奥昔卡因在制备药物中的用途及药物组合物

摘要

本发明提出了奥昔卡因或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途及一种用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物。所述药物或药物组合物可有效抑制乙型肝炎病毒颗粒的组装，可有效用于治疗或者预防乙型肝炎病毒的感染。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及奥昔卡因在制备药物中的用途及药物组合物，更具体地，本发明涉及奥昔卡因或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途及一种用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是世界上最为普遍的慢性病毒性感染。HBV主要通过血液传播、性行为传播、母婴传播等途径传播。乙肝病毒感染为世界顶级的健康问题，在全世界导致每年有768000人死亡,是世界第十大致死原因。

而目前治疗乙肝病毒感染的药物应用于临床的只有两种干扰素，分为干扰素(IFN)和聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)两种形式，先后于1990和2005年被FDA批准；和五种核苷类似物的病毒聚合酶抑制剂药物，即拉米夫定(Lamivudine,3TC或LMV)，阿德福韦(Adefovir,ADV)，恩替卡韦(Entecavir,ETV)，替比夫定(Telbivudine,LdT)和替诺福韦(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)。但是干扰素仅对不到40％的病人有效，并且还有较强副作用；而聚合酶抑制剂不能清除cccDNA，停药后病毒复制会迅速反弹，并且长期服用还会使病毒发生变异而产生抗药性。

因此，筛选新的抗乙型肝炎病毒感染的药物显的尤为迫切和重要。

奥昔卡因(Oxethazaine)在临床上一直是作为一个有效的局部麻醉剂使用，同时奥昔卡因还可以控制由多种肠胃失调，例如食道炎，慢性胃炎和消化性溃疡导致的疼痛和抑制胃酸的分泌。

然而，奥昔卡因的用途还有待进一步开发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本申请是基于发明人对以下事实的发现和认识而作出的：

奥昔卡因可以明显抑制HBeAg(分泌型的e抗原)的分泌，并对肝细胞内HBV病毒总DNA都有明显的抑制作用，同时，奥昔卡因还可以显著抑制HBV病毒颗粒的组装。这说明奥昔卡因是以病毒颗粒组装为靶标，影响肝细胞内的病毒颗粒的组装，进而抑制病毒在细胞内的复制。

为此，本发明提出了奥昔卡因在制备以HBV病毒颗粒的组装为靶标的、抗乙型肝炎病毒感染的药物中的新用途。

在本发明的第一方面，本发明提出了奥昔卡因或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抑制乙型肝炎病毒颗粒组装；或治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。根据本发明的实施例，奥昔卡因或药学上可接受的盐可显著抑制HBV的核衣壳组装和肝细胞内HBV病毒总DNA，因此，本发明所提出的奥昔卡因或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物可显著抑制乙型肝炎病毒颗粒组装；或显著治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。

根据本发明的实施例，上述奥昔卡因或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防人类乙型肝炎病毒感染。在本发明的一些实施例中，发明人发现，奥昔卡因或其药学上可接受的盐可显著抑制人肝癌细胞系HepAD38细胞中HBV的核衣壳组装和细胞上清和细胞内HBV病毒总DNA。因此，本发明所提出的奥昔卡因或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防人类乙型肝炎病毒感染的效果进一步提高。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：奥昔卡因或其药学上可接受的盐作为活性成分。根据本发明的实施例，奥昔卡因显著抑制HBV的核衣壳组装和肝细胞内HBV病毒总DNA，以奥昔卡因或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物可以显著抑制HBV病毒颗粒的组装为靶点，有效用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。

根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括药学上可接受的载体。根据本发明的实施例，药学上可接受的载体可提高所述药物组合物的稳定性和有效成分的可利用度，从而进一步提高了所述药物组合物对乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括第二药剂，所述第二药剂不同于奥昔卡因或其药学上可接受的盐并且用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。根据本发明的实施例，所述第二药剂与奥昔卡因或其药学上可接受的盐联用进一步提高了所述药物组合物对乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防。

根据本发明的实施例，所述第二药剂包括选自下列的至少一种：干扰素(IFN)、聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)、拉米夫定(Lamivudine,3TC或LMV)、阿德福韦(Adefovir,ADV)、恩替卡韦(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine,LdT)、替诺福韦(Tenofovir disoproxilfumarate,TDF)。拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦是HBV病毒聚合酶抑制剂药物。奥昔卡因或其药学上可接受的盐的抑制HBV病毒感染的靶点不同于上述第二药剂，奥昔卡因或其药学上可接受的盐以核衣壳组装为靶点，不存在使病毒产生抗药性突变的风险，能持续有效地达到清除乙型肝炎病毒的目的。根据本发明的实施例，上述第二药剂的至少之一与奥昔卡因或其药学上可接受的盐联用，所述药物组合物的对乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防的效果更加显著。

根据本发明的实施例，所述药物组合物呈片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸、缓释制剂、控释制剂或纳米制剂。各种剂型的药物组合物以可以预期的给药方式给药，抑制HBV病毒颗粒的组装，从而进一步有效治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。

根据本发明的实施例，所述药物组合物用于治疗或者预防人类乙型肝炎病毒感染。在本发明的一些实施例中，发明人发现，奥昔卡因可显著抑制人肝癌细胞系HepAD38细胞中HBV的核衣壳组装和细胞上清和细胞内HBV病毒总DNA，所述药物组合物用于治疗或者预防人类乙型肝炎病毒感染效果更加显著。

根据本发明的一些实施例，以奥昔卡因或其药学上可接受的盐为活性成分的药物组合物可以包括药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液或糖浆。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊、长效制剂、缓释制剂、控释制剂或纳米制剂。

其中，根据本发明的一些具体示例，适合药物配方的载体中赋形剂和稀释液的可以包括：乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡胶，藻酸盐，凝胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟苯丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。

根据本发明的另一些实施例，本发明的药物组合物中还可以包括填充剂，抗凝血剂，润滑剂，保湿剂，芳香剂和防腐剂。

根据本发明的实施例，本发明的以奥昔卡因或其药学可接受的盐为活性成分的药物组合物在无细胞毒性的浓度下，能显著地抑制乙型肝炎病毒颗粒的组装，从而可以在治疗或预防乙型肝炎病毒感染时被给药。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的药物或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在乙型肝炎病毒感染治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物组合物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指乙型肝炎病毒感染)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防乙型肝炎病毒感染)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述以奥昔卡因或其药学上可接受的盐为活性成分的药物组合物给予有需要的个体。

根据本发明的实施例，本发明的奥昔卡因药物或药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的奥昔卡因药物或药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含本发明的奥昔卡因、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。

根据本发明的实施例，对于人体，0.2-0.4mg/kg奥昔卡因的治疗剂量下，持续服药并未发现造成毒性反应，50kg的成人口服投放20mg的奥昔卡因，经一小时后血浆中奥昔卡因的最高浓度约为20μg/mL(约40μM)，远高于奥昔卡因的有效浓度，奥昔卡因的生物利用度高，毒性小，代谢途径明确。

根据本发明的实施例，本发明奥昔卡因可接受的盐形式都是有用的。术语“药学上可接受的盐”是指那些盐形式对于制药化学家而言是显而易见的，即它们基本上无毒并能提供所需的药代动力学性质、适口性、吸收、分布、代谢或排泄。

附图说明

图1是根据本发明实施例1的奥昔卡因(Oxethazaine)抗HBV活性检测结果图，

其中，图1A是奥昔卡因的结构图，

图1B是奥昔卡因处理3天对HepAD38细胞的细胞毒性，

图1C是奥昔卡因可以剂量依赖的抑制细胞上清中的HBeAg的结果图，

图1D是奥昔卡因可以剂量依赖的抑制细胞上清HBV总DNA的实时定量PCR的结果，

图1E是奥昔卡因可以剂量依赖的抑制细胞内HBV总DNA的实时定量PCR的结果，

图1F是奥昔卡因可以剂量依赖的抑制细胞内的HBV总DNA的Southern blot结果图；

图2是根据本发明实施例2的奥昔卡因不影响CMV启动子控制下的蛋白表达的结果图；

图3是根据本发明实施例2的奥昔卡因可以有效下调胞内的HBV总DNA的含量的结果图，

其中，图3A显示了奥昔卡因处理6天对HepAD38细胞的细胞毒性，

图3B显示了奥昔卡因对胞内的cccDNA的影响，

图3C显示了奥昔卡因对胞内HBV总DNA的影响；

图4是根据本发明实施例2的奥昔卡因对于HBV的precore mRNA，pgRNA和HBV总RNA的含量没有显著影响的结果图；

图5是根据本发明实施例2的奥昔卡因对HBV的核衣壳组装和核衣壳内的HBV DNA均有显著的剂量依赖的抑制效果的结果图；以及

图6是根据本发明实施例3的对核苷类似物类药物抗药性HBV突变株的抗病毒效果的结果图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例详细描述本发明的实施例，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1奥昔卡因抗HBV活性的评价

1.实验材料

1.1细胞和药物

HepAD38细胞系：人肝癌稳定转染细胞系，其染色体中整合有HBV基因组，可支持HBV DNA合成和蛋白表达，可产生感染性病毒粒子。在这个细胞系中病毒的复制是由四环素调控的CMV启动子控制的。

奥昔卡因购自Sigma公司，拉米夫定(3TC)为NIH馈赠。

1.2试剂

DMEM/F12培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；HBV表面抗原(S抗原)和e抗原检测试剂盒购于上海科华生物科技有限公司；试剂购自Invitrogen公司；iTaq Universal SYBR Green supermix试剂购自Bio-rad公司；DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit II购自Roche公司。

2.实验方法与结果

2.1奥昔卡因(Oxethazaine)的细胞毒性检测

1)将HepAD38细胞按8000细胞/孔(100μL)接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养，细胞贴壁后备用。

2)加药处理细胞：用细胞培养液(DMEM/F12+10％胎牛血清)将药物以2倍梯度稀释6-10个梯度，每梯度3个复孔。将100μL含有药物的细胞培养液加入到步骤(1)中的细胞中，37℃细胞培养箱中继续培养72h后以备检测。

3)弃去含有药物的细胞培养物上清，每孔加入含10％试剂的培养液100μL，37℃培养箱中孵育1h-4h后，用全波段酶标仪检测540nm波长处吸光值，校正波长为620nm，并计算各浓度细胞存活率，或检测荧光值(激发光波长：540nm。发射光波长：595nm)用以计算细胞存活率。

结果如图1B所示。

图1B结果显示：奥昔卡因处理3天对HepAD38细胞的CC₅₀(半数细胞毒性浓度)为54.7微摩尔/升。

2.2奥昔卡因(Oxethazaine)抗HBV活性检测

1)将HepAD38细胞按8000细胞/孔(100μL)接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养，细胞贴壁后备用。

2)加药处理细胞：用细胞培养液(DMEM/F12+10％胎牛血清)将药物以2倍梯度稀释，每梯度3个复孔，将100微升含有药物的细胞培养液加入到步骤(1)中的细胞中，37℃细胞培养箱中继续培养72h以备检测。

3)分别收集细胞上清和细胞，用ELISA检测试剂盒检测细胞上清中的HBeAg(分泌型e抗原)和HBsAg(表面抗原)的含量。

4)另外分别提取步骤(3)中收集的细胞上清和细胞内的HBV总DNA，用实时定量PCR的方法检测细胞上清和细胞内的HBV总DNA。

实时定量PCR所用引物如SEQ ID NO：1～4所示：

引物(HBV S144-正向引物):5’-TCACCAACCTCTTGTCCT-3’(SEQ ID NO：1)。

引物(HBV S144-反向引物):5’-GACAAACGGGCAACATACCT-3’(SEQ ID NO：2)。

引物(GAPDH正向引物)：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：3)。

引物(GAPDH反向引物)：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

同时，提取细胞内的HBV总DNA，用Southern blot的方法检测细胞内的HBV总DNA，实验步骤如下：

1)将HepAD38细胞2×10⁵细胞/孔接种于6孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养，细胞贴壁后备用。

2)加药处理细胞：用细胞培养液(DMEM/F12+10％胎牛血清)将药物以2倍梯度稀释。将含有药物的培养基加入到细胞中，继续培养细胞72h后以备检测。

3)收集细胞，裂解细胞并提取细胞内的HBV总DNA，用Southern blot的方法检测细胞内的HBV总DNA。

结果如图1C～1F所示。其中，图中的3TC表示加入拉米夫定药物组，C为空白对照组，即未加药组，RC表示松弛环状部分双链DNA，SS表示单链DNA。结果显示：奥昔卡因可以剂量依赖的抑制细胞上清中的HBeAg，其EC₅₀(半数效应浓度)约为10微摩尔/升，而对HBsAg无作用(如图1C所示)；实时定量PCR的结果显示奥昔卡因可以剂量依赖的抑制细胞上清(如图1D所示)和细胞内(如图1E所示)的HBV总DNA，其EC₅₀分别为1.25微摩尔/升和2.5微摩尔/升,这个结果表明奥昔卡因对于胞内和胞外的HBV总DNA的抑制率是相当的，也就排除了是奥昔卡因抑制HBV病毒分泌的可能性；Southern>

实施例2奥昔卡因(Oxethazaine)直接作用于HBV核衣壳组装而发挥抗病毒作用

1.实验材料

1.1细胞、质粒和药物

HepAD38细胞系：人肝癌稳定转染细胞系，其染色体中整合有HBV基因组，可支持HBV DNA合成，蛋白表达，可产生感染性病毒粒子。在这个细胞系中病毒的复制是四环素调控的CMV启动子控制的。

Huh7为人源肝癌细胞，为武汉病毒研究所陈新文研究员惠赠。

pFlag-GAPDH为本实验室构建的CMV启动子控制下的表达融合Flag标签的GAPDH蛋白的质粒；

奥昔卡因购自Sigma公司，拉米夫定(3TC)为NIH馈赠。

1.2试剂

MEM和DMEM/F12培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；试剂和转染试剂Lipofectamine 2000均购自Invitrogen公司；iTaq Universal SYBR Green supermix试剂购自Bio-rad公司；抗HBV core蛋白的兔源多抗，抗flag的鼠源单抗和抗β-actin的鼠源单抗分别购自Dako公司，Sigma公司和中杉金桥公司；Trizol试剂购于Roche。

2.实验方法与结果

2.1奥昔卡因(Oxethazaine)对HepAD38细胞中乙型肝炎病毒的诱导复制起始作用的研究

1)将Huh7细胞按5×10⁴个/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h。

2)Huh7细胞瞬时转染CMV启动子控制的表达Flag-GAPDH的质粒pFlag-GAPDH，并加药处理培养细胞3天。

3)收集细胞，通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测带Flag标签的蛋白的表达情况，来检测奥昔卡因作用对于CMV启动子的活性的影响。

结果如图2所示。图2结果显示，和不加药组对照相比奥昔卡因并不影响带flag标签的GAPDH的蛋白表达量(内参蛋白β-actin的蛋白表达量仍保持恒定)。这也就表明奥昔卡因并不影响CMV启动子控制下的蛋白表达和其诱导下的HBV病毒复制起始。

2.2奥昔卡因(Oxethazaine)对HBV cccDNA的影响

1)在HepAD38细胞中，四环素诱导病毒复制起始后，撤掉四环素，在细胞核内逐渐形成稳定的cccDNA库，作为HBV源源不断复制的模板。

2)将上述诱导后的HepAD38细胞按4×10⁴细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h。

3)加药处理细胞：用DMEM/F12培养基将奥昔卡因稀释成各种浓度，每组3个重复，将不同剂量药物加入到细胞培养板中培养细胞，加药处理6天。

4)收集细胞，分别提取胞内的总的HBV DNA和cccDNA(闭合环状DNA)。其中，直接抽提胞内基因组DNA即可用于检测HBV总DNA；对于cccDNA的抽提，先是利用氯化钾高盐沉淀的方法除去大部分的细胞基因组DNA，再用PSAD酶(plasmid-safeATP-dependent DNase，购自Epicentre公司)(特异性降解闭合环状双链DNA之外的所有DNA)处理即可除去一条链不完整的HBV基因组DNA(环状松弛DNA，rcDNA)、单链的HBV DNA等HBV DNA复制中间产物，PSAD酶可以基本完全降解HBV总DNA中除cccDNA的成分，随后纯化后即可得到较为纯净的cccDNA。得到的总的HBV DNA和cccDNA样品用定量PCR的方法分析研究药物抗病毒活性并同时评价加药处理6d的细胞毒性情况。

实时定量PCR所用引物如SEQ ID NO：1～6所示：

引物(NCCC1)：5’-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT-3’(SEQ ID NO：5)。

引物(CCCAS2)：5’-GCCCCAAAGCCACCCAAG-3’(SEQ ID NO：6)。

引物(HBV S144-正向引物)：5’-ACTCACCAACCTCTTGTCCT-3’(SEQ ID NO：1)。

引物(HBV S144-反向引物)：5’-GACAAACGGGCAACATACCT-3’(SEQ ID NO：2)。

引物(GAPDH正向引物)：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：3)。

引物(GAPDH反向引物)：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

结果如图3所示。其中，图3A显示了加奥昔卡因处理6天对HepAD38细胞的细胞毒性情况；图3B显示：与未加药处理对照组相比奥昔卡因处理在接近最大无毒性浓度的10微摩尔/升时仍对cccDNA的水平没有明显影响，但是对于胞内HBV总DNA仍然有显著的剂量依赖的抑制效果(图3C)。其中，图中的3TC表示加入拉米夫定药物组，C为空白对照组，即未加药组。图3结果显示：奥昔卡因可以有效下调胞内的HBV总DNA的含量，但是对cccDNA的含量没有显著性影响。奥昔卡因的抗病毒效果不是通过影响HBV复制的模板cccDNA的含量来实现的。

2.3奥昔卡因(Oxethazaine)对乙型肝炎病毒RNA的作用的研究

1)将HepAD38细胞按4×10⁴细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h。

2)加药处理细胞：用DMEM/F12培养基将奥昔卡因稀释成各种浓度，每组3个重复，将不同剂量药物加入到细胞培养板中，加药处理细胞3天。

3)收集细胞提取RNA，用实时定量PCR定量分析药物对HBV各种RNA的作用。

实时定量PCR所用引物如SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：7～12所示：

引物(precoreRNA正向引物)：5'-TCTGCGCACCAGCACCATGCAAC-3'(SEQ ID NO：7)。

引物(precoreRNA反向引物)：5'-GCGAAGGAAAGAAGTCAGAAGGC-3'(SEQ IDNO：8)。

引物(pgRNA正向引物)：5'-CTGGGTGGGTGTTAATTTGG-3'(SEQ ID NO：9)。

引物(pgRNA反向引物)：5'-TAAGCTGGAGGAGTGCGAAT-3'(SEQ ID NO：10)。

引物(HBV总RNA正向引物)：5'-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3'(SEQ ID NO：11)。

引物(HBV总RNA反向引物)：5'-ACCAATTTATGCCTACAGCCTCC-3'(SEQ ID NO：12)。

引物(GAPDH RNA正向引物)：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：3)。

引物(GAPDH RNA反向引物)：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

实验结果如图4所示。其中，图中的3TC表示加入拉米夫定药物组，C空白对照组，即未加药组。图4显示：和不加药对照组相比，不同浓度的奥昔卡因对于HBV的precoremRNA，pgRNA和HBV总RNA的含量没有显著影响。这个结果也表明奥昔卡因的抗HBV的活性既不和特异性抑制HBV转录相关，也不和特异性降解HBV RNA相关。

综上所述，以上的结果显示：奥昔卡因的抗HBV的活性和抑制HBV病毒分泌、抑制HepAD38细胞中的CMV启动子转录、抑制cccDNA形成和降解、抑制HBV转录、特异性降解HBV RNA以及抑制HBV DNA合成均不相关。

2.4奥昔卡因(Oxethazaine)对乙型肝炎病毒核衣壳组装的作用的研究：

以上实施例的结果已经证明了奥昔卡因的抗病毒作用并不是发生在病毒复制周期的HBV cccDNA的合成和降解，病毒DNA合成，病毒RNA转录和病毒分泌等过程，发明人就将奥昔卡因发挥作用的阶段缩小到病毒组装这一过程中了。进而发明人探讨了奥昔卡因对HBV核衣壳组装的作用。实验过程如下：

1)将HepAD38细胞按2×10⁵细胞/孔接种于6孔细胞培养板板中，37℃细胞培养箱中培养过夜。

2)加药处理细胞72小时。

3)加入300微升温和细胞裂解液，室温裂解30min后收集裂解液到EP管中，并离心去除细胞碎片。裂解液样品用1％的琼脂糖凝胶电泳分成各种成分，随后用毛细管转移法转移到尼龙滤膜上，转膜缓冲液使用10×SSC，检测滤膜上的HBV核衣壳用抗HBV core的抗体(Dako)检测。检测完的滤膜用碱变性处理释放核衣壳内的病毒DNA，用Southernblot方法检测核衣壳内病毒DNA的水平。

另外用western blot的方法检测HBV核心蛋白(core protein，组成核衣壳外壳的蛋白)，检测的抗体抗HBV core的抗体(Dako)检测。

结果显示如图5所示。图5显示：奥昔卡因对HBV的核衣壳组装和核衣壳内的HBVDNA均有显著的剂量依赖的抑制效果。

实施例3奥昔卡因(Oxethazaine)对核苷类似物类药物抗药性HBV突变株的抗病毒效果

1.实验材料

1.1细胞、质粒和药物

Huh7为人源肝癌细胞；

质粒REZ31-9-1(59#)含有1.1倍野生型HBV基因组序列；阿德福韦(ADV)抗药性突变毒株表达质粒REZ36-10-1(61#)，其含有N236T突变的1.1倍HBV基因组序列；拉米夫定(3TC)和恩替卡韦(ETV)双抗药性突变毒株表达质粒REZ7-8-4(70#)，其含有L180M+M204V+S202G三突变的1.1倍HBV基因组序列。以上质粒均为武汉病毒研究所陈新文研究员惠赠。

奥昔卡因购自Sigma公司，拉米夫定(3TC)为NIH馈赠；阿德福韦(ADV)和恩替卡韦(ETV)均购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2试剂

DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II购自Roche公司。

2.实验方法与结果

本实施例中，发明人对奥昔卡因(Oxethazaine)对核苷类似物药物抗药性HBV突变株的复制情况的作用进行了研究，实验步骤如下：

1)将Huh7细胞按2×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h。

2)Huh7细胞分别瞬时转染了1.1倍HBV基因组的表达质粒(包括野生型WT、含有N236T突变的阿德福韦抗药性突变毒株、含有L180M+M204V+S202G三突变的拉米夫定和恩替卡韦双抗药性突变毒株)，转染后分别加入奥昔卡因(Oxethazaine)，拉米夫定(3TC)，阿德福韦(ADV)和恩替卡韦(ETV)处理，加药处理3天。

3)收集细胞，提取细胞内的HBV核衣壳内的DNA，用HBV DNA特异性的地高辛标记的探针，用Southern印迹杂交(Southern blot)的方法检测HBV核衣壳内DNA的水平。

结果如图6所示。其中，C空白对照组，即未加药组。图6显示：奥昔卡因可以显著抑制野生型和两种抗药性突变株的HBV DNA复制。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。