一种测定降纤药物在人体内最大耐受剂量的方法

摘要

本发明提供一种测定降纤药物在人体内最大耐受剂量的方法，其特征是采用降纤药效曲线法，在人体内注入降纤药物后，立刻监测纤维蛋白原的动态变化，并绘制降纤药效曲线。在低剂量组中，由于没有激活人体内纤维蛋白原的快速合成，降纤药效的持续时间长达48小时，给药后的第10天纤维蛋白原恢复到基线水平。随着给药剂量的不断增加，如果给药剂量过大，会激活人体内纤维蛋白原的快速合成，导致降纤药效的持续时间缩短为12小时。那么，没有激活人体内纤维蛋白原快速合成的最大剂量就是人体的最大耐受剂量。确定该剂量的意义是可以防止给药剂量过大，激活了人体内纤维蛋白原的快速合成，导致降纤药效的持续时间明显缩短，降纤药效显著降低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定降纤药物在人体内最大耐受剂量的方法，特别是采用降纤药效曲线法测定蚓激酶和类凝血酶等降纤药物在人体内最大耐受量的方法。

背景技术

蚓激酶注射剂是由北京儒展生化药物研究中心研制的降纤药物。蚓激酶是以赤子爱蚯蚓(Eisenia Foetide Sarigny)为原料、经分离提取得到的分子量为10000～60000的一组溶栓酶的总称。蚓激酶具有小剂量降纤和大剂量溶栓的作用，并可经肠道吸收入血，水解纤维蛋白原，成为防治缺血性脑血管病中血液流变学异常的药物。然而口服蚓激酶制剂用量大，吸收缓慢，起效慢，不适于脑梗塞急性期的治疗。为提高蚓激酶的生物利用度和临床疗效，以赤子爱胜蚓为原料，制得的蚓激酶注射剂，分子量在10000～30000之间，且分离提取工艺简单、先进、适合工业化生产、成品质量稳定。为此，本发明人在获得两项蚓激酶工艺发明专利证书(CN1089369C/CN1128220C)的基础上，又申请了本发明专利和《测定蚓激酶注射剂中高分子蛋白和小分子杂质含量的方法》(专利申请号：201610230792.0)。

蚓激酶注射剂系由蚓激酶胶囊改变给药途径且尚未在国内外上市销售的制剂，符合《药品注册管理办法》中化学药品注册分类2的有关要求。本单位在国家食品药品监督管理局获得了注射用蚓激酶(批件号为2003L01103)和蚓激酶注射液(2005L01954)两项药物临床研究批件。为此，根据药品注册管理办法，必须进行I期临床的耐受性研究，确定人体内最大耐受剂量，为II、III期临床研究的提供依据。

注射用降纤酶、巴曲酶注射液和安克洛酶均为20世纪80年代和90年代研制的降纤药物，由于研发的年代较早，要求不高，没有进行I期临床耐受性研究。

由于蕲蛇酶和蚓激酶口服胶囊的纯度较差，以过敏反应等安全性指标，就可以确定人体的最大耐受剂量。但在给药6小时之后，没有按照规定继续进行纤维蛋白原的监测，故无法确定采用过敏反应等安全性指标确定的最大耐受剂量，是否已经激活人体内纤维蛋白原的快速合成。

由于本单位研发的注射用蚓激酶和蚓激酶注射液纯度高，注射用蚓激酶在单次给药2万单位～8万单位(共24人)后均未发生过敏等不良反应，故未能确定人体内最大耐受剂量。而在给药4.5小时之后，又没有按照规定继续进行纤维蛋白原的监测，故无法采用降纤药效曲线法确定不能激活人体内纤维蛋白原快速合成的最大剂量。

为此，四川大学华西医院开展蚓激酶注射液在健康人体中I期的耐受性临床试验时，根据蚓激酶注射液具有降解纤维蛋白原的特性，以及美国国立卫生研究院癌症研究所(NCI)发表的常见不良反应判定标准(CTCAE)V 3.0：不仅将用药后纤维蛋白原处于1.0～1.5g/L之间定义为低纤维蛋白原血症，该剂量组半数受试者出现低纤维蛋白原血症则终止试验；而且纤维蛋白原＜1.0g/L或较基线下降50～75％判定为重度低纤维蛋白原血症，该组中出现该种情况即终止试验。

华西医院的研究结果表明：以低纤维蛋白原血症为指标，确定蚓激酶注射液的人体最大耐受量为2.5万单位。存在的问题之一是，虽然其结论是正确的，但确定的人体最大耐受剂量，会随着受试者给药前纤维蛋白原含量(基线)的提高而变大，不能体现药物本身的特性。因为，血浆纤维蛋白原浓度的正常范围为2.0～4.0g/L。如果健康志愿者给药前纤维蛋白原浓度在2.0g/L附近，给药后非常容易发生低纤维蛋白原血症。如果健康志愿者给药前纤维蛋白原浓度在4.0g/L附近，给药后就不易发生低纤维蛋白原血症。如果采用高纤维蛋白原血症患者(＞4.0g/L)，给药后就更不易发生低纤维蛋白原血症，测定蚓激酶注射液的最大耐受剂量，就不可能再是2.5万单位。

存在的问题之二是，低纤维蛋白原血症的观察指标仅仅考虑了纤维蛋白原降低后的水平和百分比，没有考虑纤维蛋白原降低后的持续时间，这显然是不合理的。

值得赞赏的是，四川大学华西医院在进行蚓激酶注射液健康志愿者的耐受性研究时，按照规定对给药前和给药后纤维蛋白原的动态变化进行了全面准确地监测。

本发明人在此基础上，首先将蚓激酶注射液降解纤维蛋白原的动态监测数据，绘制成降纤药效曲线，进而采用人体内负反馈系统对降纤药效曲线表现的结果进行了阐述，最后发明了降纤药效曲线法测定降纤药物在人体内最大耐受剂量的方法。

降纤药效曲线法测定降纤药物在人体内最大耐受剂量的方法，其特征包括：向人体内注入降纤药物时，如果药物过量，会激活负反馈控制系统中纤维蛋白原的快速合成。负反馈控制系统的调定点为给药前纤维蛋白原的基线浓度。具体的说，(1)在人体内注入较低剂量的降纤药物时，纤维蛋白原的含量会逐渐降低，降纤药效的持续时间长达48小时，并需要再经过8天的时间，纤维蛋白原的含量才会缓慢恢复到基线水平，达到防止出血的目的。(2)随着给药剂量的不断增大，在人体内继续注入降纤药物时，降纤药物过量不仅会激活负反馈控制系统中维蛋白原的快速合成，使降纤药效的持续时间缩短为12小时，而且仅仅再经12小时纤维蛋白原的含量便快速地恢复到基线水平，达到防止出血的目的。这表明：降纤药物过量，人体内的纤维蛋白原的含量是受负反馈控制系统控制的。那么，不能激活人体内纤维蛋白原快速合成的最大剂量，就是降纤药物在人体内的最大耐受剂量。这就是本发明的核心创新点之一。

本发明的创新点之二是降纤药效的观察指标不仅考虑了纤维蛋白原降低后的水平和百分比，而且还考虑了降纤药效的持续时间，也就是用降纤药效曲线下降的面积来表示。

本发明的创新点之三是确定人体最大耐受剂量的指标不仅仅包括安全性指标，也应该包括有效性指标。这才能保证了药品的安全性和有效性。

本发明人采用人体内负反馈控制系统对已经获得的降纤药效曲线进行了透彻诠释，并进一步将其创造成为一种测定降纤药物在人体内最大耐受剂量的方法。该方法确定的人体最大耐受量仅与给药剂量直接相关，与给药前纤维蛋白原的含量无关，可以体现药物本身的特性。这就对降纤药物测定人体内最大耐受剂量的方法提出了新的要求，创造了世界行业的新标准。目的是同时采用安全性和有效性指标，保证最大耐受剂量的安全性和有效性。

本发明应用于注射用蚓激酶和蚓激酶注射液等降纤药物，不仅可以保证人体最大耐受剂量下的安全性，而且可以避免降纤药物过量，激活人体内纤维蛋白原的快速合成，导致降纤药效明显降低的后果，具有非常重要的临床意义。

本发明应用于注射用降纤酶、巴曲酶注射液、蕲蛇酶注射液和安克洛酶等类凝血酶类降纤药物，为测定人体内最大耐受剂量提供了科学严谨的方法，目的是真正为患者和企业负责。

发明内容

本发明提供一种测定降纤药物在人体内最大耐受剂量的方法，其特征是采用降纤药效曲线法，在人体内注入降纤药物后，立刻监测纤维蛋白原的动态变化，并绘制降纤药效曲线。在低剂量组中，由于没有激活人体内纤维蛋白原的快速合成，降纤药效的持续时间长达48小时，给药后的第10天纤维蛋白原恢复到基线水平。随着给药剂量的不断增加，如果给药剂量过大，会激活人体内纤维蛋白原的快速合成，导致降纤药效的持续时间缩短为12小时。那么，没有激活人体内纤维蛋白原快速合成的最大剂量就是人体的最大耐受剂量。

测定纤维蛋白原的一般方法包括双缩尿比色法，热沉淀比浊法，凝固法，凝血酶原时间法和双抗体夹心ELISA法等。本发明优选采用凝固法。根据CFDA核准的《纤维蛋白原测定试剂(凝固法)说明书》，血液标本采集后必须尽快完成纤维蛋白原的检测，避免温度和时间的干扰。否则纤维蛋白原的测定结果既不能用于人体最大耐受剂量的确定，也不能用于安全性和有效性的评价。

本发明所述的注射剂的剂型包括药物制成的注入人体体内的灭菌溶液、乳状液和混悬液以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末，例如注射用浓溶液、溶液型注射剂、注射用无菌粉末、混悬型注射剂和乳悬型注射剂。

本发明所述的蚓激酶是由双胸蚓、赤子爱胜蚓、广地龙、锯齿远蚓和威廉腔环蚓等各种蚯蚓中提取分离的总蚓激酶、分子量不同的单一组分的蚓激酶和分子量不同范围的多组分的蚓激酶。类凝血酶是由不同种类的蛇的毒液中分离出的蛋白水解酶，如巴曲酶、蕲蛇酶、降纤酶和安克洛酶。

蚯蚓在中药中称为地龙，其蛋白提取物(蚓激酶)同时具有纤溶酶原激活活性和纤维蛋白溶解活性。因此，注射用蚓激酶也可以被称作蚯蚓纤溶酶冻干粉针和注射用地龙冻干粉针，三者实际上是同一物质(例如CN1128220C/CN1520829A/CN1537938A/CN101407801B)。

本发明所述的人体包括但不局限于健康志愿者、高纤维蛋白原血症患者、脑梗塞患者和肿瘤患者。注入降纤药物的方法包括但不局限于静脉滴注，静脉推注、动脉灌注和皮下注射。

作为本发明一个具体实施方案，本发明提供了一种测定蚓激酶注射液在人体内最大耐受剂量的方法。

其方法和步骤如下：

1.研究对象 年龄18～40岁，男女各半；按体重指数＝体重(kg)/身高²(m²)计算，在19～24范围内，且各组受试者的体重指数差异应无统计学意义；全面健康体检合格，血尿常规、肝肾功能、凝血功能、乙肝标志物和12导联心电图检查正常；自愿受试并签署知情同意书。

2.受试者健康检查内容 详细询问健康史、患病史、用药史、过敏史、月经史、家族史、外伤史、溃疡病出血史、痔疮史及自发性出血(包括刷牙出血)等现象。一般体格检查：身高、体重、呼吸、血压、脉搏、胸腹部检查等。实验室检查：血尿常规、大便隐血、血生化检查(ALT、AST、BUN、Cr、总胆红素、间接胆红素)、心电图、乙肝二对半。特殊检查：凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)。

3.受试药物 蚓激酶注射液，由北京儒展生化药物研究中心和亚宝药业太原制药有限公司研制并提供，经药品检验合格。批号：20080101，规格为1ml：5万蚓激酶单位。置于4℃冰箱内保存，有效期：1.5年。本制剂一次溶于250ml生理盐水，静脉点滴1小时。

4.剂量设计 根据注射用蚓激酶的文献报道，其有效剂量在2万单位和8万单位之间，故蚓激酶注射液分为2.5万单位、5.0万单位和7.5万单位，三个剂量组。每组受试者人数均为4人。从低剂量组开始，按剂量递增顺序逐组进行试验；每例受试者仅用药一次，仅参加一个剂量组的试验，不得在同一受试者进行剂量递增的多个剂量组的耐受性试验；在前一剂量组试验结束，临床与实验室检查均未发现有临床意义的不良反应后，方可进入下一剂量组试验。

5.降纤药效曲线的绘制 对各剂量组纤维蛋白原的测定结果进行列表，并将0-48小时的时间作为横坐标，将纤维蛋白原的平均值作为纵坐标，绘制降纤药效曲线。

6.人体最大耐受性剂量的确定 对降纤药效曲线进行比较分析，如果某一剂量的降纤药效曲线快速回升，降纤药效持续时间由48小时明显缩短为12小时，表示该剂量已经过量，激活了人体内纤维蛋白原的快速合成，不能耐受。下降一个剂量，降纤药效持续时间长达48小时，这个没有激活人体内纤维蛋白原快速合成的最大剂量，就是人体最大耐受剂量。

7.观察指标包括症状、体征以及体温、脉搏、呼吸、血压等生命体征。于给药前、给药结束后1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h及48h进行观察，并详细记录。

8.实验室及辅助检查 包括血、尿常规、肝肾功能检查、凝血功能及12导联心电图检查。2.5万单位剂量组的采血点为给药前，给药结束后1h、2h、3h、4h、8h和48h；5万单位剂量组的采血点被调整为给药前，给药结束后1h、3h、6h、8h、12h、24h和48h；采血于试管中，立即进行出凝血指标的动态监测，包括：凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白原(FIB)。

9.统计学分析 进行人口统计学和其他基线特征及安全性分析。描述性统计分析，定性指标以频数表，百分率或构成比描述；定量指标以均数，标准差，或最大值、最小值、中位数描述。

10.研究场所 试验在四川大学华西医院国家药物临床试验机构I期病房进行。

11.伦理学原则 试验方案已获得四川大学华西医院医学伦理委员会批准。受试者均签署了知情同意书。

本发明提供的确定降纤药物在人体内的最大耐受剂量的方法，具有新颖性和创造性、适用、重复性强、科学和严谨等特点，重要的是，该方法可以突出地体现：降纤药物过量会激活人体内负反馈控制系统中纤维蛋白原的快速合成，导致降纤药效明显降低的后果，具有非常重要的临床意义。

附图说明

图1、2.5万单位蚓激酶单次给药后(4人)血浆中降纤药效曲线

图2、5.0万单位蚓激酶单次给药后(4人)血浆中降纤药效曲线

具体实施方式

一、试验材料与仪器

全自动凝血分析仪(STA-R Evolution，STAGO公司)；

80-2型离心机，上海手术器械厂生产。

凝血酶原时间(PT)测定试剂盒，批号：105027，ISI值：1.0。活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(白陶土)，批号：111007。纤维蛋白原(FIB)含量测定试剂盒(凝固法)，批号：1320051。上述试剂盒均购自上海太阳生物技术有限公司。

二、测定结果

实施例1 对各组受试者一般资料进行列表，并按照统计分析的方法，对受试者的一般资料进行分析。分析结果见表1。

表1 受试者一般情况

试验结果表明：所有受试者年龄21～29(25.2±2.6)岁，身高158～173(164.0±5.2)cm，体重50.0～64.0(55.9±5.2)kg，体重指数20.0～22.0(20.9±0.95)。其中2.5万单位组平均年龄23.8±2.8岁，身高167.5±3.8cm，体重59.4±3.7kg，体重指数21.5±0.5。5万单位组平均年龄26.5±2.3岁，身高160.5±6.5cm，体重52.5±6.7kg，体重指数20.4±1.4。所有受试者均无重要的既往病史和药物过敏史，均符合纳入标准。

实施例2 对各组受试者用药前观察指标进行列表，并按照统计分析的方法，对受试者的用药前观察指标进行分析。分析结果见表2。

表2 受试者筛选时实验室检查结果

试验结果表明：用药前体检、实验室检查、心电图检查均未见有临床意义的异常。

实施例3 对各组受试者用药前和用药后的生命体征进行列表，并按照统计分析的方法，对受试者的用药前和用药后的生命体征进行分析。分析结果见表3和表4。

表3 受试者用药前生命体征

表4 受试者用药后生命体征(48h)

试验结果表明：单次静脉滴注蚓激酶注射液2.5万单位和5万单位后各个监测时间点，所有受试者血压、心率、呼吸和体温均在正常范围内。

实施例4 对各组受试者凝血酶原时间(PT)用药前后变化情况进行列表，并按照统计分析的方法，对受试者凝血酶原时间(PT)用药前后变化情况进行分析。分析结果见表5和表6。

表5 2.5万单位组4例受试者凝血酶原时间(PT)用药前后变化情况

表6 5万单位组4例受试者凝血酶原时间(PT)用药前后变化情况

试验结果表明：所有受试者的凝血酶原时间(PT)用药前后无明显变化。

实施例5 对各组受试者活化部分凝血酶原时间(APPT)用药前后变化情况进行列表，并按照统计分析的方法，对受试者活化部分凝血酶原时间(APPT)用药前后变化情况进行分析。分析结果见表7和表8。

表7 2.5万单位组4例受试者活化部分凝血酶原时间(APPT)用药前后变化情况

表8 5万单位组4例受试者活化部分凝血酶原时间(APPT)用药前后变化情况

试验结果表明：所有受试者的活化部分凝血酶原时间(APPT)用药前后无明显变化。

实施例6 对各组受试者纤维蛋白原(FIB)用药前后变化情况进行列表，并按照统计分析的方法，对受试者纤维蛋白原(FIB)用药前后变化情况进行分析。分析结果见表9和表10。

表9 2.5万IU组4例受试者纤维蛋白原(FIB)用药前后变化情况

表10 5万IU组后4例受试者纤维蛋白原(FIB)用药前后变化情况

试验结果表明：(1)在2.5万单位的条件下，受试者用药后均未发生出血、过敏、血压下降、呼吸频率增加和低纤维蛋白原血症等与药物相关的不良反应。(2)用药剂量由2.5万单位增加到5万单位，纤维蛋白原降低最大平均绝对值由0.71g/L增加到0.99g/L，故用药剂量与纤维蛋白原降低的最大绝对值呈正相关。(3)根据纤维蛋白原＜1.0g/L或较基线下降50～75％判定为重度低纤维蛋白原血症，该组中出现该种情况即终止试验的规定。5万单位剂量组中，B1的纤维蛋白原较基线下降54.6％判定为重度低纤维蛋白原血症，故终止试验。

实施例7 人体内最大耐受剂量的确定

以0-48小时的时间作为横坐标，分别将2.5万单位(4人)和5.0万单位(4人)纤维蛋白原的平均值作为纵坐标，绘制降纤药效曲线，结果详见图1和图2。

图1表明：在2.5万单位的降纤药效曲线中，降纤药效的持续时间长达48小时，于停药后第10天纤维蛋白原恢复到基线。图2表明：在5万单位的降纤药效曲线中，降纤药效曲线快速回升，降纤药效持续时间缩短为12小时，再经12小时纤维蛋白原便可恢复到基线，这表明：5万单位已经过量，并激活了人体内纤维蛋白原的快速合成，不能耐受，导致了降纤药效的明显降低。因此，没有激活人体内纤维蛋白原快速合成的最大剂量，也就是2.5万单位为人体的最大耐受剂量。

总之，蚓激酶注射液的人体最大耐受剂量为2.5万单位。在该剂量下，不仅受试者用药后不会发生出血、过敏、血压下降、呼吸频率增加和低纤维蛋白原血症等与药物相关的不良反应，而且不会激活人体内纤维蛋白原的快速合成，导致了降纤药效的明显降低。