可逆双羟基菲并咪唑Hg2+荧光探针合成与使用方法

摘要

本发明涉及一种可逆双羟基菲并咪唑Hg2+荧光探针及其合成与使用方法，它涉及荧光分子探针及其合成与应用。本发明提供的可逆双羟基菲并咪唑Hg2+荧光探针结构新颖，解决了现有的其他金属离子对Hg2+的识别存在干扰以及缺少可逆(off‑on‑off)荧光信号响应检测的技术问题。该荧光分子探针采用1‑N‑1H‑2‑(2‑羟基‑3‑氨基苯基)‑1H‑菲并[9,10‑d]咪唑和水杨醛缩合而成，产率68%。将将该荧光分子探针溶于N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)与N‑2‑羟乙基哌嗪‑N’‑2‑乙磺酸(HEPES)缓冲溶液的混合液中，荧光强度大约为4 a.u.，测试样品加入Hg2+后，荧光强度增强10倍；再加入S2‑后，荧光强度恢复到样品荧光值，可用于水中Hg2+与S2‑的污染的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种Hg²⁺可逆荧光探针及其合成与使用方法。

背景技术

Hg²⁺是一种极具生理毒性的重金属离子，具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，是目前全球最引人关注的环境污染物之一。由于对动植物和人体健康都有很大的影响，比如对人体的脑、肾脏及内分泌系统造成巨大损害。因此对汞离子的检测具有非常重要的意义。近年来，越来越多科研工作者开始了离子荧光探针的研究工作。徐鉴报道了一种新型耐尔蓝衍生物对Hg²⁺的识别性能[化学试剂>2+可以选择性淬灭这种耐尔蓝衍生物的荧光；2016年，《高等学校化学学报》报道了具有高选择性Hg²⁺比率荧光探针>2+可以使主体溶液的颜色由浅绿色变为橙色。2010年在《四面体》(>2+外，还分别对Cu(II)和Fe(III)具有识别性能。

根据目前文献报道的对于Hg²⁺荧光探针的研究，主要存在以下两个缺陷：

1、Hg²⁺对主体化合物的荧光只能进行萃灭或增强的一次性的识别性能，而没有可逆识别性能；

2、其他金属离子与Hg²⁺共存时，主体化合物除了识别Hg²⁺，还对其他金属离子有识别性能，所以，识别不具有专一性。

发明内容

本发明是要解决现有的其他金属离子对Hg²⁺的识别存在干扰以及缺少可逆识别性能的技术问题，而提供的主体化合物对Hg²⁺具有专一识别性能并实现可逆(off-on-off)荧光信号响应检测的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针及其合成与使用方法。

本发明的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的结构式为：

上述的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、中间体化合物的合成：

将菲醌、5-硝基水杨醛和乙酸铵按照1 : 1.5 : 2的摩尔比投入到反应器中，再加入冰乙酸作为溶剂，升温至80 ~ 110℃并搅拌6 ~ 12 h后，反应停止，冷却至室温，向反应器中加入水，再用10％的氢氧化钠溶液调pH值至8 ~ 10，抽滤，得到黄色固体。干燥后，再用乙酸乙酯重结晶，再抽滤、干燥，得到中间体化合物；

二、中间体化合物的合成：

称取2.0 mmol中间体化合物和 0.35 g 雷尼镍加入到反应器中，再加入乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在搅拌条件下，滴加7.5 mL质量百分浓度为80%的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至50 ~ 80℃，反应5 ~ 10 h，冷却至室温，抽滤，用乙酸乙酯洗涤，旋转蒸发去除滤液后，得到褐色固体并干燥。再用乙酸乙酯重结晶，再抽滤、干燥，得到中间体化合物；

三、Hg²⁺荧光探针的合成：

按照1 : 1 ~ 3的摩尔比称取中间体化合物和水杨醛，加入到反应器中，再向其中加入酸性介质作为溶剂，常温搅拌反应1 ~ 5 h。反应结束后，向反应体系中加入水淬灭反应，再用10％氢氧化钠溶液调pH值至8 ~ 10，析出固体。然后进行抽滤，滤饼用水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，得到可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针MQ。

步骤三中所述的酸性介质进一步优选为质量百分浓度为98%的浓硫酸、质量百分浓度为65 ~ 68%的浓硝酸、冰乙酸或苯甲酸。

本发明的合成过程可用下面的式子表示：

本发明提供了一种在水相体系中，pH为6.5 ~ 7.4的环境内，具有高选择性、高灵敏性且不受其他金属离子干扰的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针。该荧光探针能选择性识别Hg²⁺，不受K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺>3+等其他金属离子的干扰，荧光分子-Hg²⁺络合物可以用来对S^2–进行识别检验，完成该荧光分子探针的可逆(off-on-off)荧光信号响应，不受其他阴离子AcO^–、Cl^–、H₂PO₄^–、HCO^3–、CO₃^2–、HPO₄^2–、HSO₃^–、NO₂^–、Br^–、SO₃^2–、SO₄^2–、BrO₃^–和PO₄^3–的干扰。

附图说明

图1是试验1制备的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针对不同金属离子的荧光发射光谱图。

图2是试验1制备的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针在其他金属离子存在的情况下，Hg²⁺荧光探针的荧光发射光谱图。

图3是试验1制备的该可逆荧光分子-Hg²⁺络合物对不同的阴离子的荧光发射光谱图。

图4是试验1制备的该可逆荧光分子-Hg²⁺络合物在其他阴离子存在的情况下，S^2–荧光探针的荧光发射光谱图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的结构式为：

具体实施方式二：具体实施方式一的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、中间体化合物的合成：

将菲醌、5-硝基水杨醛和乙酸铵按照1 : 1.5 : 2摩尔比加入到反应器中，再加入冰乙酸作为溶剂，升温至80 ~ 110℃并搅拌6 ~ 12 h后，冷却至室温，向反应器中加入水，再用10％的氢氧化钠溶液调pH值至8 ~ 10，抽滤，得到黄色固体。干燥后，再用乙酸乙酯重结晶，再抽滤、干燥，得到中间体化合物；

二、中间体化合物的合成：

称取2.0 mmol中间体化合物和 0.35 g 雷尼镍加入到反应器中，再加入乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在搅拌条件下，滴加7.5 mL质量百分浓度为80%的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至50 ~ 80℃，反应5 ~ 10 h，冷却至室温，抽滤，用乙酸乙酯洗涤，旋转蒸发去除滤液后，得到褐色固体并烘干。再用乙酸乙酯重结晶，再抽滤、干燥，得到中间体化合物；

三、Hg²⁺荧光探针的合成：

按照1 : 1 ~ 3的摩尔比称取中间体化合物和水杨醛，加入到反应器中，再加入酸性介质为溶剂，常温搅拌反应1 ~ 5 h，反应结束后，向反应体系中加入水淬灭反应，再用10％氢氧化钠溶液调pH值至8 ~ 10，析出固体，然后进行抽滤，滤饼用水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，得到可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤三中所述的酸性介质为质量百分浓度为98%的浓硫酸、质量百分浓度为65 ~ 68%的浓硝酸、冰乙酸或苯甲酸。

其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤一中的反应温度为100℃，反应时间为10 h。其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是步骤一中的pH值至9。其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是步骤二中反应温度为70℃，反应时间为8 h。其它与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是步骤三中常温搅拌反应3 h。其它与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是步骤三中pH值为9。其它与具体实施方式二至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是步骤三中反应物的摩尔比为1 : 3。

用以下实例验证本发明的有益效果：

试验1：本试验的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、中间体化合物的合成：

称取菲醌5 mmol、5-硝基水杨醛7.5 mmol、乙酸铵10 mmol加入到50 mL的三口瓶中，并向其中加入25 mL的冰乙酸作为溶剂，升温至110℃，并不断搅拌，在反应过程中，用TLC跟踪检测 (展开剂为乙酸乙酯和石油醚，V_{(乙酸乙酯)}：V_(石油醚)>；

本步骤得到的中间体化合物的产率为80%，熔点：>300℃。用红外光谱、核磁氢谱和核磁碳谱表征该中间体化合物，得到的结果如下：

IR (KBr, cm^–1):>1H>J>J =>J>J>J>J>13C>

从表征结果知该中间体化合物的结构式为

。

二、中间体化合物的合成：

在50 mL的三口烧瓶中加入2.0 mmol中间体化合物、0.35 g雷尼镍和30 mL的乙醇溶剂，在通入2 min氮气后，搅拌，并用恒压滴液漏斗慢慢滴加7.5 mL质量百分浓度为80%的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至80℃回流反应5 h后，用TLC跟踪检测（展开剂为V_{(乙酸乙酯)}：V_(石油醚)>。

本步骤得到的中间体化合物的产率为75%，熔点：>300℃；

用红外光谱、核磁氢谱和核磁碳谱进行表征，得到的结果如下：

IR (KBr, cm^–1):>1H>J>J>J>J>J>J>J>13C>

从表征结果知该中间体化合物的结构式为

。

三、Hg²⁺荧光探针的合成：

依次向三口瓶中加入0.65 g（2.0 mmol）中间体化合物、0.24 g（2.0 mmol）水杨醛，再将20 mL的冰乙酸加入三口瓶中作为溶剂，常温搅拌反应2 h，反应结束后，向反应体系中加入水淬灭反应，再置于200 mL的烧杯中，用10％氢氧化钠溶液调pH值至10，然后进行抽滤，滤饼水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，收集固体，干燥后，得到双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针。本步骤中，双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的产率为68%。

双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的熔点为285>

用红外光谱及核磁共振谱进行表征，得到的结果如下：

IR (KBr, cm^–1):>1H>J>J>J>J>J>J>J>J>J>13C>

从以上的表征结果可知，可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的结构式为：

。

将本试验制备的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针进行光谱性能测试，步骤如下：

一、储备液的配置

将可逆双羟基菲并咪唑荧光探针以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂配制成浓度为1.0×10^–4>

阳离子储备液的配制：用金属氯化盐和硝酸盐配制成浓度为0.10 mol/L的阳离子储备液，备用；

阴离子储备液的配制：用非金属钾盐和钠盐配制成浓度为0.10 mol/L的阴离子储备液，备用；

HEPES缓冲溶液：秤取0.60 g 的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸加入250>

二、光谱性能测试

向10.0 mL的容量瓶中加入浓度为1.0×10^–4>2+摩尔浓度比为>

先考察可逆双羟基菲并咪唑荧光探针对金属离子的选择性识别，选用的溶剂为体积比是1:1的DMF/HEPES的混合溶液（其中，HEPES缓冲溶液的浓度为0.01 mol/L，pH = 7.4）并在激发波长为315 nm，激发狭缝宽度为15 nm的情况下，测定浓度为1.0×10^-5>+、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Hg²⁺金属离子，并分别测定荧光发射光谱，结果如图1所示。从图1中可知，主体的荧光发射波长为495>+、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺>3+与对主体的荧光强度影响不大，强度均在4>2+时，荧光强度明显增强为43>2+具有选择识别特性。

为了进一步验证本试验制备的可逆双羟基菲并咪唑荧光探针对Hg²⁺具有选择性识别的特性，以体积比是1:1的DMF/HEPES的混合溶液（其中，HEPES缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH>-5 mol/L的主体溶液，在主体溶液中分别加入浓度为0.10>+、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Fe³⁺>2+后混合均匀。此时，主体化合物、金属离子、Hg²⁺三者的摩尔浓度比为1>+、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Fe³⁺）存在的情况下，Hg²⁺与其他金属离子共存时，主体化合物与汞离子识别的荧光强度并不受其他金属离子的影响。也就是说，其他金属离子的存在并不干扰主体化合物对Hg²⁺识别。因此，图2即可以证明主体化合物对Hg²⁺具有选择识别特性。又可以说明其他金属离子对主体化合物识别Hg²⁺无影响。

为了考查荧光分子-Hg²⁺络合物对阴离子的选择性识别，以体积比是1:1的DMF/HEPES的混合溶液（其中，HEPES缓冲溶液的浓度为0.01>2+，再分别加入浓度为0.10>–、Cl^–、H₂PO₄^–、HCO^3–、CO₃^2–、HPO₄^2–、HSO₃^–、S^2–、NO₂^–、Br^–、SO₃^2–、SO₄^2–-、BrO₃^–、PO₄^3–对其进行荧光发射光谱的测试。测试结果如图3所示，从图3可以看出，其他阴离子的加入对该荧光探针识别Hg²⁺几乎无影响，但加入S^2–后荧光强度从43>2+络合物对S^2–具有选择性识别作用，完成该荧光分子探针的可逆(off-on-off)荧光信号响应。

再考察荧光分子-Hg²⁺络合物对S^2–具有选择性识别特性，选用的溶剂为体积比是1:1的DMF/HEPES的混合溶液（其中，HEPES缓冲溶液的浓度为0.01 mol/L，pH>-5 mol/L的主体溶液，在主体溶液中分别加入浓度为0.10>-、Cl^-、H₂PO₄^-、HCO3^-、CO₃^2-、HPO₄^2-、HSO₃^-、F^-、NO₂^-、NO₃^-、Br^-、SO₃^2-、SO₄^2-、BrO₃^-、PO₄^3-阴离子溶液，再分别加入0.10mol/L的S^2–后混合均匀。随后对其进行荧光发射光谱的测试。测试结果如图4所示，在其他阴离子（AcO^–、Cl^–、H₂PO₄^–、HCO^3–、CO₃^2–、HPO₄^2–、HSO₃^–、NO₂^–、Br^–、SO₃^2–、SO₄^2–-、BrO₃^–和PO₄^3–）存在的情况下，与其他阴离子共存时，主体化合物->2+对S^2–识别的荧光强度并不受其他阴离子的影响。也就是说，其他阴离子的存在并不干扰S^2–的识别。因此，图4既可以证明主体化合物-Hg²⁺络合物对S^2–具有专一识别特性，完成该荧光分子探针的可逆>2+识别S^2–无影响。

这个结果在主体化合物的实际应用中具有重要的意义。

本试验制备的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针，通过以上试验说明在以体积比是1:1的DMF/H₂O的混合溶液（HEPES缓冲溶液的浓度为0.01>2+有选择性识别的作用，而对其他金属离子无识别特性，且与其他金属离子共存时，不干扰该化合物识别Hg²⁺。该荧光分子-Hg²⁺络合物还可以对S^2–进行选择性识别，即使与其他阴离子共存时也不干扰其识别S^2–。

试验2：本试验与试验1不同的是试验1的步骤三用以下的操作代替：依次向三口瓶中加入中间体化合物 0.65 g（2.0 mmol）、水杨醛 0.31 g（2.5 mmol）和20 mL的98%的浓硫酸作为溶剂，常温搅拌反应4 h，反应结束后，向反应体系中加入水淬灭反应，并置于200mL的烧杯中，用10％氢氧化钠溶液调pH值至10，然后进行抽滤，滤饼水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，收集固体，干燥后得到可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针。本试验得到的双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的结构式为：

，产率为40%。

试验3：本试验与试验1不同的是试验1的步骤三用以下的操作代替：依次向三口瓶中加入中间体化合物 0.65 g（2.0 mmol）、水杨醛 0.34 g（2.8 mmol），和25 mL的苯甲酸作为溶剂，常温搅拌反应3.5 h，反应结束后，向反应体系中加入水淬灭反应，并置于200 mL的烧杯中，用10％氢氧化钠溶液调pH值至9，然后进行抽滤，滤饼水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，收集固体，干燥后得到可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针。本试验得到的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的结构式为：

，产率为50%。

试验4：本试验与试验1不同的是试验1的步骤三用以下的操作代替：依次向三口瓶中加入中间体化合物 0.65 g（2.0 mmol）、水杨醛 0.37 g（3.0 mmol），和15 mL的65%的浓硝酸作为溶剂，常温搅拌反应5 h，反应结束后，向反应体系中加入水淬灭反应，并置于200 mL的烧杯中，用10％氢氧化钠溶液调pH值至10，然后进行抽滤，滤饼水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，收集固体，干燥后得到可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针。本试验得到的可逆双羟基菲并咪唑Hg²⁺荧光探针的结构式为：

，产率为45%。