一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用

摘要

本发明公开了一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用，属于生物医学光学与分子影像学技术领域。本发明公开的红色荧光蛋白相对于荧光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一个或多个的组合。本发明提供的红色荧光蛋白具有较高的亮度、成熟率以及消光系数等光物理性质，可用于蛋白标记与成像、或作为荧光共振能量转移受体或供体等领域进行应用，具有较好的荧光共振能量转移效率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学光学与分子影像学技术领域，具体而言，涉及一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用。

背景技术

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是供体荧光团在其激发态发生非辐射性的能量转移，将能量转给临近的受体荧光团，因此导致受体荧光团发出荧光。由于FRET对供受体偶极子在1-10nm间的距离高度敏感，常常被作为一种高效的光学分子尺，广泛的用于监测能够产生分子间距离变化的生化反应，如研究生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等。相比与其他生化监测方法如酵母双杂交、免疫沉淀等，FRET的优势为可在活细胞生理条件下对细胞生化反应进行实时的动态研究以及空间定位。

大多数基于FRET的能量供受体对的荧光蛋白是青色荧光蛋白(cyan fluorescentprotein,CFP)和黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein,YFP)。然而，这样的能量供受体对存在着一些缺陷。首先，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白可发生可逆性的光漂白；黄色荧光蛋白可光转化为青色荧光蛋白；青色荧光蛋白在黄色荧光蛋白的激发光波长下也可被激发；紫色的青色荧光蛋白激发光不但具有光毒性，而且可以同时激发生物体中的黄素蛋白，产生自发荧光的现象；其次，以青色和黄色荧光蛋白作为能量供受体对的FRET产生的变化小，这给监测细胞中一些细微或瞬时变化的生化反应增加了难度。除此以外，一些文献报道过的，可替代青色和黄色荧光蛋白的供受体对，如供体荧光蛋白：绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein,GFP)，黄色荧光蛋白；以及受体荧光蛋白：橘色荧光蛋白(Orangefluorescent protein,OFP)，红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)，也由于蛋白成熟率低，光漂白快等缺陷，导致FRET效果不理想。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白具有成熟率高的特点，可作为荧光共振能量转移的受体或供体，提高FRET效应。

本发明的再一目的在于提供一种融合蛋白，该融合蛋白含有上述的红色荧光蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸，用于编码上述的红色荧光蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种载体，其含有上述的核酸。

本发明的另一目的在于提供含有上述载体的重组细胞。

本发明的另一目的在于提供上述的红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，该蛋白对具有较高的FRET效应。

本发明的另一目的在于提供上述的红色荧光蛋白在蛋白标记与成像中的应用。

本发明是这样实现的：

一种红色荧光蛋白，其相对于荧光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一个或多个的组合。

一种融合蛋白，其含有上述的红色荧光蛋白。

一种分离的核酸，其编码上述的红色荧光蛋白。

一种载体，其含有上述的核酸。

含有上述载体的重组细胞。

上述的红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。

一种用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，该蛋白对包括上述的红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体或荧光共振能量转移供体。

上述的红色荧光蛋白在蛋白标记与成像中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用的有益效果是：

本发明提供的红色荧光蛋白，其相对于现有的荧光蛋白mRuby3包括N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一个或多个的组合的氨基酸突变位点。其中，第8位的天冬酰胺突变为谷氨酸，氨基酸结构变大，且谷氨酸侧链上的羧基更容易和第33位的天冬酰胺的氨基形成氢键；第10位的精氨酸突变为脯氨酸，以及第114位的谷氨酸突变为缬氨酸，有利于第10位非极性的脯氨酸与第114位非极性缬氨酸形成疏水键；第116位的缬氨酸突变为异亮氨酸，使得氨基酸侧链变长，配合第114位的谷氨酸突变为缬氨酸，有利于第116位拥有较长侧链的异亮氨酸与第114位的缬氨酸形成疏水键；第177位的极性苏氨酸突变为酸性的谷氨酸，配合第179位的碱性精氨酸突变为拥有较短侧链的碱性赖氨酸，有利于第177位点与第179位点形成稳定的离子键。

通过上述氨基酸位点的突变，有利于蛋白形成时的折叠，进而使得荧光蛋白成熟率更高，其相对现有的荧光蛋白mRuby3，成熟率提高了28％。

因此，本发明的红色荧光蛋白能够用作荧光共振能量转移受体或供体，具有较高的FRET效应；或者是用于蛋白标记与成像或活体成像用于监测细胞内基因表达、蛋白定位、蛋白间相互作用、蛋白活性等领域中，具有非常广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例2提供的红色荧光蛋白与荧光蛋白mRuby3的氨基酸序列对比结果；

图2为本发明实施例2提供的红色荧光蛋白的HPLC检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用进行具体说明。

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内，由于偶极的相互作用，就会发生一种非放射性的能量转移。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。

和传统的FRET的能量供受体对荧光蛋白，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白相比。绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白所组成的FRET的能量供受体对有着更多的优势。首先，红，绿荧光蛋白的光谱分的更开；其次，光毒性更小；第三自发荧光性若弱；第四，能够穿透组织更深层。

目前，在已报道过的红色荧光蛋白中，红色荧光蛋白eqFP611中的一个单体突变蛋白，mRuby及其衍生物的性能最佳，Kredel等人在2009年报道了这个蛋白的最大激发峰和发射峰，分别为558nm和605nm，大斯托克斯位移为47nm，与同被定位在内质网中的EGFP(增强型绿色荧光蛋白)相比，mRuby的亮度是EGFP的十倍。

2011年，Lam等将mRuby进一步工程改造为mRuby2，成为当时最亮的红色荧光蛋白。与改造后的最亮的荧光蛋白Clover(绿色荧光蛋白)组成FRET能量供受体对，与已有的FRET能量供受体对相比，Clover，mRuby2有着更好的动态范围以及光稳定性，这大大提高了在神经生物学研究中，对于单个动作电位监测的准确性。Bajar等人在2016年通过基因工程改造技术，将mRuby2改造为亮度提高了35％，光稳定性提高200％的mRuby3，在哺乳动物细胞实验中，mRuby3的荧光强度高于其他珊瑚红色荧光蛋白衍生物，成为迄今为止，亮度最强，稳定性最好的红色荧光蛋白，同时mRuby3与绿色荧光蛋白组成的FRET能量供受体对也具有很高的FRET效应。

尽管mRuby3有以上优势，但mRuby3蛋白的成熟率并不理想，这将会直接影响mRuby3在动物细胞中的表达。此外，在以mRuby3和绿荧光蛋白为受供体的FRET中，mRuby3的成熟要滞后于绿色荧光蛋白，这种成熟率之间差异将会直接影响FRET效应，影响监测细胞中一些细微或瞬时变化的生化反应的准确性。如何更好的改造mRuby3，使其成熟更快，亮度更高，同时作为FRET受体蛋白，能够被更为高效的利用则成为一个重要的研究方向。

基于此，本发明的发明人在现有的红色荧光蛋白mRuby3的基础上，通过对mRuby3的氨基酸序列(如SEQ ID NO:3所示)和结构的分析，采用定点诱变技术，然后在组成型表达载体pNCS上对突变体进行表达和筛选，所用表达菌株为Stellar(购买自安捷伦科技公司)，为确保文库的完整性，每个突变体设置10个克隆，最后通过蓝色LED激发光透过橙色丙烯酸滤波器检测突变体的荧光性质，筛选出荧光度高的红色荧光蛋白的单克隆，命名该荧光蛋白为mRuby4。

本发明筛选得到的红色荧光蛋白具有较高的成熟率、亮度以及消光系数等方面的光物理特性，不仅可独立地用于蛋白标记与成像中，以监测细胞内基因表达、蛋白定位、蛋白间相互作用、蛋白活性等生理生化反应；还可以将其作为荧光共振能量转移受体(或供体)，与其他荧光蛋白组合或配对形成荧光共振能量转移供受体对。在活细胞生理条件下，对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究以及空间定位提供更为灵敏有效的监测途径，以及监测细胞内基因表达、蛋白定位、蛋白活性、细胞分化发育等生理生化反应。

因此，一方面，本发明提供了一种红色荧光蛋白，其相对于荧光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一个或多个的组合。

其中，第8位(对应于图1序列对比图中的氨基酸序列的第12位的位置)的天冬酰胺突变为谷氨酸(N8E)，氨基酸结构变大，且谷氨酸侧链上的羧基更容易和第33位的天冬酰胺的氨基形成氢键；第10位(对应于图1序列对比中的氨基酸序列的第14位的位置，其他突变位点的位数与序列对比位点的对应关系依次类推)的精氨酸突变为脯氨酸(R10P)，以及第114位的谷氨酸突变为缬氨酸(E114V)，有利于第10位非极性的脯氨酸与第114位非极性缬氨酸形成疏水键；第116位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V116I)，使得氨基酸侧链变长，配合第114位的谷氨酸突变为缬氨酸，有利于第116位拥有较长侧链的异亮氨酸与第114位的缬氨酸形成疏水键；第177位的极性苏氨酸突变为酸性的谷氨酸(T177E)，配合第179位的碱性精氨酸突变为拥有较短侧链的碱性赖氨酸(R179K)，有利于第177位点与第179位点形成稳定的离子键。

上述各氨基酸位点的突变，都有利于蛋白形成时的折叠，进而使得荧光蛋白成熟率更高。因此，容易理解，在本发明的其他实施例中，上述氨基酸位点N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的任意一个或多个的组合，都具有提高红色荧光蛋白的成熟率的作用。

优选地，本发明提供的红色荧光蛋白相对于荧光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K。同时包括上述氨基酸突变位点的红色荧光蛋白的成熟率更高。

进一步地，优选地，本发明提供的红色荧光蛋白其相对于荧光蛋白mRuby3还包括以下氨基酸突变位点：E16T，S18T，E111Q，V124E以及N173S中的一个或多个的组合。上述突变位点可进一步改善红色荧光蛋白在成熟率、亮度以及消光系数方面的特性。

进一步，更优选地，本发明提供的红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。其相对于荧光蛋白mRuby3具有氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E、R179K，E16T，S18T，E111Q，V124E以及N173S，共12个突变位点。

再一方面，本发明提供了上述的红色荧光蛋白在蛋白标记与成像中的应用。除了将本发明的红色荧光蛋白与其他荧光蛋白组合形成荧光共振能量转移供受体对外，本发明提供的红色荧光蛋白也可以单独地对其他蛋白进行标记，然后利用分子影像技术，对其进行成像，用以检测或监测细胞内基因表达情况、蛋白定位、细胞分化、蛋白间相互作用、细胞分化发育等生理生化反应。

另一方面，还提供了一种融合蛋白，其含有上述的红色荧光蛋白。由于本发明提供的红色荧光蛋白较高的成熟率，因此，可通过基因工程的技术将其与其他感兴趣的蛋白进行融合，也或者是将红色荧光蛋白标记其他感兴趣的蛋白。通过对红色荧光蛋白的成像，来对其他感兴趣的蛋白进行研究。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸可编码上述的红色荧光蛋白。根据密码子的简并性，在红色荧光蛋白的氨基酸序列确定的情况下，其相应的编码核酸序列也有很多种情况，其均属于本发明的保护范围。需要说明的是，这类核酸的应用也属于本发明的保护范围。

优选地，编码上述SEQ ID NO:1所示的红色荧光蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

另一方面，本发明提供了含有上述核酸的载体。载体可以是克隆载体或表达载体等，优选为表达载体。其中，表达载体可以是真核表达载体或原核表达载体，优选为真核表达载体。又或者是其他类型的载体，均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供了含有上述载体的重组细胞。重组细胞可以是原核细胞也可以是真核细胞。当然，重组细胞也可以是大肠杆菌、酵母菌或动物细胞或人类细胞，或者是其他类型的细胞或细菌均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供了红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。本发明提供的红色荧光蛋白可用于作为荧光共振能量转移受体或供体；若将本发明的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体时，可将其他蛋白例如发射光谱与本发明的红色荧光蛋白的激发光谱重叠的蛋白例如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体；若将本发明的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体时，可将其他蛋白例如激发光谱与mRuby4的光谱重叠的蛋白作为荧光共振能量转移受体。

进一步地，将本发明提供的红色荧光蛋白(作为受体)与NeonGreen2(绿色荧光蛋白，作为供体)组成的新型FRET荧光供受体对。当然，在本发明其他的实施例中，当红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体时，还可以将mEGFP，Envy以及Clover中的任意一种蛋白作为荧光共振能量转移供体，与该红色荧光蛋白组成形成荧光共振能量转移供受体对。

容易理解到，至于具体选用何种类型的荧光蛋白与本发明的红色荧光蛋白组合形成荧光共振能量转移受体对可根据具体使用环境进行选择。只要将本发明提供的红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用即落入本发明的保护范围。

再一方面，本发明提供了用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，该蛋白对包括上述的任意一种红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体或荧光共振能量转移供体。

容易理解到，至于具体将上述的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体还是作为荧光共振能量转移供体，均可以根据实际使用情况选择。只要是用于荧光共振能量转移成像的蛋白对采用了本发明提供的红色荧光蛋白，无论其作为受体还是供体的情形均落入本发明的保护范围。

需要说明的是，本发明提供的红色荧光蛋白可独立地作为荧光共振能量转移受体，受一个或多个荧光共振能量转移供体的激发，也可以是与其他类型的荧光蛋白一起作为荧光共振能量转移受体，受一个或多个荧光共振能量转移供体的激发。同理，本发明提供的红色荧光蛋白可独立地作为荧光共振能量转移供体，激发一个或多个荧光共振能量转移受体，也可以是与其他荧光蛋白一起作为荧光共振能量转移供体，激发一个或多个荧光共振能量转移受体。

综上，本发明提供的红色荧光蛋白，其成熟率较荧光蛋白mRuby3显著提高28％，且是目前亮度最高的红色荧光蛋白，消光系数由mRuby3的128000M^-1·cm^-1增加到132494M^-1·cm^-1，采用本发明提供的红色荧光蛋白作组合成的荧光共振能量转移供受体对具有较高FRET效应，可用于蛋白标记与成像中，并在例如活细胞生理条件下或其他条件下监测细胞内基因表达、蛋白定位、蛋白间相互作用、蛋白活性等领域中，具有非常广阔的应用前景。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的红色荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其相对于荧光蛋白mRuby3(SEQ ID NO:3)具有以下氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K。

其中，第8位的天冬酰胺突变为谷氨酸(N8E)，氨基酸结构变大，且谷氨酸侧链上的羧基更容易和第33位的天冬酰胺的氨基形成氢键；第10位的精氨酸突变为脯氨酸(R10P)，以及第114位的谷氨酸突变为缬氨酸(E114V)，有利于第10位非极性的脯氨酸与第114位非极性缬氨酸形成疏水键；第116位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V116I)，使得氨基酸侧链变长，配合第114位的谷氨酸突变为缬氨酸，有利于第116位拥有较长侧链的异亮氨酸与第114位的缬氨酸形成疏水键；第177位的极性苏氨酸突变为酸性的谷氨酸(T177E)，配合第179位的碱性精氨酸突变为拥有较短侧链的碱性赖氨酸(R179K)，有利于第177位点与第179位点形成稳定的离子键。

需要说明的是：突变位点N8E中的“8”对应与图1所示氨基酸序列的第12位的位置，突变位点R10P中的“10”对应与图1所示氨基酸序列的第14位的位置，其他突变位点的位置依次类推。

上述各氨基酸位点的突变，都有利于蛋白形成时的折叠，进而使得本实施例提供的红色荧光蛋白成熟率更高。

本实施例提供的红色荧光蛋白可作为荧光共振能量转移受体(或供体)，克服现有荧光蛋白mRuby3存在成熟率低的问题，与其他荧光蛋白组合或配对形成荧光共振能量转移供受体对，其具有良好的FRET效应，提高其在监测细胞中一些细微或瞬时变化的生化反应的准确性。

实施例2

在实施例1的红色荧光蛋白(SEQ ID NO:4)的基础上，对其进行进一步的定点突变，以提高其亮度、消光系数、量子产率等方面的特性。

本实施例提供的红色荧光蛋白，命名为mRuby4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其相对于荧光蛋白mRuby3(其氨基酸序列如SEQ ID NO:3)不仅具有以下氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K；还具有以下氨基酸突变位点：E16T，S18T，E111Q，V124E以及N173S。mRuby4与mRuby3的氨基酸序列比对结果如图1所示。

本实施例提供的红色荧光蛋白(SEQ ID NO:1)不仅具有较高的成熟率，还具有较高的消光系数、亮度等特性。

本实施例提供的红色荧光蛋白可以独立地用于蛋白标记与成像的领域中，还可以与其他荧光蛋白组合或配对，形成荧光共振能量转移供受体对进行成像，用以检测或监测细胞内基因表达情况、蛋白定位、细胞分化、蛋白间相互作用、细胞分化发育等生理生化反应，提高其在监测细胞中一些细微或瞬时变化的生化反应的准确性。

实施例3

本实施例提供了获得实施例2的红色荧光蛋白(SEQ ID NO:1)的方法，当然，实施例1所提供的红色荧光蛋白的获得方法也可参考本实施例。需要说明的是，本发明的红色荧光蛋白的获得方法并不限于本实施例所提供的方法，在其他的实施例中，采用其他方法所得到的本发明的红色荧光蛋白同样属于本发明的保护范围。

本实施例提供的获得红色荧光蛋白(SEQ ID NO:1)的方法，如下。

(1)根据实施例2提供的红色荧光蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基序列设计出相应的核酸序列，该核酸序列编码红色荧光蛋白(SEQ ID NO:1)。

在本实施例中，编码该红色荧光蛋白的核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(2)通过基因合成方法获得上述核酸序列(SEQ ID NO:2)，将该核酸序列连接至表达载体上，并转化感受态细胞，并涂布培养。

(3)挑取单菌落，接种培养，然后测序，取测序正确的单克隆继续培养。

(4)对培养液进行离心、纯化，得到红色荧光蛋白。

实施例4

本实施例提供了一种用于荧光共振能量转移成像的蛋白对，该蛋白对以实施例2提供的红色荧光蛋白(SEQ ID NO:1)作为荧光共振能量转移受体，以绿色荧光蛋白NeonGreen2作为荧光共振能量转移供体。

该蛋白对具有较高的提高FRET效应，其为在活细胞生理条件下，对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究以及空间定位提供更为灵敏有效的监测途径。

实施例5

实施例2提供的红色荧光蛋白(SEQ ID NO:1)的单体性检测

荧光蛋白mRuby4的单体性实验

采用B-PER II(购买自皮尔斯公司)对表达mRuby4的菌株进行裂解，然后采用HisPur Cobalt Resin(购买自皮尔斯公司)纯化蛋白，接着通过Econo-Pac 10DG重力流色谱柱(购买自美国Bio-Rad公司)去盐。完成以上蛋白纯化步骤后，统一将荧光蛋白的浓度浓缩成10mg/ml，放入到进样瓶中，用岛津高效液相色谱仪检测荧光蛋白的单体性。以现有的荧光蛋白：mKate2、Fusionred、mRuby3作为参照，结果如图2所示。图2中：A为mRuby3，B为mRuby4，C为Fusionred，D为mKate2，横坐标为出峰的时间，单位分钟，纵坐标为蛋白质紫外吸收值。

结果如图2所示(图中：A代表mRuby3；B代表mRuby4；C代表FusionRed；D代表mKate2)。

图2的结果显示，mRuby4为单体红色荧光蛋白。Fusionred为目前已知的单体性较好的荧光蛋白，mKate2为目前已知的荧光蛋白二聚体，从图2中可知mRuby3与mRuby4的单体性良好，甚至优于Fusionred。

实施例6

对实施例2提供的红色荧光蛋白的光物理性质检测，具体的检测方法可参考相关文献(Chu J,等A bright cyan-excitable orange fluorescent protein facilitatesdual-emission microscopy and enhances bioluminescence imaging in vivo.NatBiotechnology.2016Jul；34(7):760-767)。结果如表1所示。

表1实施例4提供的红色荧光蛋白mRuby4的光物理性质

蛋白名称mRuby3mRuby4激发峰(nm)558558发射峰(nm)592592消光系数(M^-1cm^-1)128000132494.1量子产率0.450.45亮度57.659.6成熟率0.4386080.558755

由表1的结果可知，mRuby4的成熟率为0.558755，相较于mRuby3，mRuby4的成熟率提高了28％；此外，从表1还可得到，mRuby4的亮度为59.6，显著高于mRuby4的亮度，本发明实施例2提供的mRuby4是目前亮度最高的红色荧光蛋白；mRuby4的消光系数由mRuby3的128000M^-1·cm^-1增加到132494M^-1·cm^-1，由此表明，本发明实施例2提供的红色荧光蛋白的具有优良的光物理性质。其可以与其他的荧光蛋白组合形成荧光共振能量转移供受体对，提高FRET效应，且可独立地用于蛋白标记与成像中，并在监测细胞内基因表达、蛋白定位、蛋白间相互作用、蛋白活性等领域中，具有非常广阔的应用前景。

综上所述，本发明提供的红色荧光蛋白具有以下优点：

(1)亮度高，是目前亮度最高的红色荧光蛋白。

(2)成熟率高，其成熟率较先前的mRuby3也有了28％的显著提高。

(3)消光系数高，消光系数由mRuby3的128000M^-1·cm^-1增加到132494M^-1·cm^-1。

(4)应用前景广阔，本发明的红色荧光蛋白能够用作荧光共振能量转移受体或供体，具有较高的FRET效应；或者是独立用于蛋白标记与成像或活体成像用于监测细胞内基因表达、蛋白定位、蛋白间相互作用、蛋白活性等领域中，具有非常广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳先进技术研究院

<120> 一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Glu Met Pro Met Lys

1 5 1015

Val Val Met Thr Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Thr Gly

202530

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Val Gln Thr Met Arg Ile Lys

354045

Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr

505560

Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr Pro Ala Asp Ile

65707580

Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg

859095

Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Thr

100 105 110

Ser Leu Gln Asp Gly Val Leu Ile Tyr Asn Val Lys Val Arg Gly Glu

115 120 125

Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Lys Gly Trp

130 135 140

Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Arg Gly

145 150 155 160

Tyr Thr Asp Ile Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly His Leu His Cys

165 170 175

Ser Phe Val Thr Glu Tyr Lys Ser Lys Lys Thr Val Gly Asn Ile Lys

180 185 190

Met Pro Gly Val His Ala Val Asp His Arg Leu Glu Arg Ile Glu Glu

195 200 205

Ser Asp Asn Glu Thr Tyr Val Val Gln Arg Glu Val Ala Val Ala Lys

210 215 220

Tyr Ser Asn Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 2

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggtgtcta agggcgaaga gctgatcaag gaagagatgc ccatgaaggt ggtcatgaca 60

ggtaccgtca acggccacta cttcaagtgc acaggtgaag gagaaggcag accgtacgag 120

ggagtgcaaa ccatgaggat caaagtcatc gagggaggac ccctgccatt tgcctttgac 180

attcttgcca cgtcgttcat gtatggcagc cgtaccttta tcaagtaccc ggccgacatc 240

cctgatttct ttaaacagtc ctttcctgag ggttttactt gggaaagagt tacgagatac 300

gaagatggtg gagtcgtcac cgtcacgcag gacaccagcc ttcaggatgg cgtgctcatc 360

tacaacgtca aggtcagagg ggagaacttt ccctccaatg gtcccgtgat gcagaagaag 420

accaagggtt gggagcctaa tacagagatg atgtatccag cagatggtgg tctgagagga 480

tacactgaca tcgcactgaa agttgatggt ggtggccatc tgcactgcag cttcgtgaca 540

gaatacaagt caaaaaagac cgtcgggaac atcaagatgc ccggtgtcca tgccgttgat 600

caccgcctgg aaaggatcga ggagagtgac aatgaaacct acgtagtgca aagagaagtg 660

gcagttgcca aatacagcaa ccttggtggt ggcatggacg agctgtacaa g711

<210> 3

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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