松柏醛或松柏醛和钒化合物组合物用于预防和治疗神经退行性病变的用途

摘要

本发明公开了一种松柏醛或松柏醛和钒化合物组合物用于预防和治疗神经退行性病变的用途，以松柏醛或松柏醛和钒化合物联合的药物组合物为原料，制备用于预防和治疗神经退行性病变阿尔茨海默症的药物或保健食品的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及由松柏醛或松柏醛和钒化合物联合的药物组合物为主要原料，制备用于预防和治疗神经退行性病变阿尔茨海默症的药物或保健食品的用途。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是目前威胁世界人口健康和社会经济的重大疾病之一。其原因一是人口老龄化的加剧，患病人数逐年增加。美国65岁以上人口中，每8人便有一人受此病困扰，25％的住院老年病人患有AD症；国内的情况和美国相似。其二是从神经组织发生AD病理变化到可见的临床认知障碍症状之间存在较长的时间差，造成一旦确诊就失去了治疗的最佳时间。这种病变和症状之间的不同步性可用大脑的“认知储备”来解释。其三是目前缺乏有效的AD治疗方案，并且费用昂贵。据统计，美国每年用于治疗AD的费用是普通老年病治疗费用的9倍多。这种巨额费用对各国都是严重的经济威胁，甚至有可能导致医保系统破产的风险。因此，研发AD的治疗药物具有重大的科学和应用意义。

在过去的研究中，淀粉样蛋白理论(Aβhypothesis)一直是公认的AD病理机制和药物AD药物研发的焦点。然而，过去基于清除淀粉样斑块策略的药物均遭失败。这就需要研究者对AD病理变化的机制进行重新检讨，从新的关键病理环节出发设计治疗方案和发现新作用机制的药物。

Aβ级联反应假说的研究表明，老年阶段的淀粉样斑块在AD相当晚期才出现，而Aβ寡聚体才是破坏大脑功能完整性的首要因素。Aβ寡聚体具有神经毒性，可引起神经突触损失，降低神经元可塑性，改变能量代谢，引起氧化应激和线粒体功能紊乱。因此未来AD研究的方向应该是如何在脑神经发生损伤前清除毒性的Aβ蛋白或抑制其毒性；

Aβ除了单独作用外，也和Tau蛋白过度磷酸化相互关联。AD患者病理性过度磷酸化时，Tau蛋白的正常功能受到了损害，由于激酶和磷酸酶催化活性之间的平衡被打破，引发Tau蛋白过度磷酸化。Tau蛋白过度磷酸化导致不溶性双螺旋丝(PHF)形成，微管结合能力的丧失使细胞骨架不稳定，最终引起神经退行性病变和神经元死亡。因此Tau蛋白可作为靶点在AD患者中进行进一步安全和有效性的探究；

Aβ不仅出现在神经细胞中，而且在线粒体中也有相应浓度。其可以抑制线粒体呼吸酶复合物II和IV，使ATP产生降低，ROS产量升高，最终导致线粒体功能紊乱；研究表明，Aβ累积还引起了线粒体分裂(Fis1)和融合(Mfn1/2和OPA1)蛋白表达的异常，打破线粒体正常的动态平衡，导致损伤线粒体清除减少，加剧神经退行性病变。线粒体功能紊乱在AD进程中十分关键，被认为是治疗AD的另一个重要靶点。

另外，AD和糖尿病分享着许多共同的病理现象，而且相互促进彼此的病理进程。在超过80％的AD患者身上，都有不正常的血糖水平或是胰岛素抵抗症状，而且II型糖尿病人罹患AD的风险比健康人群高两倍多。抗糖尿病钒化合物是人所共知的胰岛素增敏剂，有可能通过消除胰岛素抵抗发挥阻止AD疾病进程的作用。一项临床调查表明，富钒饮水的糖尿病人和非糖尿病人的脑认知能力都保持较好。

发明内容

针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供松柏醛或松柏醛和钒化合物组合物用于预防和治疗神经退行性病变的用途。

为实现上述目的，本发明提供一种松柏醛或松柏醛和钒化合物组合物用于预防和治疗神经退行性病变的用途，以松柏醛或松柏醛和钒化合物联合的药物组合物为原料，制备用于预防和治疗神经退行性病变阿尔茨海默症的药物或保健食品的用途。

作为本发明的进一步改进，所述钒化合物包括无机钒化合物和有机钒化合物，所述无机钒化合物包括氧钒配合物、过氧钒配合物、羟胺钒配合物、钒的杂多酸配合物；所述有机钒化合物包括苯甲酸氧钒、阿司匹林氧钒、乙酰丙酮氧钒、双(2-甲基-3-羟基-4-吡喃酮)氧钒(BMOV)、3-羟基-2-乙基-4-吡喃酮(BEOV)、3-羟基-2-异丙基-4-吡喃酮(BIOV)、3-羟基-2-正丁基-4-吡喃酮(BnBOV)、二(吡啶2-甲酸)氧钒(VO(Pa)2)、吡啶二甲酸氧钒(VO-DPA)、吡啶甲酸酞胺氧钒(VO-PAM)、甲基吡啶甲酸氧钒(VO-MPA)、吡啶甲酸氧钒(VO-PA)、丙二酸羟胺氧钒、草酸羟胺氧钒、缬氨酸羟胺氧钒、亮氨酸羟胺氧钒。

作为本发明的进一步改进，所述钒化合物还包括以曲酸吡喃酮为母核，2位上引入抗氧化基团合成的BSOV系列以及以氨基三乙酸为碳骨架引入具有羟基苯胺或羟基苯乙胺衍生物结构的抗氧化功能配体制备的新型氧钒配合物(VOL1-VOL6)。

作为本发明的进一步改进，所述松柏醛的浓度范围在100μM-0.1μM内均具有不同程度提升正常及Aβ过载条件下神经细胞的活力。

作为本发明的进一步改进，正常及Aβ过载条件下神经细胞是以SH-SY5Y人神经母细胞瘤及过量表达野生型淀粉样前体蛋白(APP)和瑞士突变型淀粉样前体蛋白(APPsw)的细胞。

作为本发明的进一步改进，药物对神经细胞的作用时间为12h、24h、36h、48h。

作为本发明的进一步改进，所述松柏醛的浓度范围在100μM-50μM内与钒化合物的浓度为1μM的联合使用效果最显著。

作为本发明的进一步改进，所述松柏醛的浓度为100μM时，与钒化合物的浓度为1μM的联合使用在AD细胞及动物模型上效果最优。

作为本发明的进一步改进，选用的阿尔茨海默症动物模型为APPswe/PS1dE9(APP/PS1)双转基因小鼠。

作为本发明的进一步改进，所述神经退行性病变为包括阿尔茨海默症的所有神经退行性疾病。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明公开的松柏醛或松柏醛和钒化合物组合物用于预防和治疗神经退行性病变的用途，以松柏醛或松柏醛和钒化合物联合的药物组合物为原料，制备用于预防和治疗神经退行性病变阿尔茨海默症的药物或保健食品的用途；松柏醛或松柏醛和钒化合物组合物通过抑制Aβ毒性、抑制Tau蛋白过度磷酸化、恢复细胞线粒体功能、刺激神经细胞再生、等机制，保护神经细胞，维持神经细胞功能；钒化合物可能通过调节脑神经细胞葡萄糖代谢和刺激神经细胞再生保护阿尔茨海默症、糖尿病和缺血性脑卒中模型动物的神经细胞活力和神经认知功能，食物成分的松柏醛和钒化合物联合也可以开发成预防阿尔茨海默症的药物或保健食品。

附图说明

图1是MTS实验检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)对Aβ过载神经细胞APPwt和APPswe的细胞活力的影响；

图2是MitoTracker线粒体选择探针法检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)对神经细胞SH-SY5Yneo的线粒体形态的影响；

图3是MitoTracker线粒体选择探针法检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)对Aβ过载神经细胞APPwt的线粒体形态的影响；

图4是MitoTracker线粒体选择探针法检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)对Aβ过载神经细胞APPswe的线粒体形态的影响；

图5是Western Blot实验检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)对APPswe/PS1dE9(APP/PS1)动物模型的大脑皮层及海马组织中Aβ寡聚以及Tau蛋白磷酸化的影响；

图6是免疫组化染色实验检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)对APPswe/PS1dE9(APP/PS1)动物模型的大脑皮层及海马组织中Aβ寡聚的影响；

图7是尼氏染色实验检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)对APPswe/PS1dE9(APP/PS1)动物模型的海马组织中神经细胞的影响。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种松柏醛或松柏醛和钒化合物组合物用于预防和治疗神经退行性病变的用途，以松柏醛或松柏醛和钒化合物联合的药物组合物为原料，制备用于预防和治疗神经退行性病变阿尔茨海默症的药物或保健食品的用途。

其中，钒化合物是包括所有无机钒化合物和有机钒化合物，无机钒化合物包括氧钒配合物、过氧钒配合物、羟胺钒配合物、钒的杂多酸配合物等，包括苯甲酸氧钒、阿司匹林氧钒、乙酰丙酮氧钒、双(2-甲基-3-羟基-4-吡喃酮)氧钒(BMOV)、3-羟基-2-乙基-4-吡喃酮(BEOV)、3-羟基-2-异丙基-4-吡喃酮(BIOV)、3-羟基-2-正丁基-4-吡喃酮(BnBOV)、二(吡啶2-甲酸)氧钒(VO(Pa)2)、吡啶二甲酸氧钒(VO-DPA)、吡啶甲酸酞胺氧钒(VO-PAM)、甲基吡啶甲酸氧钒(VO-MPA)、吡啶甲酸氧钒(VO-PA)、丙二酸羟胺氧钒、草酸羟胺氧钒、缬氨酸羟胺氧钒、亮氨酸羟胺氧钒等及本课题组发明的以曲酸吡喃酮为母核，2位上引入抗氧化基团合成的BSOV等系列以及以氨基三乙酸为碳骨架引入具有羟基苯胺或羟基苯乙胺衍生物结构的抗氧化功能配体制备的新型氧钒配合物(VOL1-VOL6)等所有钒化合物。

优选的，所述浓度范围100μM-0.1μM均具有不同程度提升正常及Aβ过载条件下神经细胞的活力，其中浓度范围在100μM-50μM之间提升正常及Aβ过载条件下神经细胞的活力的能力最显著。正常及Aβ过载条件下神经细胞是以SH-SY5Y人神经母细胞瘤及过量表达野生型淀粉样前体蛋白(APP)和瑞士突变型淀粉样前体蛋白(APPsw)的细胞(分别简称为SH-SY5Yneo细胞、APPwt细胞、APPswe细胞)。药物对神经细胞的作用时间为12h、24h、36h、48h，其中36h效果最明显。

优选的，所述松柏醛的浓度范围在100μM-50μM与钒化合物的浓度为1μM的联合使用效果最显著，所述松柏醛的浓度为100μM最优。

优选的，所述松柏醛的浓度范围在50μM-100μM与钒化合物的浓度为1μM的联合使用效果最显著，所述松柏醛的浓度为100μM时，与钒化合物的浓度为1μM的联合使用在AD细胞及动物模型上效果最优。

优选的，选用的阿尔茨海默症动物模型为APPswe/PS1dE9(APP/PS1)双转基因小鼠。

优选的，所述神经退行性病变为包括阿尔茨海默症的所有神经退行性疾病。

本发明的目的在于以disease modification为目标，发现能对以上关键病理环节发挥作用的抗阿尔茨海默症化学药物。

松柏醛是一种食物成分，它主要用作生物测定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质。其中白兰地中松柏醛的含量为1.68-2.8mg/L，松柏醛还存在于多种中药材中，如杜仲刺、五加、竹茹、芦根、蜂胶等。但目前并没有关于松柏醛的临床药用资料，在查阅的相关文献中，有关于植物源抑菌活性成分的研究表明，从灰胡桃中提取的松柏醛成分具有抑菌及抗菌等功效；从畲药半边风中分离的化学成分松柏醛具有一定的抑制大鼠中性粒细胞(PMN)呼吸爆发的作用等。

有文献表明松柏醛可能是肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的一种产物。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是催化木质素特异途径的第一个限速酶，可能对木质素生物合成途径具有潜在的调控作用。由于松柏醛广泛存在于多种植物中，因此认为它可能是存在于植物木质部的一种化学成分。

近些年来，从中药成分中发现抗AD药物一直是研究者的重点之一。之前有研究表明，肉桂及其提取物(主要活性成分是花青素)在AD细胞及动物模型上具有一定的防治功效。我们则在细胞层次深入研究了肉桂的另一主要成分肉桂醛的作用及其分子机制。进而，在此基础上，本文以Aβ过度分泌的SH-SY5Y细胞为研究模型，用高效快捷的MTS法为筛选方法，着眼于Aβ和线粒体作用靶点，从多种中药活性成分库中筛选出了具有良好抗AD活性的化合物松柏醛(4H3M)。我们的研究表明，其能提升正常及Aβ过载条件下神经细胞的活力，具有较好的抑制Aβ寡聚等功效。松柏醛(4H3M)是4-羟基肉桂醛类物质中的一种，本发明以松柏醛(4H3M)作为药物模型，研究其预防及治疗AD的作用。我们初步的细胞和动物实验表明，松柏醛(4H3M)通过：

①、抑制Aβ毒性

②、抑制Tau蛋白过度磷酸化

③、恢复细胞线粒体功能

④、刺激神经细胞再生

等机制，保护神经细胞，维持神经细胞功能。分析松柏醛的化学结构可发现，其活性表现与分子结构中的酚羟基及α,β-不饱和醛酮结构有关。其中酚羟基的化学环境，酚羟基所处空间环境的拥挤状态都会影响化合物的活性。

另外，近年来发现，Aβ负担与金属代谢紊乱、胰岛素抵抗等相互循环加剧神经细胞的氧化应激和Tau过度磷酸化等对神经细胞的损伤。基于抗糖尿病钒化合物的分子机制和前期实验结果，我们首次提出抗糖尿病金属化合物有可能通过消除胰岛素抵抗和提高细胞抗氧化能力、有效降低Aβ负担及其神经损伤，从而阻止AD病理进程和保护神经“认知储备”。松柏醛在作用上与必需生物元素钒具有显著协同性。我们及文献的研究初步表明，钒化合物可能通过调节脑神经细胞葡萄糖代谢和刺激神经细胞再生保护阿尔茨海默症、糖尿病和缺血性脑卒中模型动物的神经细胞活力和神经认知功能。食物成分的松柏醛和钒制剂联合也可以开发成预防阿尔茨海默症的保健食品。

下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：

实施例1

松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)化合物(4H3M+VAC)组合物制剂的制备

称取17.18mg(0.1mmol)松柏醛(4H3M)，取10mL DMSO溶解，配置成浓度为10mM的松柏醛(4H3M)母液；取100μL的松柏醛(4H3M)母液(10mM)稀释于9.9mL的DMEM(含10％血清)中制得200μM的松柏醛(4H3M)溶液；然后分别将200μM的松柏醛(4H3M)溶液稀释至100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM制得不同浓度的松柏醛(4H3M)溶液。

称取26.51mg(0.1mmol)乙酰丙酮氧钒(VAC)，取10mL蒸馏水溶解，配置成浓度为10mM的乙酰丙酮氧钒(VAC)母液；取10μL的乙酰丙酮氧钒(VAC)母液(10mM)稀释于9.99mL的DMEM(含10％血清)中制得10μM的乙酰丙酮氧钒(VAC)溶液；然后将10μM的乙酰丙酮氧钒(VAC)溶液稀释至2μM；将200μM的松柏醛(4H3M)溶液与2μM的乙酰丙酮氧钒(VAC)溶液以1:1的比例混合制得松柏醛(4H3M)和乙酰丙酮氧钒(VAC)的终浓度分别为100μM和1μM的松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)化合物(4H3M+VAC)组合物制剂。

实施例2

MTS实验检测细胞活力

细胞预培养和传代：细胞置于37℃，5％CO₂的条件下培养，培养基为DMEM(含10％胎牛血清)，100μM>3的细胞培养瓶中，清洗细胞表面3次，并弃去PBS；(3)加入1mL>

MTS法：

(1)接种细胞：用DMEM(含10％胎牛血清)培养基配成细胞悬液后，以每孔3000-4000个细胞接种到96孔板中，每孔体积100μL；(2)细胞约60％融合后加入药物作用36h；3)用DMEM(含10％胎牛血清)培养基配置10％的MTS溶液，药物作用36h后弃去原培养孔中的溶液，每孔加10％MTS溶液100ul，继续孵育2h；(3)2h后用酶标仪测定各孔光吸收值(激发波长为490nm)，以药物浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制药物作用曲线。

如图1所示MTS实验检测化合物松柏醛(4H3M)对Aβ过载神经细胞APPwt和APPswe的细胞活力的影响；根据图1可知，松柏醛(4H3M)浓度范围100μM-0.1μM均具有不同程度提升正常及Aβ过载条件下神经细胞的活力，其中浓度范围在100μM-50μM之间提升正常及Aβ过载条件下神经细胞的活力的能力最显著。

实施例3

MitoTracker线粒体选择探针法检测细胞线粒体形态

Red>2的confocal皿中；(2)待细胞融合约40-50％后加入浓度为100μM松柏醛(4H3M)溶液作用36h；(3)除去旧培养基，加入含50nMMitoTracker>

如图2，3，4所示MitoTracker线粒体选择探针法实验检测化合物松柏醛(4H3M)对SH-SY5Yneo细胞和Aβ过载神经细胞APPwt和APPswe的线粒体形态的影响；根据图2，3，4可知，松柏醛(4H3M)浓度为100μM可减少三种细胞的非正常的椭圆型线粒体，重塑正常的丝状线型线粒体形态的功能，通过重建线粒体形态，恢复线粒体功能，从而抵抗Aβ毒性。

实施例4

动物模型和药物治疗

8周的雌性APPswe/PS1dE9(APP/PS1)动物模型15只，随机分为3组：对照组、松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组，每组5只，2-3只/笼饲养，12/12h明暗周期，环境温度为22-26℃。待鼠龄为12周左右，按如下方法饲喂：

●对照组APP/PS1鼠：普通饲料喂养；

●松柏醛(4H3M)组APP/PS1鼠：以含0.2mmol/kg/day将松柏醛(4H3M)均匀掺入饲料中喂养；

●松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组APP/PS1鼠：以含0.2mmol/kg/day的松柏醛(4H3M)和含0.1mmol/kg/day的乙酰丙酮氧钒(VAC)均匀掺入饲料中喂养；

实施例5

跳台行为学检测

按实施例4饲喂3组APP/PS1鼠，分别于3个月及4个月之后进行跳台行为学检测，测试3组APP/PS1鼠的学习及记忆能力。

跳台实验：用不透明黑色挡板分隔成8室，每室120mm×120mm×180mm，室底电栅可通电。将参加实验的各组APP/PS1鼠先放入反应箱内自由活动5min，熟悉环境，然后接通铜栅电源(0.25mA)，小鼠受到电击后其正常反应是寻找安全跳台以躲避电击。各组小鼠从受到电击到首次寻找到安全跳台，记录第1次跳下平台的时间(潜伏期)和5min内从安全跳台跳下的错误次数(基础错误次数)，作为学习测试成绩；1天后重复上述实验，记录各组小鼠第1次跳下安全跳台的时间(潜伏期)和5min内受到的电击次数(错误次数)，作为记忆测试成绩。实验时，若小鼠停留在安全跳台的时间超过5min，其潜伏期以5min计算。

表1是跳台行为学实验检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)给药3个月时间对APPswe/PS1dE9(APP/PS1)动物模型的学习和记忆的影响。

表2是跳台行为学实验检测本发明实施例1所制备的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)给药4个月时间对APPswe/PS1dE9(APP/PS1)动物模型的学习和记忆的影响。

表1

表2

根据表1和表2的跳台实验结果可知，在给药三个月之后，与对照组相比，松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组的AD鼠的学习和记忆能力均得到了明显的改善；给药四个月之后，松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组的AD鼠的记忆能力均得到了明显的改善，与对照组相比具有显著性差异。

实施例6

Western Blot实验检测

按实施例4饲喂3组APP/PS1鼠，6.5个月之后脱颈处死，取脑组织(去除嗅球和小脑)，分成左右两个半球。取其中一个半球于液氮中冻存，取其大脑皮层和海马区组织研磨，用加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的提取液提取可溶性的Aβ蛋白，用BCA法进行蛋白浓度测定，将上样缓冲液与各蛋白样品充分混匀，100℃水浴锅中煮样5-10min。

Western Blot实验检测Aβ寡聚：(1)配胶：配置15％分离胶和5％浓缩胶；(2)电泳：每孔上样15μg蛋白，低电压50V，30min，以溴酚蓝为指示，待前沿跑过浓缩胶后调整电压为120V，继续电泳约90min待溴酚蓝前沿跑出分离胶，即可停止电泳；(3)转膜：200V，100min，转膜期间及时降温，电流不可超过400mA；(4)封闭：5％脱脂奶粉摇床封闭1.5h-2h；(5)孵育抗体：稀释6E10一抗至说明书比例，摇床4℃过夜；取出膜，用TBST洗膜，每次10min，洗三次；按照说明书比例稀释相应二抗，室温下摇床孵育60min；TBST洗膜三次，每次20min；(6)曝光。

Tau蛋白磷酸化的检测步骤(1)(2)(3)(4)同上，(5)孵育抗体：稀释Tau蛋白一抗至说明书比例，摇床4℃过夜；取出膜，用TBST洗膜，每次10min，洗三次；按照说明书比例稀释相应二抗，室温下摇床孵育60min；TBST洗膜三次，每次20min；(6)曝光。

GAPDH蛋白的检测：将曝光后的PVDF膜用蛋白印记再生液洗涤，然后用TBST洗膜10min，然后按上述同样方法孵育一抗和二抗，曝光。

如图5所示Western Blot实验检测对照组、松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组这三组AD鼠的脑组织中的可溶性Aβ蛋白的含量以及Tau蛋白磷酸化的情况；根据图5所知，与对照组相比，松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组的AD鼠大脑中可溶性Aβ蛋白的含量显著降低，磷酸化Tau蛋白的含量显著减少，证明松柏醛(4H3M)和4H3M+VAC组合物能够显著抑制Aβ蛋白的寡聚，并减少Tau蛋白的磷酸化。

实施例7

免疫组化实验检测APP/PS1鼠脑组织中Aβ斑块沉积

按实施例4饲喂3组APP/PS1鼠，6.5个月之后脱颈处死，取脑组织(去除嗅球和小脑)，分成左右两个半球。取其中一个半球于4％福尔马林溶液中固定48h，制作石蜡切片，切片厚约5μm。(1)石蜡切片脱蜡至水；(2)3％H₂O₂室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；(3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，两次；(4)5-10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10min，弃去血清，稀释6E10一抗至说明书比例，滴加一抗工作液，37℃孵育1-2h；(5)PBS冲洗，5min，3次；(6)滴加适量生物素化标记二抗工作液，37℃孵育30min；(7)PBS冲洗，5min，3次；(8)滴加适量的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30min；(9)PBS冲洗，5min，3次；(10)DAB显色5min；(11)自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。(11)置于显微镜下观察拍照。

如图6所示免疫组化实验检测对照组、松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组这三组AD鼠的脑组织中的Aβ蛋白沉积的情况；根据图6所知，与对照组相比，松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组的AD鼠大脑中Aβ蛋白沉积有所减少，在高倍镜下观察，蛋白沉积斑块的体积大小及个数都有所减少。

实施例8

尼氏染色法检测APP/PS1鼠脑组织中海马区神经细胞

按实施例4饲喂3组APP/PS1鼠，6.5个月之后脱颈处死，取脑组织(去除嗅球和小脑)，分成左右两个半球。取其中一个半球于4％福尔马林溶液中固定48h，制作石蜡切片，切片厚约5μm。首先切片置于焦油紫染料中染缸中，56℃孵育1h，酒精灯上加温约10min，蒸馏水冲洗后，分化1-3min，显微镜下观察至背景无色为止；无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；置于显微镜下观察拍照。

如图7所示尼氏染色法实验检测对照组、松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组这三组AD鼠的脑组织的海马区；根据图7所知，与对照组相比，松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组的AD鼠大脑中海马区的存在大量的尼氏体，与对照组有显著性差异。由于尼氏体是神经元内合成蛋白质的重要部位，当神经元受到刺激后，胞体内的尼氏体会明显减少，因此证明4H3M和4H3M+VAC两组药物能够保护神经元或具有刺激神经元再生的功能。

实施例9

APP/PS1鼠的脑重检测

按实施例4饲喂3组APP/PS1鼠，6.5个月之后脱颈处死，取心、肝、肾和脑组织(去除嗅球和小脑)分别称重，比较三组APP/PS1鼠的各脏器重量的差异。

表3所示脏器称重实验检测对照组、松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组这三组APPswe/PS1dE9(APP/PS1)动物模型在给药6.5个月之后的心、肝、肾和脑组织的重量。

表3

根据表3所显示的对照组、松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M)联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组这三组AD鼠在给药6.5个月之后的心、肝、肾和脑组织的重量，发现松柏醛(4H3M)组和松柏醛(4H3M) 联合乙酰丙酮氧钒(VAC)(4H3M+VAC)组合物制剂组的AD鼠脑重均比对照组重，结果表明，这两组药物可能具有保护神经元、刺激神经元再生的作用。

本发明通过上述实施例来说明本发明的详细实验流程及所应用的SH-SY5Y等三种细胞模型和APP/PS1双转基因AD动物模型，但本发明并不局限于上述详细实验流程和AD细胞和动物模型，即不意味着本发明必须依赖上述详细实验流程和AD细胞和动物模型才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品的任何结构的改变及钒化合物的等效替换等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。