分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

摘要

本发明公开了一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用提纯的大麦黄矮病毒(BYDV)PAV株系病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗BYDV PAV的单抗杂交瘤细胞株24G4，其保藏号为CGMCC No.13298。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达到10

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)引起的小麦黄矮病(Wheat yellow dwarf disease)是小麦上重要的病毒病害之一。该病害最早由Oswald和Houston于1951年在美国加利福尼亚州的大麦上发现。目前，小麦黄矮病毒在世界各地均有分布。1960年，BYDVs首次出现在我国西北地区，受到BYDVs侵染的小麦一般减产40％，严重的可达70％以上，因此BYDVs又被称为“小麦癌症”、“黄色瘟疫”。自首次发现以来，小麦黄矮病在20世纪60-80年代又大规模爆发流行了数次，给我国小麦生产和粮食安全带来了重大威胁。

BYDVs在小麦秋苗期和春季返青后均可侵染植株，典型症状是新叶从叶尖开始发黄，植株变矮，叶片颜色为金黄色到鲜黄色，黄化部分约占全叶的1/3-1/2。秋苗期感病的植株矮化明显，分蘖减少，一般不能安全越冬。即使能越冬存活，一般也不能抽穗。穗期感病的植株一般只旗叶发黄，呈鲜黄色，植株矮化不明显，能抽穗，但千粒重减少，根系浅，易拔起。

BYDVs寄主范围较广，目前已知至少可以侵染150多种禾本科作物和杂草，其主要寄主作物既包括小麦、玉米和水稻世界三大粮食作物，也包括大麦、燕麦和黑麦等具有较高经济价值的粮食作物。虽然BYDVs寄主范围广泛，但都集中在单子叶植物范围内，在自然条件下尚未发现能够被BYDVs侵染的双子叶植物。根据寄主范围、对寄主的毒性、蚜虫传播特异性与反应类型等特点，Rochow 等将美国的BYDVs分为MAV、PAV、RPV、RMV和SGV 5个株系。在中国，周广和等筛选鉴定出了4个BYDVs株系，即PAV、RMV、GPV和GAV。BYDVs属黄症病毒科(Luteoviridae)，是一种+ss RNA病毒。病毒粒子由正单链RNA和外壳蛋白组成，呈正二十面体(T＝3)，无包膜。目前，根据国际病毒分类委员会关于病毒的分类，BYDVs分布于黄症病毒科(Luteoviridae)的2个属8个种，且还有2个种未被划分到属。在10个种中，BYDV PAV、BYDV PAS、BYDV MAV、BYDV ker II和BYDV ker III这5个种属于黄症病毒属(Luteovirus)；原RPV株系被升级为Cereal yellow dwarf virus-RPV(CYDV RPV)，并和CYDV RPS和MYDV RMV这2个种一起被划分到马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)中；另外，BYDV GPV和BYDV SGV两个种未归类。这些引起大麦黄矮病的各种病毒株系间的核酸同源性非常的低，其实是完全不同的病毒，由于命名的习惯现在还叫大麦黄矮病毒。

据统计，全世界至少有25种蚜虫可以传播BYDVs。而在中国，禾谷缢管蚜(R.padi)、麦长管蚜(S.avenae)、麦二叉蚜(S.graminum)和玉米蚜(R.maidis)是BYDVs的主要传播介体。BYDVs在蚜虫体内以循回型非增殖方式传播。

目前田间常常根据症状观察判断小麦黄矮病的发生情况，但相比真菌病害和细菌病害，病毒病的症状特点并不明显，常与其他病毒病害相混淆，出现错误判断的情况，而且通过症状并不能判断病毒具体是哪个株系。电镜观察需要昂贵的设备和专业人员，不适合基层应用。RT-PCR等分子生物学方法虽然灵敏度高，但往往受仪器的限制，仅适用于实验室少样品的检测。相比较而言，血清学方法简单易操作、快速、灵敏，成本较低，是目前植物病毒理想的检测手段，但血清学方法必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。因此，本发明专利主要针对大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用常 规杂交瘤技术制备了1株能分泌抗BYDV PAV单抗杂交瘤细胞24G4，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国大麦黄矮病毒PAV株系的检测、诊断和科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

分泌抗大麦黄矮病毒(BYDV)PAV株系单抗杂交瘤细胞株24G4，它能分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的特异性单抗,杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13298。

抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-9，抗体类型及亚类为IgG1、Kappa链，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染大麦黄矮病毒PAV株系的小麦病叶的灵敏度分别达到1:81>

抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体仅与大麦黄矮病毒PAV株系有特异性免疫反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。

抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体在大麦黄矮病毒PAV株系检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株24G4分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特 异、准确、灵敏地检测大麦黄矮病毒PAV株系；2)利用本发明所制备的单抗检测大麦黄矮病毒PAV株系，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单抗可有效地用于田间小麦样品中大麦黄矮病毒PAV株系的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测小麦BYDV PAV的灵敏度分析；

图2是dot-ELISA方法检测BYDV PAV的特异性分析：1列上下2个点为2个感染BYDV PAV的小麦样品，2列上下2个点为2个感染小麦黄花叶病毒的样品，3列上下2个点为2个感染中国小麦花叶病毒的样品，4列上下2个点为2个感染大麦黄矮病毒GAV株系的样品，5列上下2个点为2个感染大麦黄矮病毒GPV株系的样品，6列上下2个点为感染小麦矮缩病毒的样品，7列上下2个点为感染大麦黄花叶病毒的样品，8列上下2个点为健康小麦植物组织样品。

图3是dot-ELISA方法检测小麦田间样品中BYDV PAV的代表性结果。

生物保藏

杂交瘤细胞株24G4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日为2016年11月30日，保藏号为CGMCC No.13298。

具体实施方式

分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗的杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13298，它能分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体。

抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-9，抗体 类型及亚类为IgG1、Kappa链，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染大麦黄矮病毒PAV株系的小麦病叶的灵敏度分别达到1:81>

抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体仅与大麦黄矮病毒PAV株系有特异性免疫反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。

抗大麦黄矮病毒PAV株系的单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株24G4能大量分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的单抗，且其分泌的单抗效价高、特异性强、灵敏度高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测BYDV PAV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间BYDV PAV的检测，从而为我国大麦黄矮病毒PAV株系的检测、预警和科学防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

用下面的操作步骤提纯病毒粒子：

1)将大研钵和组织搅拌器预冷；

2)将500g感染BYDV PAV的小麦病叶于液氮中研磨成粉末；

3)加入含1％(v/v)巯基乙醇和2.5g崩溃酶的0.1M磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)1000mL，组织搅拌器中剧烈搅拌60s混匀。以后每隔15min，搅拌30s，匀浆3h以上；

4)加入Triton X-100至终浓度为0.5％(v/v)，室温搅拌30min；

5)4到6层纱布过滤，滤液体积1100mL，加入220mL氯仿:正戊醇(2:1,v/v)，4℃搅拌30min；

6)8 000rpm离心15min，取上清；

7)所得上清加入NaCl至终浓度为0.25M，然后缓慢加入PEG(分子量6000)至终溶度为10％(w/v,g/mL)，溶解后冰浴放置90-120min；

8)10 000rpm离心20min后弃上清，将沉淀用30mL 0.1M PB悬浮，4℃搅拌过夜；

9)5 000rpm离心10min后弃沉淀，上清加到50mL厚壁离心管的30％的蔗糖(溶于0.1M PB中)垫上，蔗糖垫体积15mL；

10)Beckman Ti55型转头44 000rpm超速离心2h；

11)弃上清，沉淀溶于1.5mL无菌水中，4℃搅拌悬浮过夜，悬浮液即为病毒提纯粒子；

12)用电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的大麦黄矮病毒粒子。

2.免疫动物

用提纯的BYDV PAV株系的病毒粒子免疫六周龄BALB/c雌性小鼠。即病毒粒子提纯液50μL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后经背腹部皮下多点注射0.1mL/只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.1mL/只，再过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5:1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1 500rpm离心5min去除培养基，用50％PEG(分 子量1 500)作为融合剂，在37℃水浴中加入1mL，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1 500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，并置于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第11天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10-40％时，以感染BYDVs PAV株系的小麦组织粗提液为抗原包被ELISA板，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获35个阳性孔。选择3个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗BYDV PAV特异性单抗的杂交瘤细胞株24G4。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.3mL降植烷(Sigma)，7-10d后腹腔注入6×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10d可见小鼠腹部明显膨大，针头采取腹水，3>

6.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM、κ、λ抗体进行DAS-ELISA分析，结果显示，24G4单抗亚类为IgG1、Kappa链，以提纯病毒为包被抗原用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果表>-9。

7.单克隆抗体的特异性检测

用感染小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系的病叶粗提液包被ELISA板，以小麦的健康叶片粗提液作阴性对照，以感染大麦黄矮病毒PAV株系的病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法测定单抗的特异性。ACP-ELISA方法的具体步骤为：上述病毒感染的病叶用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:30(w/v,g/mL)加入包被缓冲液继续研磨匀浆3min，5 000rpm离心3min后取上清，100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色，2M氢氧化钠终止反应后用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，24G4单抗只对BYDV>

二、检测BYDV PAV的免疫学方法及其试剂盒的建立

1.检测BYDV PAV的ACP-ELISA方法

1.1 ACP-ELISA方法的步骤：

1)植物组织称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:30比例(w/v,g/mL)加入0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)继续研磨匀浆3min，5 000rpm离心3min，上清100μL/孔加入ELISA板中，以BYDV PAV病叶为阳性对照，健康小麦叶为阴性对照，37℃2h或4℃过夜；

2)PBST洗涤3次后用3％脱脂奶粉封闭30min；

3)加入适当稀释后的单抗腹水，100μL/孔，37℃孵育1h；

4)PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，100μL/孔，37℃孵育1h；

5)用PBST洗涤后加入PNPP硝基磷酸盐底物100μL/孔，室温放置30min；

6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性；或用2M氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD₄₀₅，以P/N>2.1作为阳性判断标准。

1.2 ACP-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定

用常规方阵试验确定ACP-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度，即ELISA板横向加用封闭液倍比稀释的单抗，纵向加用封闭液倍比稀释AP标记的羊抗鼠IgG二抗进行ACP-ELISA。试验表明24G4单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5 000和1:8 000倍稀释，以抗体的最适工作浓度建立检测BYDV PAV的ACP-ELISA方法。对BYDV PAV病叶粗提液从1:160至655 360倍比稀释，分别以相应稀释度的小麦健叶粗提液作阴性对照，分析ACP-ELISA方法的检测灵敏度。结果表明ACP-ELISA方法对1:1:81 920倍稀释(w/v,g/mL)的病叶粗提液仍呈阳性反应，即对病叶的检测灵敏度可达到1:1:81 920倍稀释(w/v,g/mL)，表明ACP-ELISA方法具有很高的灵敏度。用建立的ACP-ELISA方法检测BYDV PAV、大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒和健康小麦植物组织，检测结果表明，建立的ACP-ELISA方法检测BYDV PAV呈强阳性反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均呈阴性反应，且阴阳性结果对比差异极显著，说明该方法的特异性很好。

2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

2.1 dot-ELISA方法检测植物中BYDV PAV的操作步骤

将小麦植物样品的叶片称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:30的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后研磨、匀浆3min；匀浆液5 000rpm离心3min；取2.5μL上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，同时设置健康和感染BYDV PAV的小麦叶片分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记的羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/L MgCl、pH9.5)中混匀，膜放入底物液中反应，显色10-20min，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显紫色，而阴性对照没有任何显色时，在自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

2.2 dot-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定

用常规方阵试验确定dot-ELISA方法中BYDV PAV的单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明24G4单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5 000和1:7 000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测BYDV PAV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当感染BYDV PAV小麦病叶稀释到1:1 280倍(w/v,g/mL)时，以24G4单抗建立的dot-ELISA方法检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:1 280倍稀释(w/v,g/mL)(图1)。特异性分析表明，该方法检测感染BYDV PAV的小麦病叶呈强阳性反应，而检测小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均呈阴性反应(图2)。

2.3 dot-ELISA方法的应用

用建立的dot-ELISA方法对2016年采自陕西省的田间疑似发病样品进行检测，结果发现，23个检测样品中有12个样品产生紫色的阳性斑点(图3)，样品同时用PCR方法进行分析，结果表明所有dot-ELISA检测到的阳性样品中均能扩增到BYDV PAV的特异性基因片段，而所有阴性样品中均未扩增到任何基因片段。PCR产物核酸测序表明dot-ELISA检测阳性样品确实感染BYDV PAV，说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物样品中大麦黄矮病毒PAV株系的检测。

3.大麦黄矮病毒PAV株系dot-ELISA检测试剂盒

1)试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2)检测植物样品检测的操作步骤：

a.将植物样品称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:20的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后继续研磨、匀浆3min；

b.匀浆液5 000rpm离心3min；

c.取3μL上清点到NC上，同时设置健康和感染BYDV PAV的小麦植物组织粗提液分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；

e.NC膜放入1:5 000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

f.用PBST洗膜3-4次，每次3min，然后将NC膜放入1:6 000倍稀释的AP酶标记的羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；

g.用PBST洗膜4-5次，每次3min，66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl₂，pH9.5)中并混匀，膜放入底物液中显色，肉眼观察结果；

h.待阳性对照显色明显紫色，而阴性对照没有任何显色时用自来水漂洗NC膜终止反应，拍照记录结果。

3)保存及有效期

于2-8℃避光保存，有效期12个月。

4)缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH7.4)：

加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1000mL

ELISA洗涤液(0.01M PBST)：

1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20

ELISA封闭液：

0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v)。