一种Fe3O4固载Ru(bpy)32+检测刀豆凝集素A的电化学发光传感器

摘要

本发明涉及一种Fe3O4固载Ru(bpy)32+检测刀豆凝集素A的电化学发光传感器。在本发明中，采用水/油微乳液制备片层的壳聚糖/Ru(bpy)32+/二氧化硅包裹Fe3O4纳米材料作为发光材料，该材料具有稳定且高效的光学性能，有利于制备稳定的电化学发光传感器。为了灵敏地检测刀豆凝集素A，葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍‑羧基化石墨烯作为猝灭剂，用于降低发光材料的电化学发光强度。刀豆凝集素A可以特异性识别葡萄糖，基于此，不同浓度的刀豆凝集素A可以结合不同量的葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍‑羧基化石墨烯，使得该传感器电化学发光强度变化不同。本发明对刀豆凝集素A检测的线性范围为0.5 pg/mL‑100 ng/mL，检测限为0.18 pg/mL。

说明书

技术领域

本发明涉及一种Fe₃O₄固载Ru(bpy)₃²⁺检测刀豆凝集素A的电化学发光传感器。具体是采用Fe₃O₄固载Ru(bpy)₃²⁺作为发光材料，葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯为猝灭剂，制备一种检测刀豆凝集素A电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术

刀豆凝集素A是一种从刀豆中提取的豆类蛋白。当pH低于5.5时，刀豆凝集素A以二聚体的形式存在；当pH在5.8到7.0之间时，刀豆凝集素A以四聚体的形式存在；在中性条件下，刀豆凝集素A的亚基具有四个结合位点。刀豆凝集素A可以特异性识别多种糖类，如甘露糖、葡萄糖、糖蛋白等。基于此，刀豆凝集素A可以作为蛋白模型用于分子识别或生物过程的研究，这对于临床诊断和药物的发展是非常重要的，例如肿瘤细胞和白血病的检测等。并且，刀豆凝集素A可以通过特异性识别细胞膜表面糖蛋白的葡萄糖官能团，使得成熟的T细胞进行增殖和活化。因此，为了研究糖类-蛋白的结合，刀豆凝集素A作为靶标，设计一种灵敏的方法检测刀豆凝集素A是非常重要的。

目前检测刀豆凝集素A的方法主要有荧光、表面等离子共振、电化学、紫外可见等。与这些方法相比，电化学发光具有电化学和化学发光两种方法的优势，例如灵敏度高、检测限低和容易控制等。电化学发光是在电极表面直接氧化产生的电活性物质经历电子转移反应形成激发态后激发态能量以光的形式释放出来。因此，本发明设计了一种猝灭型的电化学发光分析方法用于检测刀豆凝集素A。

在本发明中，首次采用水/油微乳液制备片层的壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料作为发光材料。经过对现有文献的对比，Dang课题组公开了一种电化学发光传感器的制备方法，采用水/油微乳液制备球形的壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅纳米材料（Anal.>3²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料的电化学发光强度。刀豆凝集素A可以特异性识别葡萄糖，基于此，不同浓度的刀豆凝集素A可以结合不同量的葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯，从而，引起壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料电化学发光强度的变化。因此，本发明设计的生物传感器不仅可以灵敏检测刀豆凝集素A，也为其他分析物的检测提供了一种新方法。目前基于四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯猝灭Ru(bpy)₃²⁺检测刀豆凝集素A的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是制备磁性纳米材料Fe₃O₄固载的Ru(bpy)₃²⁺，增强发光体在电极表面的电化学发光性能，提高传感器的灵敏度。

本发明目的之二是通过水热方法制备四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯，通过NiCo₂S₄与Ru(bpy)₃²⁺之间的电荷转移，实现电化学发光的猝灭。

本发明目的之三是通过共价交联的方法将葡萄糖固定在四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯表面，基于刀豆凝集素A对糖类的特异性识别，实现生物传感器的制备，达到对刀豆凝集素A检测的目的。

本发明的技术方案如下：

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1. 一种Fe₃O₄固载Ru(bpy)₃²⁺检测刀豆凝集素A的电化学发光传感器，制备步骤如下：

（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；

（2）将6 µL 0.5～5 mg/mL壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料的壳聚糖溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；

（3）滴涂5 μL体积分数为0.5%的戊二醛溶液于玻碳电极表面，室温保存至干燥，超纯水清洗；

（4）将10 μL不同浓度的刀豆凝集素A滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）滴涂3 μL质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）将6 µL 1～7 mg/mL葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯溶液滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测刀豆凝集素A的电化学发光生物传感器，将其保存在4 ℃冰箱中。

2. 本发明所述的一种Fe₃O₄固载Ru(bpy)₃²⁺检测刀豆凝集素A的电化学发光传感器，所述壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料的壳聚糖溶液，制备步骤如下：

将1.77 mL乳化剂TX-100、7.5 mL环己烷和1.8 mL正丁醇混合之后，加入1 mL 50 mg/mL Fe₃O₄水溶液，搅拌1>3²⁺和1>3²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料，并将其分散在质量分数为0.5%的壳聚糖溶液中；

所述质量分数为0.5%的壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1%的乙酸中，搅拌2 h制得。

3. 本发明所述的一种Fe₃O₄固载Ru(bpy)₃²⁺检测刀豆凝集素A的电化学发光传感器，所述葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯，制备步骤如下：

（1）四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯的制备

将0.0747 g乙酸钴和0.0373 g乙酸镍分散在30 mL含50 mg羧基化氧化石墨烯的乙二醇中，80 ℃下搅拌2 h之后，将0.0685 g硫脲加入到上述溶液中，转移至反应釜，200℃下反应6 h，离心、洗涤、干燥得到四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯；

（2）葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯的制备

将40 mg四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯分散在10 mL 100 mg/mL N,N'-羰基二咪唑水溶液中，室温下搅拌12 h，加入100 mg葡萄糖，继续反应12 h，离心、洗涤，即可得葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯。

4. 本发明所述的制备方法制备的Fe₃O₄固载Ru(bpy)₃²⁺构建电化学发光传感器，用于刀豆凝集素A的检测，步骤如下：

（1）将参比电极-Ag/AgCl电极、对电极-铂丝电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为750 V，扫描电压设置为-1.8～0 V；

（2）使用含20 mmol/L～120 mmol/L过硫酸钾和0.1 mol/L氯化钾的PBS缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的刀豆凝集素A产生的电化学发光信号强度；

所述PBS缓冲溶液，其pH=6.5～8.5，是用1/15 mol/L Na₂HPO₄和1/15>2PO₄配制；

（3）根据所得的电化学发光强度值与刀豆凝集素A浓度的线性关系，绘制工作曲线。

本发明的有益成果

（1）采用水/油乳液方法制备Fe₃O₄固载Ru(bpy)₃²⁺得到壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料，不仅可以使Ru(bpy)₃²⁺在电极表面可以稳定存在，还可以通过Fe₃O₄的导电性增加混合材料的导电性，使得发光材料的电化学发光强度增加。

（2）制备的壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料具有片状结构，具有较大的比表面积，通过戊二醛活化混合材料中壳聚糖上的氨基，可以结合大量的刀豆凝集素A，放大葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯的猝灭效率。

（3）本发明制备的电化学发光传感器用于刀豆凝集素A的检测，发光物质用量少，响应时间短，可以实现简单、快速和高灵敏检测。本发明对刀豆凝集素A检测的线性范围为0.5 pg/mL-100 ng/mL，检测限为0.18 pg/mL。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1制备壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料壳聚糖溶液

将1.77 mL 乳化剂TX-100、7.5 mL环己烷和1.8 mL正丁醇混合之后，加入1 mL 50 mg/mL Fe₃O₄水溶液，搅拌1>3²⁺和1>3²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料，并将其分散在0.5%壳聚糖溶液中；

所述0.5%壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1%的乙酸中，搅拌2h制得。

实施例2 制备壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料的壳聚糖溶液

将1.77 mL乳化剂TX-100、7.5 mL环己烷和1.8 mL正丁醇混合之后，加入1 mL 50 mg/mL Fe₃O₄水溶液，搅拌1>3²⁺和1>3²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料，并将其分散在0.5%壳聚糖溶液中；

所述0.5%壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1%的乙酸中，搅拌2h制得。

实施例3制备壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料壳聚糖溶液

将1.77 mL乳化剂TX-100、7.5 mL环己烷和1.8 mL正丁醇混合之后，加入1 mL 50 mg/mL Fe₃O₄水溶液，搅拌1>3²⁺和1>3²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料，并将其分散在0.5%壳聚糖溶液中；

所述0.5%壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1%的乙酸中，搅拌2h制得。

实施例4 制备萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯

（1）四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯的制备

将0.0747 g乙酸钴和0.0373 g乙酸镍分散在30 mL含50 mg羧基化氧化石墨烯的乙二醇中，80 ℃下搅拌2 h之后，将0.0685 g硫脲加入到上述溶液中，转移至反应釜，200℃下反应6 h，离心、洗涤、干燥得到四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯；

（2）葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯的制备

将40 mg四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯分散在10 mL 100 mg/mL N,N'-羰基二咪唑水溶液中，室温下搅拌12 h，加入100 mg葡萄糖，继续反应12 h，离心、洗涤，即可得葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯。

实施例5制备刀豆凝集素A生物电化学发光传感器

（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；

（2）将6 µL 1mg/mL壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料的壳聚糖溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；

（3）滴涂5 μL体积分数为0.5%戊二醛溶液于玻碳电极表面，室温保存至干燥，超纯水清洗；

（4）将10 μL不同浓度的刀豆凝集素A滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）滴涂3 μL质量分数为1%牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）将6 µL 2 mg/mL葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯溶液滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测刀豆凝集素A的电化学发光生物传感器，将其保存在4 ℃冰箱中。

实施例6制备刀豆凝集素A生物电化学发光传感器

（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；

（2）将6 µL 3 mg/mL壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料的壳聚糖溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；

（3）滴涂5 μL体积分数为0.5%戊二醛溶液于玻碳电极表面，室温保存至干燥，超纯水清洗；

（4）将10 μL不同浓度的刀豆凝集素A滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）滴涂3 μL质量分数为1%牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）将6 µL 3 mg/mL葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯溶液滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测刀豆凝集素A的电化学发光生物传感器，将其保存在4 ℃冰箱中。

实施例7制备刀豆凝集素A生物电化学发光传感器

（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；

（2）将6 µL 5 mg/mL壳聚糖/Ru(bpy)₃²⁺/二氧化硅包裹Fe₃O₄纳米材料的壳聚糖溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；

（3）滴涂5 μL体积分数为0.5%戊二醛溶液于玻碳电极表面，室温保存至干燥，超纯水清洗；

（4）将10 μL不同浓度的刀豆凝集素A滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）滴涂3 μL质量分数为1%牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）将6 µL 7 mg/mL葡萄糖功能化的四硫化二钴合镍-羧基化石墨烯溶液滴涂在电极表面，4 ℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测刀豆凝集素A的电化学发光生物传感器，将其保存在4 ℃冰箱中。

实施例8刀豆凝集素A的检测方法

（1）将参比电极-Ag/AgCl电极、对电极-铂丝电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为750 V，扫描电压设置为-1.8～0 V；

（2）使用含100 mmol/L过硫酸钾和0.1 mol/L氯化钾的PBS缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的刀豆凝集素A产生的电化学发光信号强度；

所述PBS缓冲溶液，其pH=8.0，是用1/15 mol/L Na₂HPO₄和1/15>2PO₄配制；

（3）根据所得的电化学发光强度值与刀豆凝集素A浓度的线性关系，绘制工作曲线。

实施例9牛血清白蛋白（BSA）中刀豆凝集素A的检测

（1）牛血清白蛋白1 mL 0.1 mg/mL，向其加入不同浓度的刀豆凝集素A，采用标准加入法测定样品中刀豆凝集素A的平均回收率，结果见表1。

表1样品中刀豆凝集素A的检测结果

表1检测结果可以看出，样品BSA中刀豆凝集素A检测结果的回收率为95.0～105 %，表明本发明可以应用于实际生物样品的检测，方法的精密度高，结果准确可靠。