用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的核酸、试剂盒及方法

摘要

本发明公开了本发明提供了一组用于快速检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的核酸，同时建立了一种比较高效、灵敏的AGTR1基因的A1166C多态性位点的检测试剂盒及快速检测方法。其检测试剂盒，使用方便，操作简便，自动化程度高，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度的特点。提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

原发性高血压(Essential Hypertension，EH)是危害人类健康的最常见疾病之一，是遗传和环境因素相互作用的多基因疾病。大量研究发现肾素-血管紧张素系统(Rennin-Angiotensin System，RAS)在EH的发生发展中起到了重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngiotenssinⅡ，AngⅡ)是RAS系统中最主要的缩血管活性物质，它可以作用于外周血管，使静脉收缩，回心血量增加，最终导致高血压的发生。AngⅡ有两个最主要受体亚型，血管紧张素Ⅱ受体亚型1和亚型2(AngiotensinⅡType 1/2Receptor，AGTR1/AGTR2)。而AngⅡ的大部分生物作用，大多是通过与AGTR1结合后产生生物效应。

AGTR1主要分布在血管平滑肌上，AngⅡ与其结合使小动脉平滑肌收缩，外周阻力增加；醛固酮分泌增加，肾纳重吸收作用增强，导致水纳潴留。AGTR1基因位于3q22区，长60kb，包括4个外显子和3个内含子，为单拷贝基因。目前至少发现AGTR1有50个多态性位点，其中与临床较为密切的变异是，AGTR1基因3’端非编码区A1155C多态性位点，从而表现出AA、AC及CC 3种基因型，该位点虽不影响基因的开放阅读框架，但可以参与转录和翻译的调控，从而影响机体水钠平衡代谢、醛固酮的分泌和血管收缩。

沙坦类药物是临床广泛应用的一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，主要通过阻断AngⅡ与AGTR1受体结合产生降压作用。不仅能阻断ACE途径产生的血管紧张素Ⅱ，还可以阻断其他途径产生的血管紧张素Ⅱ，并且能够长效的阻断，从而达到更强更持久的降压，是临床医生为原发性高血压病人的一线用药。然而，沙坦类药物的药效受多种因素影响，其中，遗传因素是重要的因素。有关AGTR1基因多态性药物遗传学方面的研究很多，主要是针对A1166C多态性。研究发现AGTR1的A1166C位点多态性与坎地沙坦疗效有关，携带C等位基因的高血压病人应用坎地沙坦降压效率更好。另外有报道称患者服用缬沙坦后，携带AC基因型降压疗效优于AA基因型。也有研究发现携带AA基因型的患者服用替米沙坦治疗3个月后，血压下降值明显大于AC+CC基因型的患者。因此研究AGTR1的A1166C位点多态性对沙坦类药物的用药指导具有重大的临床意义。

目前，检测基因多态性和基因突变的方法主要有Sanger测序法；基因芯片杂交法，PCR-RFLP法和Taqman探针法等。Sanger测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但仪器昂贵，灵敏度低，操作复杂，周期长，容易污染；普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，存在由PCR产物污染导致假阳性的风险；基因芯片技术具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。这些缺点限制了这三种方法在实际临床工作中的发展和应用，无法满足快速指导临床评估要求。因此，一种快速、准确且低成本的新型检测方法成为了临床检查的迫切需求。

发明内容

为克服现有检测技术的不足，本发明的目的是提供一组用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的核酸。本发明的另一个目的是提供一种用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的核酸，该核酸包括野生型上游引物、突变型上游引物和公用下游引物，其中，所述野生型上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述突变型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述公用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

如上所述的核酸，优选地，所述核酸还包括内部质控，其包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

如上所述的核酸，优选地，所述核酸还包括野生型阳性对照物、突变型阳性对照物、和/或作为所述内部质控的质控阳性对照物，其中，所述野生型阳性对照物含有如SEQID No.8所示的核苷酸序列，所述突变型阳性对照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，所述质控阳性对照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

一种用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的试剂盒，该试剂盒包括：

野生型上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

突变型上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

公用下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

公用检测探针：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括：作为内部质控的质控引物对、质控探针和质控阳性对照物，其中，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团，所述质控阳性对照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX、中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、矿物油、阴性对照物：无核酸酶水。

一种快速检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA，同时进行野生型反应体系和突变型反应体系的实时荧光PCR扩增；其中，在所述野生型反应体系中检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；在所述突变型反应体系中检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

(3)数据采集和分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，通过实时荧光PCR仪收集信号，计算所述野生型反应体系和突变型反应体系的△Ct值来确定所述样品DNA的基因型。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述野生型反应体系和所述突变型反应体系中还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在所述野生型反应体系和所述突变型反应体系中，各条引物和各条探针的终浓度均为100-1000nmol/L；所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

如上所述的方法，优选地，步骤(2)中，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：

第一阶段：95℃4min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第二阶段：95℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环；

信号收集：第三阶段72℃时收集荧光信号。如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在所述野生型反应体系和所述突变型反应体系中，所述野生型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述突变型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述公用检测探针的终浓度为200nmol/L，所述内部质控的引物对均为150nmol/L，所述质控探针的终浓度为120nmol/L；所述公用检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，所述质控探针的5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1。

如上所述的方法，优选地，在所述步骤(3)中，所述内部质控的JOE信号应达到设定阈值Ct值小于25，再确定所述样本DNA的基因型；否则应重新进行检测；

确定所述样品DNA的基因型，按照以下公式进行计算：

-2.5≤ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值≤2.5，判定为杂合型样本；

ΔCt＝突变型Ct值-野生型Ct值＞2.5，判定为野生型样本；

ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值＞2.5，判定为突变型样本。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列为模板，进行所述野生型反应体系和突变型反应体系的实时荧光PCR扩增；所述阴性对照为以无核酸酶水为模板，进行所述野生型反应体系和突变型反应体系的实时荧光PCR扩增。

本发明提供了一组用于快速检测AGTR1基因的A1166C位点多态性的核酸，同时建立了一种比较高效、灵敏的AGTR1基因的A1166C多态性位点的检测试剂盒及快速检测方法。其检测试剂盒，使用方便，操作简便，自动化程度高，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度的特点。提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

本发明提供的检测试剂盒及方法，用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点时，为了避免漏检、及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，设有内部质控，为了判断检测体系是否正常，还设有阴性对照和检测引物的阳性对照；为了避免假阴性及漏检，设有野生型、突变型和内部质控的阳性对照，其阳性对照检测呈阳性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检，如阳性对照检测呈阴性结果，说明检测体系有问题，或试剂已经失效，应重新配置体系进行检测；为了避免假阳性及漏检，设有阴性对照，其阴性对照检测呈阴性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阳性结果及漏检，如阴性对照检测呈阳性结果，说明检测体系有问题，已被污染，应重新配置体系进行检测；本发明提供检测试剂盒及方法设计严谨，有效避免漏检、错检的可能。

与现有技术相比，本发明运用ARMS引物配合荧光探针区分AGTR1基因的A1166C位点上野生型与突变型的特异位点，还有如下有益效果和显著进步：

(1)操作性：操作简便，一步加样，无需将样本与酶混合，减少了样本的污染，避免了气溶胶污染引起的假阳性，同时检测时间只需要90分钟。

(2)灵敏度高：该试剂盒可对10copies/μL基因稳定性检出，检测结果可信。

(3)特异性强：对于高至3×10⁴copies/μL及以上的基因组DNA不会出现非特异的结果。可以减少稀释样本的过程，提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现非特异性。

(4)成本低：ARMS分型法相对于Taqman探针分型法，不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性，而且能节约成本，ARMS引物合成快速简单，合成成本低，扩增效果更佳。

(5)应用范围广：本发明不仅能检测常规的EDTA抗凝血的全血细胞DNA，还能检测提取质量差的口腔拭子，还可以直接检测全血细胞裂解红细胞后的白细胞，检测结果准确度高。

附图说明

图1为本发明优选地试剂盒中野生型体系检测灵敏度的扩增曲线。

图2为本发明优选地试剂盒中突变型体系检测灵敏度的扩增曲线。

图3为本发明优选地试剂盒中野生型体系检测精密度的扩增曲线。

图4为本发明优选地试剂盒中突变型体系检测精密度的扩增曲线。

图5为本发明优选地试剂盒中野生型体系检测特异性的扩增曲线。

图6为本发明优选地试剂盒中突变型体系检测特异性的扩增曲线。

图7为本发明优选地试剂盒中检测样本305的扩增曲线。

图8为本发明优选地试剂盒中检测样本323的扩增曲线。

图9为本发明优选地试剂盒中检测样本354的扩增曲线。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1引物、探针、验证模板设计

本发明所选的ARMS引物是针对A1166C SNP位点设计。所选的ARMS引物是从一段序列在3’末端及其附近人为的加入错配的突变位点的一套引物组合中，通过筛选出能够区分单个位点等位基因的引物，保证了高度的特异性。

经过试验验证，最终确定检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的特异性检测引物包括野生型上游引物(AGRT1-FW)、突变型上游引物(AGRT1-FM)、公用下游引物(AGTR1-R)和公用检测探针(AGTR1-P)，核苷酸序列如下：

AGRT1-FW(SEQ ID No.1):

5’-GCAGCACTTCACTACCAAATGAGTA-3’；

AGTR1-FM(SEQ ID No.2):

5’-GCAGCACTTCACTACCAAATGAGTC-3’；

AGTR1-R(SEQ ID No.3):

5’-AAAATGTGGCTTTGCTTTGTCTT-3’；

AGTR1-P(SEQ ID No.4):

5’-AATTGAAGGAGAAAATGCAT-3’。

野生型上游引物与公共下游引物扩增的PCR产物可作为野生型阳性模板，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的序列，而包含如SEQ ID No.8所示的序列即可作为野生型阳性对照物；突变型上游引物与公共下游引物扩增的PCR产物可作为突变型阳性模板，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的序列，而包含如SEQ ID No.9所示的序列即可作为突变型阳性对照物，序列如下：

SEQ ID No.8：

5’-GCAGCACTTCACTACCAAATGAGCATTAGCTACTTTTCAGAATTGAAGGAGAAAATGCATTATGTGGACTGAACCGACTTTTCTAAAGCTCTGAACAAAAGCTTTTCTTTCCTTTTGCAACAAGACAAAGCAAAGCCACATTTT-3’；

SEQ ID No.9：

5’-GCAGCACTTCACTACCAAATGAGCCTTAGCTACTTTTCAGAATTGAAGGAGAAAATGCATTATGTGGACTGAACCGACTTTTCTAAAGCTCTGAACAAAAGCTTTTCTTTCCTTTTGCAACAAGACAAAGCAAAGCCACATTTT-3’

进一步，为了对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行内部质控，同时检测样本的质量，避免漏加检测样本，本发明选用的内部质控是管家基因GAPDH(NC_000012.12)，管家基因高度保守并且持续表达，在实验中有利于除去不同标本在产量及质量等上的差别，能够对实验结果进行校正和标准化。因此GAPDH基因作为人类基因组的保守基因，不仅可以作为试剂盒内部的质控，还可作为样本DNA的质控。通过对内部质控的质控引物对、质控探针的筛选和体系优化，建立了实时荧光PCR内部质控检测体系，优选地，质控引物对(GAPDH-F、GAPDH-R)、质控探针(GAPDH-P)如下：

GAPDH-F(SEQ ID No.5)：5’-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3’；

GAPDH-R(SEQ ID No.6)：5’-GCCCCAGCGTCAAAGGT-3’；

GAPDH-P(SEQ ID No.7)：

5’-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCA-3’。

作为内部质控的质控引物对进行PCR扩增时，其扩增序列的大小为83bp，将扩增序列作为内部质控阳性对照物，即包含如SEQ ID No.10所示序列，作为验证是否漏加检测样品的质控阳性对照物，SEQ ID No.10：

5’-GGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGC-3’。

实施例2采用实时荧光PCR检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的方法

根据实施例1筛选设计的野生型上游引物、突变型上游引物、公用下游引物和公用检测探针进行合成，可在公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，其中，荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

应用本发明设计的野生型引物对、突变型引物对及公用检测探针，对检测样品的DNA模板，进行AGTR1基因的A1166C多态性位点的实时荧光PCR扩增检测，采用野生型反应体系和突变型反应体系，均用40μL反应体系如表1所示；

表1PCR反应液配置

应用Fast master premix预混在反应体系中，一步加样，无需将样本与酶混合，减少了酶与样本混合的步骤，减少了样本的污染，操作更简单。

实时荧光PCR扩增反应条件，优选为95℃预变性4min；95℃5s，58℃30s，10cycles；95℃30s，58℃30s，72℃30s，30cycles；72℃时收集荧光信号。

结果分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，再根据荧光定量PCR仪器，得到样本的突变型Ct值和野生型Ct值，通过差值判断检测样品的基因型。

将AGTR1基因的A1166C多态性位点的野生型阳性对照物和突变型阳性对照物进行上述实时荧光PCR扩增反应时，结果显示，所设计的检测引物及反应体系可有效扩增出AGTR1基因的A1166C多态性位点的野生型和突变型。

对样品进行检测时，避免漏检，如避免有的反应孔中未加检测样本的情况出现，在每个反应孔中设置有内部质控，应当注意的是公用检测探针与质控探针荧光基团标记为不同检测模式的荧光基团。具体的实时荧光PCR扩增反应体系组成按表1配置。对于人血液样品或咽拭子样品的DNA检测时，质控探针的信号有明显的扩增曲线。

其中，在探针合成时，探针与荧光和淬灭基团相连，公用检测探针的荧光-淬灭基团为优选为FAM-MGB，质控探针的荧光-淬灭基团优选为JOE-BHQ1，当然，其它荧光-淬灭基团组合也同样适用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，检测时选择相应的荧光检测模式。上述实时荧光PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

实施例3用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的试剂盒

用于快速检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的实时荧光PCR试剂盒包括以下成分：

野生型上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

突变型上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

公用下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

公用检测探针：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

为了避免漏检，错检，还包括：作为内部质控的质控引物对、质控探针和质控阳性对照物，

其中，质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团，质控阳性对照物含有如SEQ IDNo.10所示的核苷酸序列。

为了防止反应体系在PCR扩增过程中挥发，影响检测效果，试剂盒还包括有矿物油。

为了便于反应体系的配置，试剂盒还包括10×PCR缓冲液；Fast Advanced MasterMix，阴性对照物：无核酸酶水。其中Fast Advanced Master Mix，可采用ABI(美国应用生物系统公司)；10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，也可应用市场上其他公司的缓冲液与DNA聚合酶。

实施例4检测试剂盒的制备

本实施例的试剂盒是在实施例3的基础上，制备成可以直接加入检测样品后，进行检测的试剂盒。该试剂盒有AGTR1 8联PCR反应条以及AGTR1阳性对照物组成，各成分如表2所示，反应液的配置见表3。每条AGTR1 8联PCR反应条的奇数管(1/3/5/7或A/C/E/G)对应检测体系为A1反应液，检测AGTR1A1166C野生型；偶数管(2/4/6/8或B/D/F/H)对应的检测体系为A2反应液，检测AGTR1A1166C突变型。每管主要成分为特异性引物、荧光探针和PCR反应液等，其中公共检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，则检测样品信号类型为FAM信号和内部质控的质控探针5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1，内部质控为JOE信号(内控作为对试剂盒、DNA质量以及操作本身的质控)；检测引物、公用检测探针、阳性对照物可委托上海英俊生物技术有限公司合成。

表2试剂盒组成

表3各PCR反应液配置

在本实施例中AB premix全称Fast Advanced Master Mix，购自ABI(美国应用生物系统公司)；10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。

实施例5：检测实施例4中制备的试剂盒的灵敏度、精密度和特异性

(1)灵敏度实验

将南京金斯瑞公司合成含有AGTR1基因A1166C野生型基因序列(含SEQ ID NO.8)质粒DNA干粉、A1166C突变型基因序列(含SEQ ID NO.9)质粒DNA干粉和内控GAPDH基因序列(含SEQ ID NO.10)的质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，PH8.0)复溶，定量后稀释配置成参考品，具体配置方法如表4所示。用表4中配置的参考品AGW-3、AGM-3和AGWM-3作为模板，进行检测实时荧光PCR程序采用实施例2中优选地程序进行，检测结果如图1和图2所示，灵敏度检出率100％。因此本发明的荧光PCR方法灵敏度高，两个体系能够检出对应基因型的10copies/μL浓度。

表4AGTR1(A1166C)的参考品

(2)精密度

用表4参考品的AGWM-2检测实施例4中试剂盒的精密度，AW野生型体系和AM突变型体系均起线，结果如图3和图4所示，两个体系所对应的Ct值的变异系数CV≤5％。因此本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定，CV<5％)。

(3)特异性

用上述表4配置的参考品AGW-1、AGM-1和AGWM-1检测实施例4中试剂盒的特异性，检测结果表明，纯野生参考品符合率100％，纯突变参考品符合率100％，纯杂合参考品符合率100％。因此本发明的荧光PCR方法特异性强，三种3×10⁴copies/μl浓度参考品用实施例4中制备的试剂盒都可检出，具体结果见图5、图6。

实施例6：用本发明制备的试剂盒检测AGTR1的A1166C多态性

本实施例是从武汉海吉力生物科技有限公司收集的46例EDTA抗凝血中提取DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。提取DNA的主要操作步骤参考天根(QIAGEN)公司的血液基因组DNA提取试剂盒，提取样本基因组DNA。提取的基因组DNA经紫外分光光度计计算其纯度和浓度定量，本实施例中将46例DNA样本稀释到2ng/μL。

检测方法如下：

(1)将46例基因组DNA样本稀释至2ng/μL置于冰上待用；

(2)从试剂盒中取出阳性对照物及阴性对照物，解冻后震荡混匀，离心30s，置于冰上待用。将实施例4中制备的8联PCR反应条取出解冻后离心30s，防止反应液在开盖时溅出。

(4)将阴性对照、待测样本、阳性对照分别加入AW反应液和AM反应液中，每孔10μL。

(5)将以上8联PCR反应条盖好管盖于离心机上离心30S，确保管壁上不沾有液滴后，将8联PCR反应条放于实时PCR仪器中。

(7)PCR反应程序：95℃预变性4min；95℃5s，58℃30s，10cycles；95℃30s，58℃30s，72℃30s，30cycles，72℃时收集FAM和JOE信号。

(8)结果分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，再根据荧光定量PCR仪器，得到样本的突变型Ct值和野生型Ct值。按照以下公式进行计算：

-2.5≤ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值≤2.5，判定为杂合型样本；

ΔCt＝突变型Ct值-野生型Ct值＞2.5，判定为野生型样本；

ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值＞2.5，判定为突变型样本。

利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测体系是否正常，样本是否漏加及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值(Ct值小于25)；FAM是检测信号，用于检测样本的基因多态性；在内控信号达到要求后，突变型和野生型FAM信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值作为判断标准。样本检测结果判定见表5。

表5AGTR1基因A1166C位点检测结果判定

利用本发明方法对46例样本基因组DNA检测，其检测结果如下表6，样本的扩增曲线图此处不再全部例出，仅例出具有代表性的三个样品的扩增曲线图，具体如图7、图8、图9所示。同时将46例样本基因组DNA采用Sanger金标准(南京金斯瑞公司测序)进行测序检测，将两者的检测能力进行比较，结果见表7。

表6. 46例样本基因组DNA的AGTR1A1166C多态性检测结果

表7本发明检测结果和sanger测序金标准比较

其中：

①本检测方法的检测特异性定义为阴性符合率。本检测将AGTR1AA基因型的检出定义为阴性结果，本检测方法检测出的阴性结果与“金标准”Sanger测序法的结果相符，本方法的特异性为100％；

②本检测方法的检测灵敏度定义为阳性符合率。本检测将AGTR1AC和AGTR1CC基因型定义为阳性结果，检出的阳性结果与“金标准”Sanger测序结果相符，本方法的灵敏度为100％；

③本检测方法的准确度定义为不同方法检测结果的一致性。46例样本经本发明检测的检测结果和“金标准”Sanger测序法显示的结果相符。本检测方法的准确度为100％；

④本方法重复性好，多次重复结果一致；

⑤本方法操作简便，一步加样，无需将样本与酶混合，临床样本检测仅需90分钟。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉海吉力生物科技有限公司

<120> 用于检测ATGR1基因的A1166C多态性位点的核酸、试剂盒及方法

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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