一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB1电化学检测方法及应用

摘要

本发明属于农产品质量安全检测技术领域，涉及农产品中AFB1的检测，具体涉及一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB1电化学检测方法及应用。生物素标记的AFB1核酸适配体与Block探针形成的杂交复合物预先固定在磁珠表面，在靶标存才情况下，AFB1与Block探针与适配体竞争结合，被置换下来的Block探针能够触发链置换扩增反应从而产生大量的扩增子。该扩增子能够协同参与丝网印刷电极表面的表面临近杂交反应，从而引入电活性探针产生相应的电信号。通过特异性实验及与传统ELISA方法的对比，结果证明本发明特异性好、灵敏度高、准确可靠，有望为玉米农产品中AFB1的大规模筛查提供一种技术选择。

说明书

技术领域

本发明属于农产品质量安全检测技术领域，涉及农产品中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的检测，具体涉及一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法及应用。

背景技术

黄曲霉毒素( aflatoxin，AF) 作为许多霉菌的二级代谢物，在田间和存储过程中能够污染大多数农产品，比如谷物、花生、玉米、油籽等多种粮食和饲料，已经成为影响食品安全、危害人类和动物健康的巨型杀手。目前已经发现的黄曲霉毒素具有诱导突变、抑制免疫和致癌作用，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物质，目前已经发现的有AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁和AFM₂等18种，其中以AFB₁最为多见，危害性也最强。据报道，AFB₁的毒性分别是呕吐毒素的30倍，玉米赤霉烯酮的20倍，氰化钾的10倍，砒霜的68倍。因此，很多国家制订了严格的AF限量标准，其中尤以欧盟的最为苛刻，规定花生中AFB₁含量不得超过2>1含量不得高于0.1>1（AFB₁）的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、酶联免疫法(ELISA)>1的含量极其微量，所以开发操作简单、灵敏度高、准确性好、检测通量高的检测方法对于减少AF对人类生命安全的危害、保证国际进出口贸易的畅通具有极其重要的作用。

核酸适配体作为单链寡核苷酸（20～60碱基），被称为“化学抗体”，具有诸多优点：特异性高，兼容性好，稳定性好且易合成，易标记。电化学生物传感检测方法具有快速、灵敏、仪器设备简单等特殊优势。

发明内容

本发明为解决目前AFB₁检测方法的灵敏度低，操作难度大，检测成本高的技术难题，公开了一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法及应用。

为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：

一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法，所述检测方法将AFB₁核酸酸适配体作为分子识别元件，丝网印刷电极作为换能器，采用恒温链置换扩增方法进行信号放大后，再通过表面临近杂交反应进行信号输出。

所述AFB₁核酸酸适配体的序列如SEQ>

基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法，包括以下步骤：

（1）磁珠的表面修饰：将生物素标记的AFB₁核酸适配体和Block探针储备液，分别经95℃>1>1>1>

（2）丝网印刷电极的预处理及传感界面的制备：在经无水乙醇和去离子水洗涤干净的丝网印刷电极的电极表面上，滴加40 µL 0.1 M H₂SO₄溶液，在2V直流电压下活化60s，在活化后的丝网印刷电极上，滴加4>1>11×BB缓冲液清洗3次后，将丝网印刷电极吹干于4℃备用；

（3）AFB₁结合介导的链置换和表面临近杂交反应：在AFB₁靶标溶液中加入50µL步骤（1）中修饰好的磁珠，于室温下轻轻震荡孵育30>1缓冲液洗涤干净并用氮气吹干；

（4）电化学检测：向经步骤（3）处理过的丝网印刷电极表面滴加40 µL 含有10 mM MgCl₂的0.1>4溶液，然后进行差示脉冲电化学检测。

所述步骤（1）中Block 探针的序列如SEQ ID NO：2所示，Block 探针储液的浓度为10 µM；所述AFB₁>2,>

所述步骤（2）中巯基修饰探针的序列如SEQ ID NO：3所示，巯基修饰探针的缓冲溶液的配方为：1μM巯基修饰探针、1M NaCl和1mM TCEP。

所述步骤（3）中链置换探针的序列如SEQ ID NO：4所示，二茂铁标记探针如SEQ ID NO：5所示。

所述步骤（4）中的电化学检测在电化学工作站上进行，具体参数为窗口扫描宽度为0-0.5 V，脉冲宽度为50 mV，静默时间0.2 s，脉冲宽度为0.06 s。

基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法，作为检测作物中AFB₁的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明采用AFB₁核酸适配体作为分子识别元件，特异性进一步提高；同时，因核酸的合成成本非常低，且已经商业化，大大降低了AFB₁的检测成本。

（2）本发明利用“化学抗体”核酸适配体的高特异性特点，结合链置换扩增信号放大策略，同时采用表面临近杂交的信号输出方式，构建了一种测定黄曲霉毒素B₁的电化学核酸适配体传感器，具有简单快捷、高灵敏、高特异性的优点。

（3）本发明采用丝网印刷电极作换能器，具有操作简单、易于批量分析的优点。

附图说明

图1为活化后的丝网印刷电极特征峰值图。

图2为检测原理示意图。

图3为检测方法特异性分析图。

图4为标准工作曲线及线性范围图。

具体实施方式

一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法，所述检测方法将AFB₁核酸酸适配体作为分子识别元件，丝网印刷电极作为换能器，采用恒温链置换扩增方法进行信号放大后，再通过表面临近杂交反应进行信号输出。

所述AFB₁核酸酸适配体的序列如SEQ>

基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法，包括以下步骤：

（1）磁珠的表面修饰：将生物素标记的AFB₁核酸适配体和Block探针储备液，分别经95℃>1>1>1>

（2）丝网印刷电极的预处理及传感界面的制备：在经无水乙醇和去离子水洗涤干净的丝网印刷电极的电极表面上，滴加40 µL 0.1 M H₂SO₄溶液，在2V直流电压下活化60s，在活化后的丝网印刷电极上，滴加4>1>11×BB缓冲液清洗3次后，将丝网印刷电极吹干于4℃备用；

（3）AFB₁结合介导的链置换和表面临近杂交反应：在AFB₁靶标溶液中加入50µL步骤（1）中修饰好的磁珠，于室温下轻轻震荡孵育30>1缓冲液洗涤干净并用氮气吹干；

（4）电化学检测：向经步骤（3）处理过的丝网印刷电极表面滴加40 µL 含有10 mM MgCl₂的0.1>4溶液，然后进行差示脉冲电化学检测。

所述步骤（1）中Block 探针的序列如SEQ ID NO：2所示，Block 探针储液的浓度为10 µM；所述AFB₁>2,>

所述步骤（2）中巯基修饰探针的序列如SEQ ID NO：3所示，巯基修饰探针的缓冲溶液的配方为：1μM巯基修饰探针、1M NaCl和1mM TCEP。

所述步骤（3）中链置换探针的序列如SEQ ID NO：4所示，二茂铁标记探针如SEQ ID NO：5所示。

所述步骤（4）中的电化学检测在电化学工作站上进行，具体参数为窗口扫描宽度为0-0.5 V，脉冲宽度为50 mV，静默时间0.2 s，脉冲宽度为0.06 s。

基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB₁电化学检测方法，作为检测作物中AFB₁的应用。

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1．一种基于链置换放大和表面临近杂交策略的黄曲霉毒素B₁（AFB₁）电化学检测方法，包括以下步骤：

（1）磁珠的表面修饰

生物素标记的AFB₁核酸适配体如SEQ>1>2,>1>1>

（2）丝网印刷电极的预处理及传感界面的制备

新的丝网印刷电极先用无水乙醇和去离子水洗涤干净，滴加40 µL 0.1 M H₂SO₄于电极表面，并施加+2>2SO₄，进行循环伏安扫描，窗口扫描宽度为0~1.5>11×BB>

（3）AFB₁结合介导的链置换和表面临近杂交反应及电化学检测

基于链置换放大和表面临近杂交策略的黄曲霉毒素B1电化学检测方法的原理如图2所示。3’端生物素标记的AFB₁适配体与Block探针形成的杂交复合物预先固定在磁珠表面，AFB₁存在的情况下，Block探针与AFB₁竞争与适配体结合。因AFB₁与适配体的结合力大于Block探针与适配体的结合力，Block探针被竞争下来。离心后，收集上清中的Block探针加入链置换扩增体系，触发启动链置换扩增反应从而产生大量的扩增子。

该扩增子能够协同参与随后的表面临近杂交反应：巯基修饰探针，二茂铁标记探针和扩增子三者的协同反应，从而在丝网印刷电极表面引入电活性探针，产生相应的电信号。如果AFB₁不存在，就不会发生AFB₁结合介导的链置换反应和表面临近杂交反应，自然不会产生电流信号。因此，该方法是一种signal-on检测模式。链置换扩增技术的引入，保证了该方法具有足够的灵敏度；表面临近杂交的信号输出策略将该检测原理转变成signal-on模式，从而进一步提高了方法的灵敏度；丝网印刷电极的使用，确保该方法可以大规模平行测试，保证了足够的检测通量。

具体实施步骤为：一定浓度的AFB₁靶标加入50>2,>-聚合酶>1缓冲液洗涤干净并用氮气吹干。

（4）电化学检测

紧接着滴加40 µL 含有10 mM MgCl₂的0.1>4溶液到上述（3）修饰好的电极表面，进行差示脉冲（DPV）电化学检测。窗口扫描宽度为0~0.5>

为了验证方法的特异性，专门针对污染玉米中常见的共生毒素如FB₁,>2,>1,>2,>1结构极其相似的AFB₂毒素，也仅仅产生大约20%的干扰信号。

（5）建立标准曲线

往修饰好的电极表面滴加40 µL 含有10 mM MgCl₂的0.1>4溶液，进行DPV电化学检测，记录峰电流值。其他浓度的AFB₁标准液（0.1>1浓度作横坐标作图，建立测定AFB₁的标准曲线。

在优化条件下，对AFB₁进行了定量测定，结果如图4所示，该方法的检测范围为0.1>AFB1)>

（6）玉米样品分析

称取5 g已粉碎的玉米样品，加入15 mL 乙腈：水（4:6，v/v）提取液，室温振荡提取20 min，4℃离心（4000 g）10 min，上清用孔径为0.22 mm的定性滤纸过滤后用1×BB溶液稀释4倍。然后按照上述（3）、（4）操作，进行DPV电化学检测，记录峰电流值。利用上述（5）所建立的黄曲霉毒素B₁标准曲线，计算出玉米样品溶液中的AFB₁浓度，并与商业化的ELISA试剂盒进行对比，用于实际玉米样品的筛查分析。

<110> 河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120>一种基于链置换放大和表面临近杂交反应的AFB1电化学检测方法及应用

<160> 5

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（47）

<400> 1

gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggccc47

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（21）

<400> 2

acacgtgccc aacaatctgg t21

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（14）

<400> 3

gcagcaaaga gtcg 14

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（50）

<400> 4

gcagcaacaa tctggacagt ttttgactca ccagattgtt gggcacgtgt 50

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（17）

<400> 5

cgactctcaa tctggac 17