蛇毒含多少种出血毒素。

本发明技术效果体现在几个方面：

1、利用试剂盒，不需要配试剂，检测过程方便、结果稳定。

本发明用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（Protein Stains H，产品编号：C510041）”，只是在染色时间和脱色方面做些修改，因此不需要配试剂，检测过程方便、结果稳定。

2、检测时间短，整个过程仅仅需要2天就可以完成检测工作；

3、可以推广到其他含出血毒素的动物毒素的检测上。

具体实施方式

实施例一：

一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，包括以下步骤：

第一步：5-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）的制备

将5%胶和20%胶按比例配制（表1）后分别倒入剃度仪的 A管和B管，打开磁力搅拌器，开通A管和B管之间的连接通道，开启恒流泵，以恒定流速将逐步混合的胶从B管泵入凝胶槽内，完毕后加异丙醇封闭，凝固后的胶从上至下浓度逐渐增大（5-20%），孔径逐渐减小，按常规方法配制浓缩胶，不需要不加梳子，上面留1cm 空间加蛇毒样品，凝固后制得凝胶板，同样的方法制2块凝胶板，

表1 5-20%SDS-PAGE梯度胶

第二步：制备电泳分离尖吻蝮蛇毒

取尖吻蝮蛇原毒，配制成50mg/mL浓度，13000转/分钟离心6分钟去除不溶物，由于蛇毒蛋白质种类较多，既含酸性蛋白，也含碱性蛋白，电泳液的pH为8.3，在此pH条件下，等电点小于8.3的蛋白质正常的往正极移动，而等电点大于8.3的蛋白质不能进入凝胶，而向负极的电泳缓冲液移动，对于这部分碱性蛋白采用调换正、负极的方法使其进入凝胶中，因此本发明用二块凝胶板同时电泳，每个电泳槽加1.0 mL蛇毒溶液。正常电泳板（电泳酸性蛋白质）溴酚蓝到达凝胶底部后，电泳同时结束，取下凝胶，放塑料盒中待染色；

第三步：染色与脱色

本发明用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（Protein Stains H，产品编号：C510041）”，试剂盒包含染色液A、染色液B和脱色液。

染色液A主要含考马斯亮蓝R-250，染色液B含离子对，使得考马斯亮蓝R-250与蛋白质的结合较快，而与胶的结合程度较低，使用中取一倍浓度染色液A 20mL加1.2mL染色液B混合，取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶，每次加入200 mL蒸馏水，置于摇床上，震荡清洗5 min，重复3次，加入60mL染色混合液，置于摇床上，震荡染色6 min，倒掉染色液后用200mL蒸馏水洗脱，30分钟换一次蒸馏水，直到出现清晰的蛋白质条带为止；

第四步：出血毒素的鉴定

对每个蛋白质条带，用手术刀切下2.5 cm蛋白条带，加0.2 mL生理盐水于研钵中磨细，用1mL规格的注射器吸取磨细后的胶体悬浮液，取18-22g小鼠，将胶体悬浮液全部注射到小鼠腹部皮下，1h后断头处死小鼠，解剖后观察是否出现出血点，出血明显的条带既为出血毒素。

结果表明，“实施例一”尖吻蝮蛇的酸性蛋白部分总共有12条带，经过检测有4个出血带，既含4种出血毒素；碱性蛋白部分总共有4条带，有1个出血带，既含1种出血毒素；尖吻蝮蛇全毒合计含5种出血毒素。

实施例二：

第一步：与“实施例一”：第一步相同。

第二步：制备电泳分离尖吻蝮蛇毒

取尖吻蝮蛇原毒，配制成60mg/mL浓度，其他操作与“实施例一”：第二步相同。

第三步：染色与脱色

与“实施例一”：第三步相同。

第四步：出血毒素的鉴定

与“实施例一”：第四步相同。

结果表明，“实施例二”与“实施例一”几乎一样，酸性蛋白部分总共有12条带，经过检测有4个出血带，既含4种出血毒素，4个出血带的位置与“实施例一”也一样；碱性蛋白部分总共有4条带，有1个出血带，既含1种出血毒素；尖吻蝮蛇全毒合计含5种出血毒素。

实施例三：

第一步：与“实施例一”：第一步相同。

第二步：制备电泳分离尖吻蝮蛇毒

取尖吻蝮蛇原毒，配制成40mg/mL浓度，其他操作与“实施例一”：第二步相同。

第三步：染色与脱色

与“实施例一”：第三步相同。

第四步：出血毒素的鉴定

与“实施例一”：第四步相同。

结果表明，“实施例三”与“实施例一”和“实施例二”几乎一样，酸性蛋白部分总共有12条带，经过检测有4个出血带，既含4种出血毒素；碱性蛋白部分总共有4条带，有1个出血带，既含1种出血毒素；尖吻蝮蛇全毒合计含5种出血毒素。

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