一种将TIGA1作为靶点来增强谷氨酰胺酶抑制剂抗宫颈癌活性的方法

摘要

本发明公开了一种将TIGA1作为靶点来增强谷氨酰胺酶抑制剂抗宫颈癌活性的方法。本发明提供了抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达的物质在制备治疗肿瘤的产品中的应用；或，抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达的物质在制备抑制肿瘤细胞生长的产品中的应用。本发明的实验证明，本发明以TIGA1基因为有效靶点，结合RNA干扰技术和谷氨酰胺酶抑制剂，显著降低了癌细胞的抗药性并提高了谷氨酰胺酶抑制剂的抗癌活性，可用于治疗宫颈癌。将此靶点与谷氨酰胺酶抑制剂等化疗药物结合或许是提高化疗药物疗效和降低宫颈癌死亡率的手段，大大提高了此抑制剂抗肿瘤的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种将TIGA1(Transcript Induced byGrowth Arrest 1)作为靶点来增强谷氨酰胺酶抑制剂抗癌活性以有效治疗宫颈癌等癌症的方法。

背景技术

宫颈癌通常是一种以化疗药物难以治疗的疾病。绝大多数宫颈癌含有免疫人类乳头瘤病毒(HPV)抗原。世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二,全球每年约有46.6万妇女被诊断为宫颈癌,约有28.8万患者死亡。我国每年宫颈癌的新增病例约13.5万,死亡病例约有3-5万人。

癌细胞新陈代谢的碳源和氮源主要来源于葡萄糖和谷氨酰胺。即使在有氧气条件下，癌细胞内的代谢主要是葡萄糖酵解而不是氧化磷酸化，这种有氧糖酵解称为Warburg效应，线粒体缺陷能加重此效应。Warburg效应可导致葡萄糖摄取增加，糖酵解加速和乳酸产生，通过提供过剩代谢底物以及减少线粒体内活性氧的产生以提供有利于癌细胞生长的条件，是癌细胞生长和增殖以及抗药性的基础。当葡萄糖缺乏时，细胞则可以通过代偿性增加谷氨酰胺代谢来维持细胞的基本新陈代谢。

随着近年来新型谷氨酰胺酶抑制剂968和BPTES的发现，谷氨酰胺代谢成为癌症靶向治疗的一大热点。最新的谷氨酰胺酶抑制剂CB-839是BPTES的同源物，已于2014年开始临床一期试验。然而，谷氨酰胺酶抑制剂有较大的副作用且其抗肿瘤效果相对有限，其原因与癌细胞Warburg效应所产生的抗药性有关。因此，查明Warburg效应抗药性的原因以及找到与此相关的靶点是谷氨酰胺酶抑制剂等化疗药物有效治疗癌症的关键所在。

TIGA1是由位于染色体5q22.2区域内的EPB41l4A-AS1基因编码的一种小蛋白。此区域内DNA片段丢失时常发生，因此与肿瘤密切相关。此区域内EPB41l4A-AS1的反义长非编码RNA(lncRNA)叫做EPB41l4A-AS2，与肿瘤细胞的生长密切相关。尽管EPB41l4A-AS1也被认为是一种长非编码RNA，它依然可以编码有122个氨基酸的蛋白TIGA1,这种蛋白是大肠杆菌中氰酸酶的同源物，位于线粒体膜上，但其功能并不清楚。有报道提示TIGA1可能与维持细胞周期过程中无机离子的转运和代谢有关。的确，体外过表达TIGA1可抑制肿瘤细胞的增殖和生长。

发明内容

本发明的一个目的是提供抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达和/或活性的物质的用途。

本发明提供了抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达和/或活性的物质在制备治疗肿瘤的产品中的应用；

或，抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达和/或活性的物质在制备抑制肿瘤细胞生长的产品中的应用。

本发明的第二个目的是提供抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达和/或活性的物质的用途。

本发明提供了抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达和/或活性的物质在制备促进谷氨酰胺酶抑制剂治疗或抑制肿瘤产品中的应用；

或TIGA1作为靶点在促进谷氨酰胺酶抑制剂治疗或抑制肿瘤中应用。

上述应用中，所述抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达和/或活性的物质为如下1)或2)：

1)干扰肿瘤细胞中TIGA1表达的双链siRNA；

2)表达所述双链siRNA的重组载体。

上述应用中，所述双链siRNA的正义链为序列1所示的核苷酸，反义链为序列2所示的核苷酸；且所述双链siRNA上的U和C碱基均采用2′甲氧基修饰或2′氟代修饰。。

上述应用中，所述肿瘤为宫颈癌；

或，所述肿瘤细胞为Hela细胞。

本发明第三个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，包括上述抑制或降低肿瘤细胞中TIGA1表达和/或活性的物质和谷氨酰胺酶抑制剂。

上述产品中，所述产品具有如下1)-3)中至少一种功能：

1)治疗肿瘤；

2)抑制肿瘤细胞生长；

3)促进谷氨酰胺酶抑制剂治疗或抑制肿瘤。

上述产品中，所述谷氨酰胺酶抑制剂为化合物968。

上述产品中，所述产品为试剂盒或单独包装的药物组合物或混合包装的药物组合物。

上述产品中，所述肿瘤为宫颈癌；

或，所述肿瘤细胞为Hela细胞。

本发明提供一种通过RNA干扰将TIGA1作为靶点来增强谷氨酰胺酶抑制剂抗癌活性以有效治疗宫颈癌等癌症的应用。当TIGA1基因表达量通过RNA干扰技术被敲低后，可阻断葡萄糖来源的丙酮酸进入三羧酸循环，从而促发谷氨酰胺代偿性增加。谷氨酰胺酶抑制剂如化合物968可抑制谷氨酰胺代谢而不能影响糖酵解，因此抑制肿瘤细胞生长作用较弱。因此，在TIGA1基因被敲低的同时用谷氨酰胺酶抑制剂处理癌细胞，可同时阻断糖代谢和谷氨酰胺代谢，造成细胞营养和能量匮乏，导致生长显著减慢，达到治疗癌症的目的。

本发明的实验证明，本发明以TIGA1基因为有效靶点，结合RNA干扰技术和谷氨酰胺酶抑制剂，显著降低了癌细胞的抗药性并提高了谷氨酰胺酶抑制剂的抗癌活性，可用于治疗宫颈癌。将此靶点与谷氨酰胺酶抑制剂等化疗药物结合或许是提高化疗药物疗效和降低宫颈癌死亡率的手段，大大提高了此抑制剂抗肿瘤的效果。

附图说明

图1为利用实时定量PCR检测Hela细胞内瞬时转染TIGA1的特异性siRNA后TIGA1的mRNA的表达量。

图2为利用Westernblot方法检测Hela细胞内瞬时转染TIGA1的特异性siRNA后TIGA1的蛋白表达量。

图3为稳定表达shTIGA1的Hela细胞系与其对应的对照的细胞系的软琼脂集落形成实验。

图4为裸鼠分别皮下注射表达shTIGA1的稳定Hela细胞与其相应的对照细胞后,用化合物968腹腔给药并测量肿瘤的体积。

图5为TIGA1调低组与对照组在用谷氨酰胺酶抑制剂治疗后的肿瘤大小的代表图片。

图6为对图5中两组肿瘤进行称重后比较其重量差异。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、沉默肿瘤细胞中TIGA1表达

在长期的实验中发现TIGA1基因与癌细胞Warburg效应以及能量代谢有密切关系，同时发现谷氨酰胺酶抑制剂作为抗肿瘤药物疗效并不理想，而这种药物低效性可能与Warburg效应有关，因此，研究TIGA1作为靶点是否可以提高谷氨酰胺酶抑制剂抗肿瘤的效果。

一、siRNA瞬时转染Hela细胞

1、用于干扰TIGA1基因表达的2个siRNA

siTIGA1-1：

正义链5’-GGAUGUCCUUGGUGAGGAUTT-3’(序列1),

反义链5’-AUCCUCACCAAGGACAUCCTT-3’(序列2)；

siTIGA1-2:

正义链5’-GGCCUUACCGUAUAACUGATT-3’

反义链5’-UCAGUUAUACGGUAAGGCCTT-3’。

siRNA双链上在U和C碱基上采用2′甲氧基；

将上述siTIGA1-1和siTIGA1-2的正义链和反义链退火，得到siTIGA1-1和siTIGA1-2；

利用Lipofectamine 3000转染试剂将两条TIGA1的特异性siTIGA1-1和siTIGA1-2分别瞬时转染Hela细胞系，48小时后。

2、基因表达分析

利用RNAiso plus(TAKARA)提取两条siRNA分别瞬时转染Hela细胞系48小时后的总RNA，用ReverTraAceqPCR RT试剂盒(TOYOBO)将总RNA进行逆转录成cDNA。定量PCR利用SYBR Green RealTime PCRMaster Mix(TOYOBO)来完成，同时做三个重复，以ACTB为内参。所用的引物如下:EPB41L4A-AS1(正义5’-CCTGGTTTTATTTTCGTCA-3’,反向5’-ATCCATCTTCCACCTGTAG-3’),ACTB(正向5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’,反向5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’)。

结果如图1所示，NC为Hela细胞，可以看出，两条siRNA均有较好的抑制TIGA1基因表达。

3、Westernblot蛋白定量分析

利用裂解液(配方为50mM TRIS-HCl,pH 8.0,4M urea and 1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂)提取两条siRNA分别瞬时转染Hela细胞系48小时后细胞内蛋白后用SDS-PAGE胶分离(恒定电流30毫安跑胶)。然后将蛋白转到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶(溶解于TBST)在室温下孵育一小时。随后一抗(ACTB和TIGA1)室温孵育一小时，并用TBST清洗膜三次后，加入二抗(Anti-Rabbit IgG和Anti-Goat IgG)室温孵育一小时。孵育完毕后继续用TBST清洗三次，然后暗室曝光。所用抗体如下ACTB(Proteintech,#20536-1-AP),TIGA1(Santa Cruz,sc-244315),Anti-Rabbit IgG(KPL,074-1506),Anti-Goat IgG(KPL,14-13-06)。

结果如图2所示，可以看出，此两条siRNA均能敲低细胞内表达TIGA1。

二、利用shRNA技术构建了可稳定过表达TIGA1特异性siRNA的Hela细胞系

Hela宫颈癌细胞系购自美国ATCC公司，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基(购自Thermo Fisher Scientific)置于37摄氏度、5％的二氧化碳条件下培养。

将上述一中的ShTIGA1的正义链和反义链退火，得到双链shTIGA1-1和双链shTIGA1-2；

表达siTIGA1-1的质粒为将双链siTIGA1-1的编码DNA分子插入GV248载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)得到的载体，可以稳定表达siTIGA1(上海吉凯基因化学技术公司构建的过表达siTIGA1-1的质粒，提供双链siTIGA1-1的编码DNA分子即可)。

表达siTIGA1-2的质粒为将双链siTIGA1-2的编码DNA分子插入GV248载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)得到的载体，可以稳定表达siTIGA2。

表达siTIGA1-1的质粒、表达siTIGA1-2的质粒shRNA和GV248载体(对照质粒)分别用Lipofectamine3000转染至Hela细胞系，转染48小时后开始用终浓度为200微克每毫升的嘌呤霉素水溶液进行稳定细胞系的筛选，一个月后，能够在此浓度药物中正常生存的细胞为稳定转siTIGA1-1细胞、转siTIGA1-2细胞和转GV248载体细胞。

采用上述一的基因表达和WB检测，均检测稳定表达siTIGA1的细胞系中TIGA1表达敲低。

实施例2、沉默肿瘤细胞中TIGA1表达在治疗肿瘤中的应用

一、体外实验软琼脂集落形成

分别收集对数生长期的转siTIGA1-1细胞(SHTIGA1)和转GV248载体细胞(SHNC)，调整细胞浓度，制成500活细胞每毫升的细胞悬液。15mlEP管中加入9ml此细胞悬液，然后各加入1ml3％的琼脂后混匀。六孔板中每孔加入混匀后的液体2ml，并于室温放置20分钟使其凝固。将细胞置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养。

将上述细胞分为对照组和实验组分别处理：

对照组：将各个细胞在含有DMSO的培养基中培养10天，每3天更换一次新鲜的培养基；

含有DMSO的培养基为DMSO(D2650)和细胞培养基组成。DMSO浓度为千分之一。

实验组：将各个细胞在含有谷氨酰胺酶抑制剂化合物968(SIGMA，SML1327)的培养基培养10天，每3天更换一次新鲜的培养基；

含有化合物968的培养基为由10纳摩尔浓度的化合物968和细胞培养基(DMEM培养基、Thermo Fisher，10566-016)组成。

观察集落形成情况，结果如图3所示，可以看出，

与转GV248载体细胞对照组相比，转GV248载体细胞实验组单独用谷氨酰胺酶抑制剂化合物968处理，可以减少琼脂中癌细胞克隆数目，但不能抑制集落形成；

与转siTIGA1-1细胞载体细胞对照组相比，转siTIGA1-1细胞载体细胞实验组，在TIGA1表达量被敲低的条件下同时用化合物968处理细胞，可导致癌细胞克隆数目及面积急剧下降。这是由于对于转siTIGA1-1细胞载体细胞对照组来说，单独敲低TIGA1基因的表达后，可阻断葡萄糖来源的丙酮酸进入三羧酸循环，从而促发谷氨酰胺代偿性增加，因此对集落形成的影响不明显。

表明，以TIGA1为靶点敲低TIGA1基因表达和谷氨酰胺酶抑制剂共同作用的治疗方案有较为理想的抗宫颈癌的作用。

二、体内实验

4周龄裸鼠购自广州动物实验中心，并于动物房饲养一周后在用于试验。将小鼠随机分为两组：

转siTIGA1-1细胞组(SHTIGA1-1)：用于皮下注射转siTIGA1-1细胞；每组7只，每只小鼠分别注射5×10⁵个癌细胞。

Hela细胞组(SHNC)：用于皮下注射对照Hela细胞；每组7只，每只小鼠分别注射5×10⁵个癌细胞。

13天后肿瘤长大体积达到75mm³后，每两天每只小鼠腹腔内注射100微克谷氨酰胺酶抑制剂化合物968。同时注射DMSO或PBS作为阴性对照。

四周后，取小鼠体内肿瘤称重并进行定量分析，结果如图4和图6所示，与Hela细胞组相比，转siTIGA1-1细胞组对谷氨酰胺酶抑制剂的敏感性显著提高，此组肿瘤的生长被有效抑制，其肿瘤重量显著小于对照组。

肿瘤体积的统计图如5所示，可以看出，转siTIGA1-1细胞组肿瘤体积显著低于Hela细胞组。

表明合并TIGA1基因敲低和谷氨酰胺酶抑制剂具有较为理想的抗肿瘤效果。

序列表

<110>清华大学深圳研究生院 苏州吉玛基因股份有限公司 深圳南粤药业有限公司

<120> 一种将TIGA1作为靶点来增强谷氨酰胺酶抑制剂抗宫颈癌活性的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ggauguccuu ggugaggaut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

auccucacca aggacaucct t 21