一种检测小新壳梭孢纤维素酶基因表达量的方法

摘要

本发明提供用于Neofusicoccum parvum基因表达量分析的看家基因，所述看家基因为ubcB、β‑tub和TFC1基因，以及上述看家基因作为Neofusicoccum parvum基因表达量的参照。其中，所述Neofusicoccum parvum基因是纤维素酶基因。由3个看家基因作为参照分别计算出来的Neofusicoccum parvum的7个纤维素酶基因的表达量趋势高度一致，说明三个看家基因表现良好，能作为N.parvum的看家基因应用于其它基因作为参照。利用本发明的方法可简单快速地检测N.parvum的7个纤维素酶在侵染猕猴桃或者其它寄主植物中的表达变化。

说明书

【技术领域】

生长期的猕猴桃果实，其表面容易附着病菌，这些病菌能引起贮运期间果实大规模腐烂，由Neofusicoccum parvum(小新壳梭孢)引起的猕猴桃软腐病在贮藏期传染速度极快，潜伏期短，危害最为严重，能造成极大的经济损失。

纤维素酶是许多病原菌的重要致病因子，可降解植物细胞壁，有利于其成功侵入寄主植物，例如，罗海莉等(2011)发现，纤维素酶是镰刀菌引起莲藕贮藏期病害的重要致病因子，该酶主要在病害后期起作用，吴洁云(2007)研究表明，灰葡萄孢(Botrytis cinerea)产生的纤维素酶在病菌侵入和致病过程中都发挥了重要作用。刘小燕等(2009)研究发现油菜菌核病菌(Sclerotinia sderotiorum)的致病力强弱与其纤维素酶活性高低成正相关。纤维素是由β-1,4-D-吡喃葡萄糖残疾组成的一种纤维状，不可溶的晶体多糖，是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富的多聚物。而纤维素酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一种复杂酶系。所有能分解微晶纤维素的真菌，均能或多或少分泌纤维素酶，所以产纤维素酶的真菌源非常广。来自真菌的纤维素酶根据功能可分为三类：内切葡聚糖酶(1,4-β-D-glucan glucanohydrolase，EG)，外切葡聚糖酶(1,4-β-D-glucancellobilhydrolase，CBH)，β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase，BG)。随着分子生物学的发展，目前主要是对纤维素酶分子的结构和功能进行研究，尤其是对木霉属、梭菌属和腐质霉属的纤维素酶的研究，而针对猕猴桃软腐病病原菌(Neofusicoccum parvum)的纤维素酶的研究未见报道。研究猕猴桃软腐病菌纤维素酶基因在其侵染过程中的表达情况，对于了解其致病机制具有重要意义。

传统的纤维素组分表达测定需要先对每种纤维素纯化，然后再利用电化法、荧光法、分光光度法等测定酶活性，这样的检测方式复杂、耗时长且容易造成误差。此外，对于基因表达mRNA水平的标准化策略，有研究提出可以用总RNA或rRNA进行标准化，然而，越来越多的研究表明，rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响。除此之外，rRNA相对于目标基因常呈高丰度表达，将使研究者在实时定量PCR数据分析时难以准确减去基线值。

Gellon等人(Bénard-Gellon M,Farine S,Goddard M L,et al.Toxicity ofextracellular proteins from Diplodia seriata and Neofusicoccum parvuminvolved in grapevine Botryosphaeria dieback[J].Protoplasma,2014,252(2):679-687)发现VvACT和VvEF1-Cs可作为内参基因；而Llanos(Llanos A, J M,Parrou JL.Tracking the best reference genes for RT-qPCR data normalization infilamentous fungi[J].Bmc Genomics,2015,16(1):1-18)等人发现ubcB、sac7、fis1、sarA、TFC1和UBC6这6个基因可以作为真菌的参照基因。然而，现有技术并没有提及这些基因的进一步应用，更不涉及Neofusicoccumparvum菌。因此，急需开发出一种能够快速检测病原菌纤维素酶组份在侵染过程中表达量变化的方法。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种用于Neofusicoccum parvum纤维素酶基因表达量的方法，并提供用于实现该方法的看家基因、其特异性引物及检测试剂盒。

本发明是通过设计Neofusicoccum parvum病原菌的7个纤维素酶基因和3个看家基因的特异性引物对，针对猕猴桃软腐病病原菌Neofusicoccum parvum(小新壳梭孢)侵染过程，采用定量反转录聚合酶链式反应(quantificational real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)，构建了纤维素酶基因在N.parvum病原菌侵染果实过程中的表达量变化检测体系得到的。

为了实现上述目的，本发明提供用于Neofusicoccum parvum基因表达量分析的看家基因，所述看家基因为ubcB、β-tub和TFC1基因。

上述看家基因作为Neofusicoccum parvum基因表达量的参照。

其中，所述Neofusicoccum parvum基因是纤维素酶基因，包括UCRNP2_2356纤维素酶基因、UCRNP2_2427纤维素酶基因、UCRNP2_3883纤维素酶基因、UCRNP2_5067纤维素酶基因、UCRNP2_7122纤维素酶基因、UCRNP2_7847纤维素酶基因和UCRNP2_8897纤维素酶基因。

所述纤维素酶基因的特异性引物序列如下：

UCRNP2_2356纤维素酶基因：

ZYUC2356上游引物：5’-GCTGAGCTACATGCAGGAGA-3’

ZYUC2356下游引物：5’-GATAAGTTCCCCACCAGGGAC-3’

UCRNP2_2427纤维素酶基因：

ZYUC2427上游引物：5’-GCAACAAGGGTCTCATCGGC-3’

ZYUC2427下游引物：5’-TAGGTGCCCCACCAGGG-3’

UCRNP2_3883纤维素酶基因：

ZYUC3883上游引物：5’-AGCTTCACCAGCTACCCCAT-3’

ZYUC3883下游引物：5’-TGGTCTCAGCAACCTCAACG-3’

UCRNP2_5067纤维素酶基因：

ZYUC5067上游引物：5’-CAGCGACCCTGGCATTCTTA-3’

ZYUC5067下游引物：5’-TGCGTAGGATTTTCCGTCGT-3’

UCRNP2_7122纤维素酶基因：

ZYUC7122上游引物：5’-ACGAAGGCGACTGGAATAATGC-3’

ZYUC7122下游引物：5’-AGGCCCAGGTGACTGGCA-3’

UCRNP2_7847纤维素酶基因：

ZYUC7847上游引物：5’-TGATCCGCACCACATTCTGT-3’

ZYUC7847下游引物：5’-ATCATGGTGTTCGGCAGCTT-3’

UCRNP2_8897纤维素酶基因：

ZYUC8897上游引物：5’-TGAACGAGCCACATGACCTG-3’

ZYUC8897下游引物：5’-GCGAAGTTGCTCCAACACTC-3’。

所述看家基因的特异性引物，所述引物的序列为：

ubcB基因：

ZYUC3693上游引物：5’-AAGGTCAACTTCACCACCCG-3’

ZYUC3693下游引物：5’-TGGAGAGCAGGACCTTCGAG-3’

β-tub基因：

ZYUC7202上游引物：5’-GCCTTCTGGCAGACCATTTCT-3’

ZYUC7202下游引物：5’-TTGTTGTTGGACGCCTGCTC-3’

TFC1基因：

ZYUC7020上游引物：5’-GCGCCGAATGCAACATCAAA-3’

ZYUC7020下游引物：5’-TTCTCGCGCATCAGAACCTT-3’。

本发明还涉及含有上述特异性引物的检测试剂盒。

本发明还提供一种检测Neofusicoccum parvum纤维素酶基因表达量的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取样

将活化的Neofusicoccum parvum菌株接种在培养基中，25℃恒温培养直至得到显著生长的菌落，收集培养物；

(2)总RNA提取

取50-100mg培养物于1.5ml离心管中，用液氮冷冻磨碎，加入Trizol试剂1ml，充分匀浆后室温放置5min，加入200μl氯仿，剧烈震荡20～30s，室温放置3min后，在4℃、12000rpm条件下离心15min，RNA完全溶于上层水相，将上层水相转入至新的EP管中；向EP管加入等体积的氯仿震荡20s，在4℃、12000rpm条件下离心15min，将上层水相转移至新的EP管中；向新的EP管加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置20min后再在4℃、12000rpm条件下离心10min，沉淀RNA；重复加入异丙醇步骤2次，然后加入1ml体积分数为75％乙醇溶液，在4℃、12000rpm条件下离心5min，弃上清液；加入700μl无水乙醇，4℃、12000rpm下离心10min，弃上清液；最后让EP管中无水乙醇挥发干净后，用30μl DEPC水溶解RNA，-80℃保存备用；

(3)获取cDNA

(3.1)在RNase free的离心管中加入4×gDNA wiper Mix 2μl，模板RNA 1μl，用水补足8μl，混匀后再42℃水浴2min；

(3.2)在第1)步的反应管中加入5×qRT SurperMix 2μl，用移液器轻轻吹打混匀；

(3.3)进行逆转录反应：25℃ 10min

50℃ 30min

85℃ 5min

将扩增产物存放于-20℃冰箱备用；

(4)qRT-PCR

(4.1)反应体系的配制

所述引物1和引物2是前述的特异性引物；所述模板cDNA为步骤(3)所得的RNA逆转录产物；

2)qPCR反应程序设置

采用两步法程序进行反应：

预变性：95℃5min循环一次；

循环反应：95℃10sec；57℃45sec；72℃60sec，循环40次；

熔解曲线：95℃15sec；57℃45sec；95℃15sec，循环一次；

(5)纤维素酶基因表达水平计算

利用荧光定量PCR分别检测出目的基因和内参基因在各处理组的Ct值之后，计算出各基因在样品与对照品间的表达差异倍数。计算公式如下(相对定量法ΔΔCt)：

ΔCt_sample＝Ct_target–Ct_reference；

ΔCt_calibrator＝Ct_target–Ct_reference；

ΔΔCt＝ΔCt_sample–ΔCt_calibrator；

相对量NRQ＝2^-ΔΔCt。

本发明通过10对特异性引物(包括3对为ubcB、β-tub和TFC1三个看家基因的特异性引物，7对为纤维素酶基因特异性引物)，所有引物在PCR扩增时溶解曲线仅出现一个单峰。本发明通过实验验证这三个看家基因作为参照分别得出的Neofusicoccum parvum的7个纤维素酶基因的表达量趋势高度一致，说明三个看家基因表现良好，能作为N.parvum的看家基因应用于纤维素酶基因作为参照，还可以作为果胶酶基因、几丁质酶基因的参照。利用本发明的方法可简单经济和快速的检测N.parvum的7个纤维素酶在侵染猕猴桃或者其它寄主植物中的表达变化。

【附图说明】

图1为N.parvum纤维素酶基因的特异性引物验证图；

图2为7个纤维素酶基因验证的系统发育树(黑色加粗字体表示本发明的纤维素酶基因。该树经过1000次重复计算，小于≥50％支持率的数值已经去除)；

图3为3个看家基因验证的系统发育树(黑色加粗字体表示本发明的看家基因。该树经过1000次重复计算，小于≥50％支持率的数值已经去除)；

图4为10个基因溶解曲线；

图5为10个基因PCR扩增结果；

其中，Marker为DL2000，泳道1-7分别为UCRNP2_2356(2356)、UCRNP2_2427(2427)、UCRNP2_3883(3883)、UCRNP2_5067(5067)、UCRNP2_7122(7122)、UCRNP2_7847(7847)和UCRNP2_8897(8897)纤维素酶基因，泳道8-10分别为ubcB、β-tub和TFC1看家基因。

图6为看家基因(β-tub,TFC1和ubcB)和7个纤维素酶基因的扩增曲线以及猕猴桃果实接种Neofusicoccum parvum(Mht-2)后，分别以β-tub,TFC1和ubcB作为参照的7个纤维素酶基因表达量变化趋势。

【具体实施方式】

本发明中，如无特殊说明，用于表示浓度或比例的“％”均为重量比，“份”均为重量份。

本发明中，所涉及的反转录酶、Green Master Mix为Vazyme公司产品；Trizol试剂由Aidlab公司提供；DNAmarker为TIANGEN公司产品；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；其余化学试剂均为国产分析纯产品，可在市场上购买获得。

实施例1

根据Blanco-Ulate等人(2013)提供的基因组信息，在NCBI及KEGG网站上搜寻Neofusicoccum parvum(UCR-NP2)的基因组序列，并根据基因组序列信息得知该菌的7个纤维素酶基因，其在NCBI上的基因符号(Gene symbol)分别为：UCRNP2_2356、UCRNP2_2427、UCRNP2_3883、UCRNP2_5067、UCRNP2_7122、UCRNP2_7847和UCRNP2_8897，下载它们的氨基酸序列以及它们在NCBI上比对得到的相似性最高序列。同时根据Llanos等人(2015)和Cusick等人(2014)的研究结果，选择UCR-NP2菌株的ubiquitin conjugating enzyme(ubcB)、Beta-tubulin(β-tub)和RNA polymerase iii transcription factor(TFC1)作为看家基因，其NCBI登陆号为：UCRNP2_3693、UCRNP2_7202和UCRNP2_7020。下载这3个看家基因的氨基酸序列以及其在NCBI比对得到的同源序列。用ClustalX(1.7)软件剪齐序列，然后用MEGA5.0软件以1000次重复计算构建系统发育树。

下载Neofusicoccum parvum的7个纤维素酶基因和3个看家基因(UCRNP2_2356、UCRNP2_2427、UCRNP2_3883、UCRNP2_5067、UCRNP2_7122、UCRNP2_7847、UCRNP2_8897、UCRNP2_3693、UCRNP2_7020和UCRNP2_7202)的DNA序列，它们的DNA序列登录号分别为：XM_007581599、XM_007581669、XM_007583110、XM_007584282、XM_007586318、XM_007587032、XM_007588072、XM_007582925、XM_007586213和XM_007586396。

利用MEGA 7、Primer Premier 5.0和NCBI在线工具设计和验证用于检测纤维素酶基因和看家基因的跨内含子引物，步骤如下：利用MEGA 7软件(Molecular evolutionarygenetics analysis，http://www.megasoftware.net/)进行序列比对，查找和选取N.parvum目的基因相对于其它序列的变异区间，手动根据变异碱基设计引物。将获得的引物对放入Primer Premier 5.0软件检查引物是否包含不利于PCR扩增的因素，包括Hairpin(发夹结构)，Dimer(二聚体)，False Priming(错误引发)，Cross Dimer(引物间交叉二聚体形成)。在Product行的Ta opt(℃)处给出该引物的最佳退火温度(Tm)，供PCR扩增程序参考。以获得的一对引物为例，在NCBI网站上BLAST后出现如图1的结果。

图1中的两段粗黑线中有连线的代表这些序列能和引物匹配，表明理论上该引物可以扩增出目的序列。如果显示连线的线段中只有目的物种(N.parvum)的目的基因，则证明在理论上该引物可用。其中E value代表被比对的两个序列不相关的可能性，一般来说，Evalue越低，该引物的特异性越高。

通过相同的过程，获得前述7个纤维素酶基因和3个看家基因的跨内含子引物：

UCRNP2_2356纤维素酶基因：

ZYUC2356上游引物：5’-GCTGAGCTACATGCAGGAGA-3’

ZYUC2356下游引物：5’-GATAAGTTCCCCACCAGGGAC-3’

UCRNP2_2427纤维素酶基因：

ZYUC2427上游引物：5’-GCAACAAGGGTCTCATCGGC-3’

ZYUC2427下游引物：5’-TAGGTGCCCCACCAGGG-3’

UCRNP2_3883纤维素酶基因：

ZYUC3883上游引物：5’-AGCTTCACCAGCTACCCCAT-3’

ZYUC3883下游引物：5’-TGGTCTCAGCAACCTCAACG-3’

UCRNP2_5067纤维素酶基因：

ZYUC5067上游引物：5’-CAGCGACCCTGGCATTCTTA-3’

ZYUC5067下游引物：5’-TGCGTAGGATTTTCCGTCGT-3’

UCRNP2_7122纤维素酶基因：

ZYUC7122上游引物：5’-ACGAAGGCGACTGGAATAATGC-3’

ZYUC7122下游引物：5’-AGGCCCAGGTGACTGGCA-3’

UCRNP2_7847纤维素酶基因：

ZYUC7847上游引物：5’-TGATCCGCACCACATTCTGT-3’

ZYUC7847下游引物：5’-ATCATGGTGTTCGGCAGCTT-3’

UCRNP2_8897纤维素酶基因：

ZYUC8897上游引物：5’-TGAACGAGCCACATGACCTG-3’

ZYUC8897下游引物：5’-GCGAAGTTGCTCCAACACTC-3’。

所述看家基因的特异性引物，所述引物的序列为：

ubcB基因：

ZYUC3693上游引物：5’-AAGGTCAACTTCACCACCCG-3’

ZYUC3693下游引物：5’-TGGAGAGCAGGACCTTCGAG-3’

β-tub基因：

ZYUC7202上游引物：5’-GCCTTCTGGCAGACCATTTCT-3’

ZYUC7202下游引物：5’-TTGTTGTTGGACGCCTGCTC-3’

TFC1基因：

ZYUC7020上游引物：5’-GCGCCGAATGCAACATCAAA-3’

ZYUC7020下游引物：5’-TTCTCGCGCATCAGAACCTT-3’。

市场购买的健康猕猴桃果实；实验室分离得到的猕猴桃软腐病病原菌株，根据Zhou等人(2015)(Zhou Y,Gong G,Cui Y,et al.Identification of BotryosphaeriaceaeSpecies Causing Kiwifruit Rot in Sichuan Province,China[J].Plant Disease,2015,99(5):699-708.)确认为Neofusicoccum parvum。

将活化的猕猴桃软腐病病原菌株Neofusicoccum parvum菌株用5mm打孔器打孔菌落边缘得到菌饼，然后将菌饼分别接种在5个培养皿和5个健康猕猴桃果实表面，并将其放于25℃恒温培养箱内培养5天。接种后每24h取样，连续取样5d，具体方法如下：每天在超净工作台内，从培养皿固定位置挑取适量菌丝放入2ml离心管中(用DEPC水浸泡并灭菌处理)，重复三次，将离心管装入洁净采样袋并做好标记；同时从猕猴桃果实接种处挑取果肉并重复之前工作，将收集到的样品迅速放入液氮急冻然后在-80℃冰箱内备用。

取50-100mg组织于1.5ml离心管中，用液氮冷冻磨碎，加入Trizol试剂1ml。用电动匀浆器充分匀浆约1min，室温放置5min，使核蛋白复合物完全分离。然后加入200μl氯仿，剧烈震荡20～30s，室温放置3min后，在4℃、12000rpm条件下离心15min，RNA完全溶于上层水相，将上层水相约400μl转入至新的EP管中。接着加入等体积的氯仿震荡20s，在4℃、12000rpm条件下离心15min，将上层水相转移至新的EP管中。之后加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置20min后再4℃、12000rpm条件下离心10min，沉淀RNA。重复加入异丙醇步骤2次，然后加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，用手轻弹管壁，使沉淀充分被洗净，在4℃、12000rpm条件下离心5min，并弃上清液。加入700μl无水乙醇，4℃、12000rpm下离心10min，弃上清液。最后让EP管中无水乙醇挥发干净后，用30μl DEPC水溶解RNA(可在55～60℃水浴加快溶解速度)，-80℃保存。

获取Mht-2株的cDNA，具体步骤如下：

(1)在RNase free的离心管中加入4×gDNA wiper Mix 2μl，模板RNA 1μl(总RNA：1pg-500ng)，用水补足8μl。混匀后再42℃水浴2min。

(2)在第1步的反应管中直接加入5×qRT SurperMix 2μl。用移液器轻轻吹打混匀。

(3)进行逆转录反应：25℃10min

50℃30min

85℃5min

将扩增产物存放于-20℃冰箱备用。

qRT-PCR反应，反应体系如下：

采用两步法程序进行反应：

反应结束后，利用荧光定量PCR分别检测出目的基因和内参基因在各处理组的Ct值之后，计算出各基因在样品与对照品间的表达差异倍数。计算公式如下(相对定量法ΔΔCt)：

ΔCt_sample＝Ct_target–Ct_reference；

ΔCt_calibrator＝Ct_target–Ct_reference；

ΔΔCt＝ΔCt_sample–ΔCt_calibrator；

NRQ(normalized relative quantity)＝2^-ΔΔCt

验证Neofusicoccum parvum纤维素酶基因和看家基因的注释准确性，结果如图2和3所示。

由图2和3可知，由Blanco-Ulate等人(2013)注释的纤维素酶基因和看家基因序列与NCBI上公布的且经过验证的序列具有同源性。这说明这些Neofusicoccum parvum的7个纤维素酶基因和3个看家基因的注释结果可靠，可用于进一步分析。

经过检测获得ubiquitin conjugating enzyme(ubcB)、Beta-tubulin(β-tub)和RNA polymerase iii transcription factor(TFC1)三个看家基因和6对跨内含子和1对不跨内含子(基因无内含子)的纤维素酶基因(表1)的特异性引物。

由图4可知，引物对ZYUC2356扩增的UCRNP2_2356(2356)纤维素酶基因、ZYUC2427扩增的UCRNP2_2427(2427)纤维素酶基因、ZYUC3883扩增的UCRNP2_3883(3883)纤维素酶基因、ZYUC5067扩增的UCRNP2_5067(5067)纤维素酶基因、ZYUC7122扩增的UCRNP2_7122(7122)纤维素酶基因、ZYUC7847扩增的UCRNP2_7847(7847)纤维素酶基因、ZYUC8897扩增的UCRNP2_8897(8897)纤维素酶基因以及引物对ZYUC7202扩增的UCRNP2_7202(7202)putative beta-tubulin protein看家基因、ZYUC7020扩增的UCRNP2_7020(7020)transcription factor C subunit 1看家基因、ZYUC3693扩增的UCRNP2_3693(3693)ubiquitin-conjugating enzyme看家基因熔点曲线仅有单一峰出现，说明PCR扩增仅产生了一条特异性产物，表明了这些引物具有极高的特异性。

表1.引物序列及目标基因在NCBI比对结果

对扩增产物分别进行电泳凝胶分析，图5为10对引物在扩增目的基因时的电泳检测结果。由此可知，10对引物扩增的纤维素酶基因和看家基因都是单一条带(100～200bp)，说明引物的特异性强。

图6为10对引物在扩增Neofusicoccum parvum侵染猕猴桃果实后第1天和第2天目的基因表达时的PCR实时观测结果，由图可见扩增产物的Ct值(Threshold Cycle)在19和30之间，表明10对特异性引物均能良好扩增目的基因。

由图可知，qRT-PCR成功扩增出了3个看家基因(ubcB、β-tub、TFC1)和6对跨内含子和1对不跨内含子(UCRNP2_3883基因无内含子)的纤维素酶基因，3个看家基因作为参照计算出的纤维素酶基因表达量不一致，但是分别由这3个看家基因计算出来的纤维素酶基因变化趋势一致。由此说明三个看家基因表现良好，能作为N.parvum的看家基因应用于其它基因作为表达变化参照。

综上所述，本发明获得10对特异性引物，其中3对为ubcB、β-tub和TFC1三个看家基因的特异性引物，6对为纤维素酶基因特异性引物，所有引物在PCR扩增时溶解曲线仅出现一个单峰(图1)。实验表明，由3个看家基因作为参照分别计算出来的Neofusicoccumparvum的7个纤维素酶基因的表达量趋势高度一致，由此说明三个看家基因表现良好，能作为N.parvum的看家基因应用于其它基因作为参照。利用本发明的方法可简单快速地检测N.parvum的7个纤维素酶在侵染猕猴桃或者其它寄主植物中的表达变化。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种检测小新壳梭孢纤维素酶基因表达量的方法

<130> 16326.1

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC2356上游引物

<400> 1

gctgagctac atgcaggaga 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> ZYUC2356下游引物

<400> 2

gataagttcc ccaccaggga c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC2427上游引物

<400> 3

gcaacaaggg tctcatcggc 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> ZYUC2427下游引物

<400> 4

taggtgcccc accaggg 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC3883上游引物

<400> 5

agcttcacca gctaccccat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC3883下游引物

<400> 6

tggtctcagc aacctcaacg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC5067上游引物

<400> 7

cagcgaccct ggcattctta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC5067下游引物

<400> 8

tgcgtaggat tttccgtcgt 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> ZYUC7122上游引物

<400> 9

acgaaggcga ctggaataat gc 22

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> ZYUC7122下游引物

<400> 10

aggcccaggt gactggca 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC7847上游引物

<400> 11

tgatccgcac cacattctgt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC7847下游引物

<400> 12

atcatggtgt tcggcagctt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC8897上游引物

<400> 13

tgaacgagcc acatgacctg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC8897下游引物

<400> 14

gcgaagttgc tccaacactc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC3693上游引物

<400> 15

aaggtcaact tcaccacccg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC3693下游引物

<400> 16

tggagagcag gaccttcgag 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> ZYUC7202上游引物

<400> 17

gccttctggc agaccatttc t 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC7202下游引物

<400> 18

ttgttgttgg acgcctgctc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC7020上游引物

<400> 19

gcgccgaatg caacatcaaa 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> ZYUC7020下游引物

<400> 20

ttctcgcgca tcagaacctt 20