一种优化的pIFN‑γ肽链及在提高毕赤酵母分泌表达猪IFN‑γ产量和活性中的应用

摘要

本发明公开了一种优化的pIFN‑γ肽链及在提高毕赤酵母分泌表达猪IFN‑γ产量和活性中的应用。优化后的pIFN‑γ肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，将优化后的pIFN‑γ肽链整合到毕赤酵母中，可以大大提高毕赤酵母分泌表达猪IFN‑γ产量和活性。本发明提供的优化后的pIFN‑γ肽链对于推动pIFN‑γ在生猪养殖业中的应用是十分必要的。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种优化的pIFN-γ肽链及在提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性中的应用。

背景技术

猪伽马干扰素（porcine Interferon Gamma，pIFN-γ）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性和免疫调节功能的细胞因子。猪伽马干扰素属于Ⅱ型干扰素中的唯一成员，主要是由活化的T细胞和NK细胞产生的一种具有广谱抗病毒活性和免疫调节功能的细胞因子。猪伽马干扰素在生猪养殖中具有广阔的运用前景，在生猪养殖中可作为抗生素类替代药品、猪肿瘤性疾病的治疗及流行性疾病的防治等用途。

目前国内研究者构建的各类pIFN-γ表达菌株存在目的蛋白表达效率低下，采用分泌表达方式表达量一般为100～300 mg/L，采用胞内表达方式目的蛋白纯化成本高昂，产量一般占细胞总蛋白1/5～1/3；此外，表达的pIFN-γ还存在活性较低的问题，阻碍了pIFN-γ在生猪养殖中的进一步运用。为此，构建一种能够高效分泌表达具有高活性的pIFN-γ工程菌对于推动pIFN-γ在生猪养殖业中的应用是十分必要的。

目前，未见有关能够提高pIFN-γ分泌表达水平及其活性的改良氨基酸序列的报道。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种优化的pIFN-γ肽链，优化的pIFN-γ肽链能提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性。

本发明的另一个目的是提供一种优化的pIFN-γ肽链提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性的pIFN-γ肽链，pIFN-γ肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。优化的pIFN-γ肽链命名为pIFN-γ-C。

天然未经过改造的pIFN-γ肽链序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供的优化的pIFN-γ肽链是在天然pIFN-γ肽链序列第129和131位氨基酸残基由精氨酸（R）定向突变为组氨酸（H）得到的。

SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的pIFN-γ肽链在提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性中的应用。

一种提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性的方法，具体为将SEQ ID NO：1所示序列的pIFN-γ肽链整合到毕赤酵母中，得到的重组毕赤酵母分泌表达的猪IFN-γ的产量和活性大大提高。

一种提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性的方法，包括如下步骤：

将SEQ ID NO：1所示序列的pIFN-γ肽链对应的核苷酸片段插入质粒pPICZαA中，重组质粒转入毕赤酵母X33野生型感受态细胞，利用质粒上的抗性基因，通过高抗筛选得到具有目的基因高拷贝的毕赤酵母重组子，获得能高效分泌表达具有高活性pIFN-γ的毕赤酵母工程菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

将本发明提供的优化后的pIFN-γ肽链整合到毕赤酵母中，可以大大提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性，因此，本发明提供的优化后的pIFN-γ肽链对于推动pIFN-γ在生猪养殖业中的应用是十分必要的。

附图说明

图1为引入酶切位点的pIFN-γ-C基因高保真PCR扩增结果，图中M为DL 2000标准分子量Marker，泳道1为引入酶切位点的pIFN-γ（484bp）。

图2为菌落PCR筛选DH5α阳性转化子（阳性克隆约1000bp），图中M为DL 2000标准分子量Marker，阳性克隆长度约1000bp。

图3为质粒pPICZαA-pIFN-γ-C反向测序结果。

图4毕赤酵母转化子的高抗筛选结果，图中1为0.5 mg/mL Zeocin平板筛选结果，2为1 mg/mL Zeocin平板筛选结果，1和2中菌落为原位一一对应关系。

图5为诱导发酵上清SDS-PAGE电泳结果；1-4号泳道为抗1.0 mg/mL Zeocin的酵母转化菌株诱导表达发酵上清，第5号泳道为X33野生型诱导表达发酵上清，表达的pIFN-γ-C理论分子量为17.5 Kda。

图6为pIFN-γ-C蛋白的Western-blot鉴定结果；泳道1-8为抗1.0 mg/mL Zeocin的酵母转化菌株诱导表达发酵上清，M为Bio-Rad Dual Color标准分子量预染Marker，表达的pIFN-γ-C理论分子量为17.5 Kda。

图7为Ni-亲和层析纯化pIFN-γ-C结果；泳道1-8为Eltion buffer洗脱样品，表达的pIFN-γ理论分子量为17.5 Kda。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

天然未经过改造的pIFN-γ肽链序列如SEQ ID NO：2所示，本发明利用本领域常用的基因突变方法将天然pIFN-γ肽链序列第129和131位氨基酸残基由精氨酸（R）定向突变为组氨酸（H），得到SEQ ID NO：1所示的优化的pIFN-γ肽链。

（1）根据本发明提供的优化的pIFN-γ基因的核苷酸序列SEQ ID NO：1为表达基因，分泌表达pIFN-γ突变体。优化的pIFN-γ-C基因通过体外全基因合成得到。全基因合成得到的pIFN-γ序列高保真PCR结果如图1所示（目的产物上下游分别引入XhoⅠ与XbaⅠ酶切位点）。

（2）构建pIFN-γ毕赤酵母重组分泌表达载体：将毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA与上述步骤（1）中得到的pIFN-γ基因高保真PCR产物用XhoⅠ与XbaⅠ进行双酶切，用PCR纯化回收试剂盒和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对基因和质粒双酶切产物进行回收，将回收的基因与质粒用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建得到pIFN-γ重组毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA-pIFN-γ-C，保存载体的菌株命名为DH5α-pPICZαA-pIFN-γ-C。用质粒通用引物5’AOXⅠ、3’AOXⅠ通过菌落PCR筛选DH5α阳性转化子结果如图2所示，将所有阳性克隆菌落送样测序，将测序结果完全一致的菌落保种，测序结果如图3所示。

（3）pIFN-γ-C毕赤酵母分泌表达菌株的构建与高拷贝菌株的筛选：将上述步骤（3）中构建的重组表达载体用SacⅠ单酶切线性化后，电击转化毕赤酵母野生型X33感受态细胞，涂布YPDSZ筛选平板，置于30℃培养箱中培养至长出单菌落，随机挑取约100个单菌落分别溶于10>

（4）pIFN-γ-C毕赤酵母分泌表达菌株的诱导发酵：将上述步骤（3）中得到的抗1.0mg/mL Zeocin的酵母表达菌株接种于BMGY液体培养基，30℃、230 rpm震荡培养至OD_595nm值5-6时，按照无菌操作要求，离心收集菌体沉淀，按4：1或5：1的比例（如40或50>

（5）诱导发酵上清中pIFN-γ-C的Ni亲和层析：按照氨酸亲和层析树脂填料Ni-NTAHis-Bind要求，对上述诱导发酵上清中的pIFN-γ-C进行纯化，Ni亲和层析结果如图7所示。

（6）优化后的pIFN-γ的发酵产量和活性对比，以未优化的SEQ ID NO：2序列通过质粒转入毕赤酵母并表达为对照，在5升发酵罐内发酵后，pIFN-γ和pIFN-γ-C的表达水平和活性分别如表1和2所示。

表1为pIFN-γ 和pIFN-γ-C 5升发酵罐发酵水平

实验组表达量（mg/L）pIFN-γ303pIFN-γ-C1921

表2为pIFN-γ和pIFN-γ-C 5升发酵罐发酵产品活性

实验组活性单位（U/ml）pIFN-γ3.47×10⁶pIFN-γ-C9.28×10⁸

由表1、2的结果可知，经优化的pIFN-γ-C的表达量和活性远高于未优化的pIFN-γ。上述结果说明调整pIFN-γ的氨基酸序列有得于毕赤酵母的表达及提高其活性。

实施例2

天然未经过改造的pIFN-γ肽链序列如SEQ ID NO：2所示，本发明利用本领域常用的基因突变方法将天然pIFN-γ肽链序列第129和131位氨基酸残基由精氨酸（R）定向突变为组氨酸（H），得到SEQ ID NO：1所示的优化的pIFN-γ肽链。

（1）将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的pIFN-γ肽链插入质粒pPICZαA，转入与毕赤酵母GS115野生型感受态细胞，利用质粒上的抗性基因，通过高抗筛选得到具有目的基因高拷贝的毕赤酵母重组子，可以获得能高效分泌表达具有高活性pIFN-γ的毕赤酵母工程菌。

（2）优化后的pIFN-γ的发酵产量和活性对比，以未优化的SEQ ID NO：2序列通过质粒转入毕赤酵母并表达为对照，在5升发酵罐内发酵后，pIFN-γ和pIFN-γ-C的表达水平和活性分别如表3和4所示。

表3为pIFN-γ 和pIFN-γ-C 5升发酵罐发酵水平

实验组表达量（mg/L）pIFN-γ248pIFN-γ-C1681

表4为pIFN-γ和pIFN-γ-C 5升发酵罐发酵产品活性

实验组活性单位（U/ml）pIFN-γ1.77×10⁶pIFN-γ-C6.94×10⁸

由表3、4的结果可知，经优化的pIFN-γ-C的表达量和活性远高于未优化的pIFN-γ。上述结果说明调整pIFN-γ的氨基酸序列有得于毕赤酵母的表达及提高其活性。

实施例3

天然未经过改造的pIFN-γ肽链序列如SEQ ID NO：2所示，本发明利用本领域常用的基因突变方法将天然pIFN-γ肽链序列第129和131位氨基酸残基由精氨酸（R）定向突变为组氨酸（H），得到SEQ ID NO：1所示的优化的pIFN-γ肽链。

（1）将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的pIFN-γ肽链插入质粒pPICZαA，转入与毕赤酵母KM71野生型感受态细胞，利用质粒上的抗性基因，通过高抗筛选得到具有目的基因高拷贝的毕赤酵母重组子，可以获得能高效分泌表达具有高活性pIFN-γ的毕赤酵母工程菌。

（2）优化后的pIFN-γ的发酵产量和活性对比，以未优化的SEQ ID NO：2序列通过质粒转入毕赤酵母并表达为对照，在5L发酵罐内发酵后，pIFN-γ和pIFN-γ-C的表达水平和活性分别如表5和6所示。

表5为 pIFN-γ 和pIFN-γ-C 5升发酵罐发酵水平

实验组表达量（mg/L）pIFN-γ189pIFN-γ-C843

表6为pIFN-γ和pIFN-γ-C 5升发酵罐发酵产品活性

实验组活性单位（U/ml）pIFN-γ3.59×10⁶pIFN-γ-C8.42×10⁸

由表5、6的结果可知，经优化的pIFN-γ-C的表达量和活性远高于未优化的pIFN-γ。上述结果说明调整pIFN-γ的氨基酸序列有得于毕赤酵母的表达及提高其活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种优化的pIFN-γ肽链及在提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性中

的应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 143

<212> PRT

<213> 改造后的pIFN-γ肽链序列

<400> 1

Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn

1 5 1015

Ala Ser Thr Ser Asp Val Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile

202530

Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln

354045

Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln

505560

Ala Ile Gln Arg Ser Met Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg

65707580

Phe Leu Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Ile

859095

Lys Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu

100 105 110

Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys

115 120 125

His Lys His Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser Lys

130 135 140

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 未改造pIFN-γ肽链序列

<400> 2

Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn

1 5 1015

Ala Ser Thr Ser Asp Val Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile

202530

Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln

354045

Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln

505560

Ala Ile Gln Arg Ser Met Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg

65707580

Phe Leu Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Ile

859095

Lys Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu

100 105 110

Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys

115 120 125

Arg Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser Lys

130 135 140