一株定点突变改造的基因工程精氨酸脱亚胺酶

摘要

一株定点突变改造的基因工程精氨酸脱亚胺酶，属于基因工程技术领域。其氨基酸序列为SEQ ID No.1。所述定点突变的精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列相对于天然的精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列的第264位甘氨酸突变为脯氨酸。本发明所述的突变精氨酸脱亚胺酶与野生酶相比其有效pH作用范围得到一定的扩展，尤其在生理pH 7.4下仍具有较好的酶活性。随着有效pH作用范围的拓宽，突变酶在pH 5.5~7.5条件下，仍然具有较高的稳定性。因此解决了精氨酸脱亚胺酶在临床上对肿瘤治疗的应用上生理条件下普遍酶活力低、体内半衰期短的问题，为利用该酶及其编码基因来用于临床治疗创造好的条件。

说明书

技术领域

本发明涉及一种最适pH和pH稳定性向生理中性偏移的精氨酸脱亚胺酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

精氨酸脱亚胺酶（Arginine deiminase，EC 3.5.3.6）简称ADI，它催化在微生物体内的精氨酸代谢途径中的第一个反应，即将精氨酸水解，并生成瓜氨酸和氨。精氨酸脱亚胺酶来源广泛，目前在细菌、古细菌及一些真核细胞中均有发现。同时，不同来源的精氨酸脱亚胺酶的性质有较大的差异。

目前，国内外研究精氨酸脱亚胺酶的学者主要将该酶应用于瓜氨酸的制备和疾病的治疗两大方面。其中医药领域上，精氨酸脱亚胺酶在抑制精氨酸缺陷性肿瘤、乳腺癌、肝癌细胞以及作为L-天冬酰胺酶的替代品治疗白血病方面具有良好的表现。美国凤凰公司研制的ADI-PEG-20已在全球进行肝癌的第Ⅲ期人体临床试验，结果表明ADI-PEG-20可使患者平均寿命延长76%。

迄今为止，由于作为药用酶受到在生理条件下酶活低、体内半衰期短、底物亲和性弱等问题的限制，精氨酸脱亚胺酶仍未大规模应用。因此通过分子改造以改善酶学性质尤为重要。

定点突变（sit-directed mutagenesis）是分子改造中的一种主要手段之一，是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。与其他改善酶学性质的策略相比，定点突变具有更为迅速、直接和节约成本的优势，它是实验室常用的基因改造的手段之一。

发明内容

本发明的目的在于，通过对精氨酸脱亚胺酶进行分子改造，使改造后的精氨酸脱亚胺酶在生理pH 7.4条件下的酶活和稳定性有所提高，最终应用于医药领域。

本发明的技术方案：一种定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶突变体，称之为基因工程精氨酸脱亚胺酶，由粪肠球菌Enterococcus>SK32.001的精氨酸脱亚胺酶基因出发，运用定点突变技术获得，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.1，定点突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因DNA，是由SEQ ID No.2的核苷酸序列所编码。

一种重组质粒，其包含了所述的DNA分子。

一种宿主细胞，其含有所述的DNA分子，或含有所述的重组质粒。

所述的精氨酸脱亚胺酶突变体，将含有通过B-FITTER预测获得的氨基酸突变点的精氨酸脱亚胺酶突变质粒转入大肠杆菌Escherichia> BL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到最适pH和pH稳定性趋近与生理中性pH 7.4的突变体Gly264Pro。

其第264位甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro。

所述的精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，包括如下步骤：

以来自于大肠杆菌宿主携带的精氨酸脱亚胺酶基因的重组质粒为模版，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行反向PCR，扩增突变质粒全长；使用Dpn>Dpn>E.>>

所述精氨酸脱亚胺酶突变体的应用，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体用于药用抗肿瘤活性及相关药理活性研究。

所述的氨基酸发生突变位于精氨酸脱亚胺酶蛋白结构的内部，所述的突变可以增加蛋白疏水相互作用。

所述的氨基酸发生突变的是精氨酸脱亚胺酶第264位的甘氨酸替换为脯氨酸，所得单突变体命名为Gly264Pro。

本发明提供一种所述精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，具体步骤如下：

1、构建一株以pET-28a-c(+)为表达载体、在表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）中表达的精氨酸脱亚胺酶基因工程重组菌；

2、设计突变引物，通过反向PCR对精氨酸脱亚胺酶基因进行定点突变，获得含突变精氨酸脱亚胺酶基因序列的重组载体；

3、将突变后的重组载体通过热激转化进入大肠杆菌BL21（DE3）中，并诱导表达，收集菌体，超声破碎细胞后使用Ni-NTA进行蛋白分离纯化，获得突变精氨酸脱亚胺酶。

本发明提供的精氨酸脱亚胺酶突变体最适pH和pH稳定性均向生理中性方向偏移，其中最适pH从原始的5~5.5，扩大为5.5~7.5，pH稳定范围从5.5~6.5，偏移到6.5~7.5。解决了野生型的精氨酸脱亚胺酶在生理pH 7.4条件下催化活性和稳定性低的问题，为该酶在医药领域的应用创造好的条件。

本发明所用的精氨酸脱亚胺酶的基因arcA来自于一株可生产瓜氨酸的粪肠球菌，该菌株编号CCTCC>Enterococcus>SK32.001），在中国专利CN>

附图说明

图1：重组质粒pET-28a-ADI的构建图谱。

图2：野生酶和突变酶的最适pH变化图。

图3：野生酶和突变酶的pH稳定性变化图。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。

材料与试剂：所用的限制性内切酶、Solution Ⅰ连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）菌株、引物均购于生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。

实施例1：重组质粒的构建

将Enterococcus>SK32.001培养至指数生长中期，取2mL菌液10000r/min离心10min弃上清，溶菌酶处理30min后按照试剂盒说明提取基因组DNA。

设计如下的引物来用于arcA的扩增：

FADI-2：5’-CGCGGATCCA TGAGTCATCC AATTAATGT-3’(含BamH>

RADI-2：5’-CCGCTCGAGT TAAAGATCTT CACGGT-3’（含XhoⅠ酶切位点），

PCR扩增条件：95℃变性3min，30个循环（95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 210 s），最后72 ℃延伸2min。

扩增产物纯化后，用BamH>XhoⅠ对PCR产物和载体pET-28a-c(+)进行双酶切，分别回收酶切产物，用Solution>

实施例2：定点突变

根据Enterococcus> SK23.001中编码arcA的编码基因，进行引物设计。

G264P-正向引物：5’-CTTGGCTTTT GATATCCCTG>

G264P-反向引物：5’-GATATCAAAA GCCAAGATAT TTTTGAATCC TA-3’，

其中下划线部分代表突变体基因编码的264位甘氨酸所对应的密码子。PCR扩增体系为：

10×Reaction Buffer5 μLdNTP mix1 μL正向引物（100 ng/μL）1.25μL反向引物（100 ng/μL）1.25μL模版pET-28a-ADI（10 ng）2 μLpfuTurbo>1μLddH₂O38.5μL总体积50 μL

PCR扩增后，向反应液中加入1 μL Dpn>G264P。

实施例3：野生酶及突变酶的表达纯化

挑取BL21(DE3)/ pET-28a-ADI及pET-28a-ADI^G264P单菌落分别于含0.5mmol/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、200r/min培养12h后，转接至含0.5mmol/L卡那霉素的LB培养基中，在37℃、200r/min培养至OD₆₀₀在0.5~0.7范围内，加入1mmol/L的IPTG在28℃、200r/min条件下诱导9>

发酵液在10000r/min、4℃下离心10min后，弃上清，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，加入15~20mL磷酸盐缓冲液使菌体悬浮，超声破碎15 min(功率22W，破碎1s，间歇2s)。在4℃、10000r/min条件下离心10min，收集上清液，即为粗酶液，用孔径0.22 μm水系膜过滤。

用Binding Buffer对Ni^{2>螯合琼脂糖树脂柱进行预平衡；加入粗酶液，分别用Binding Buffer和Washing Buffer平衡；用Elution Buffer将酶洗脱下来，回收；将回收的酶液在透析缓冲液中透析后于4℃冰箱保存。}

所涉及缓冲液配制：

磷酸盐缓冲液（PB）：50mmol/L，pH 5.5；

Binding Buffer：50mmol/L PB，500mmol/L NaCl，pH 7.0；

Washing Buffer：50mmol/L PB，500mmol/L NaCl，pH 7.0，50mmol/L 咪唑；

Elution Buffer：50mmol/L PB，500mmol/L NaCl，pH 7.0，500mmol/L 咪唑；

透析缓冲液：50mmol/L PB，pH 5.5，10mmol/L EDTA。

实施例4：野生酶及突变酶的最适pH和pH稳定性测定

最适pH：将预保存在pH 4.0~7.5缓冲液的野生酶及突变酶置于45℃水浴中，反应10min后立即煮沸终止反应。pH稳定性的研究：将相同浓度的野生酶及突变酶分别在pH为4.0~7.5的缓冲液中于4℃预保存12h，将pH调至5.5后，在45℃下进行酶反应，测其残余酶活。

得到的结果如附图2：突变酶与野生酶相比，有效pH作用范围拓宽并向中性偏移。如附图3：突变酶与野生酶相比，在偏中性的pH下保存更稳定。

序列表

<210>SEQ ID No.1

<211>408

<212>RNA

<213> 精氨酸脱亚胺酶突变体氨基酸序列

<400> 1

MET Ser His Pro IleAsn Val Phe Ser GluIle Gly Lys Leu Lys

5 10 15

Thr Va lMET Leu HisArg Pro Gly Lys GluLeu Glu Asn Leu MET

20 25 30

Pro Asp Tyr Leu GluArg Leu Leu Phe AspAsp Ile Pro Phe Leu

35 40 45

Glu Lys Ala Gln AlaGlu His Asp Ala PheAla Glu Leu Leu Arg

50 55 60

Ser Lys Asp Ile GluVal Val Tyr Leu GluAsp Leu Ala Ala Glu

65 70 75

Ala Leu Ile Asn GluGlu Val Arg Arg GlnPhe Ile Asp Gln Phe

80 85 90

Leu Glu Glu Ala AsnIle Arg Ser Glu SerAla Lys Glu Lys Val

95100105

Arg Glu Leu MET LeuGlu Ile Asp Asp AsnGlu Glu Leu Ile Gln

110115120

Lys Ala Ile Ala GlyIle Gln Lys Gln GluLeu Pro Lys Tyr Glu

125130135

Gln Glu Phe Leu ThrAsp MET Val Glu AlaAsp Tyr Pro Phe Ile

140145150

Ile Asp Pro MET ProAsn Leu Tyr Phe ThrArg Asp Asn Phe Ala

155160165

Thr MET Gly His GlyIle Ser Leu Asn HisMET Tyr Ser Val Thr

170175180

Arg Gln Arg Glu ThrIle Phe Gly Gln TyrIle Phe Asp Tyr His

185190195

Pro Arg Phe Ala GlyLys Glu Val Pro ArgVal Tyr Asp Arg Ser

200205210

Glu Ser Thr Arg IleGlu Gly Gly Asp GluLeu Ile Leu Ser Lys

215220225

Glu Val Val Ala IleGly Ile Ser Gln ArgThr Asp Ala Ala Ser

230235240

Ile Glu Lys Ile AlaArg Asn Ile Phe GluGln Lys Leu Gly Phe

245250255

Lys Asn Ile Leu AlaPhe Asp Ile Pro GluHis Arg Lys Phe MET

260265270

His Leu Asp Thr ValPhe Thr MET Ile AspTyr Asp Lys Phe Thr

275280285

Ile His Pro Glu IleGlu Gly Gly Leu ValVal Tyr Ser Ile Thr

290295300

Glu Lys Ala Asp GlyAsp Ile Gln Ile ThrLys Glu Lys Asp Thr

305310315

Leu Asp Asn Ile LeuCys Lys Tyr Leu HisLeu Asp Asn Val Gln

320325330

Leu Ile Arg Cys GlyAla Gly Asn Leu ThrAla Ala Ala Arg Glu

335340345

Gln Trp Asn Asp GlySer Asn Thr Leu AlaIle Ala Pro Gly Glu

350355360

Val Val Val Tyr AspArg Asn Thr Ile ThrAsn Lys Ala Leu Glu

365370375

Glu Ala Gly Val LysLeu Asn Tyr Ile ProGly Ser Glu Leu Val

380385390

Arg Gly Arg Gly GlyPro Arg Cys MET SerMET Pro Leu Tyr Arg

395400405

Glu Asp Leu***

408

<210>SEQ ID No.2

<211>1227

<212>DNA

<213> 精氨酸脱亚胺酶突变体核苷酸序列

<400> 2

ATGAGTCATC CAATTAATGT ATTTTCTGAA ATCGGAAAAT TGAAAACAGT GATGTTACAT60

CGTCCAGGTA AGGAATTAGA AAATTTAATG CCAGATTATC TGGAGAGACT GTTGTTTGAT 120

GATATTCCGT TTTTAGAAAA AGCACAAGCA GAACATGATG CATTTGCAGA GTTGTTACGA 180

TCAAAAGATA TCGAAGTGGT CTATTTAGAG GACTTAGCTG CTGAAGCGTT GATTAATGAA 240

GAGGTCCGCC GACAATTTAT TGACCAATTC TTAGAAGAAG CCAATATTCG CAGCGAATCA 300

GCAAAAGAAA AAGTTAGAGA GTTAATGTTA GAAATTGACG ACAACGAAGA ACTGATTCAA 360

AAAGCGATTG CTGGCATTCA AAAACAAGAA TTACCTAAAT ATGAGCAAGA ATTTTTAACA 420

GATATGGTTG AAGCGGATTA TCCATTCATT ATTGATCCAA TGCCTAACTT ATACTTCACA 480

CGTGATAACT TTGCGACAAT GGGCCACGGG ATTTCTTTAA ATCATATGTA TTCAGTAACT 540

CGACAACGGG AAACCATTTT TGGGCAATAC ATTTTTGATT ATCATCCTCG TTTTGCTGGA 600

AAAGAGGTTC CTAGAGTCTA TGATCGTTCA GAATCAACCA GAATTGAAGG TGGCGATGAA 660

TTAATTCTTT CAAAAGAAGT GGTGGCCATT GGGATTTCTC AAAGAACGGA CGCCGCGTCA 720

ATTGAAAAAA TTGCGAGAAA TATTTTTGAA CAAAAATTAG GATTCAAAAA TATCTTGGCT 780

TTTGATATCC CTGAACATCG TAAATTCATG CATTTAGATA CCGTTTTTAC CATGATTGAC 840

TATGATAAAT TTACGATTCA TCCAGAAATC GAAGGCGGCT TGGTTGTTTA CTCGATCACT 900

GAAAAAGCAG ATGGAGACAT CCAAATTACA AAAGAAAAAG ATACATTAGA TAACATTTTA 960

TGCAAATACT TGCATTTAGA CAATGTTCAA TTAATCCGTT GCGGCGCTGG AAATTTAACC1020

GCAGCAGCCC GGGAACAATG GAACGACGGT TCAAATACAT TAGCAATTGC CCCTGGGGAA1080

GTTGTTGTTT ACGATCGGAA TACGATTACG AATAAAGCGC TAGAAGAAGC AGGCGTGAAA1140

TTGAATTACA TTCCAGGAAG TGAACTAGTA CGTGGCCGTG GTGGCCCTCG TTGTATGAGT1200

ATGCCACTTT ACCGTGAAGA TCTTTAA1227

<210>SEQ ID No.3

<211>408

<212>RNA

<213> 野生精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列

<400> 1

MET Ser His Pro IleAsn Val Phe Ser GluIle Gly Lys Leu Lys

5 10 15

Thr Val MET Leu HisArg Pro Gly Lys GluLeu Glu Asn Leu MET

20 25 30

Pro Asp Tyr Leu GluArg Leu Leu Phe AspAsp Ile Pro Phe Leu

35 40 45

Glu Lys Ala Gln AlaGlu His Asp Ala PheAla Glu Leu Leu Arg

50 55 60

Ser Lys Asp Ile GluVal Val Tyr Leu GluAsp Leu Ala Ala Glu

65 70 75

Ala Leu Ile Asn GluGlu Val Arg Arg GlnPhe Ile Asp Gln Phe

80 85 90

Leu Glu Glu Ala AsnIle Arg Ser Glu SerAla Lys Glu Lys Val

95100105

Arg Glu Leu MET LeuGlu Ile Asp Asp AsnGlu Glu Leu Ile Gln

110115120

Lys Ala Ile Ala GlyIle Gln Lys Gln GluLeu Pro Lys Tyr Glu

125130135

Gln Glu Phe Leu ThrAsp MET Val Glu AlaAsp Tyr Pro Phe Ile

140145150

Ile Asp Pro MET ProAsn Leu Tyr Phe ThrArg Asp Asn Phe Ala

155160165

Thr MET Gly His GlyIle Ser Leu Asn HisMET Tyr Ser Val Thr

170175180

Arg Gln Arg Glu ThrIle Phe Gly Gln TyrIle Phe Asp Tyr His

185190195

Pro Arg Phe Ala GlyLys Glu Val Pro ArgVal Tyr Asp Arg Ser

200205210

Glu Ser Thr Arg IleGlu Gly Gly Asp GluLeu Ile Leu Ser Lys

215220225

Glu Val Val Ala IleGly Ile Ser Gln ArgThr Asp Ala Ala Ser

230235240

Ile Glu Lys Ile AlaArg Asn Ile Phe GluGln Lys Leu Gly Phe

245250255

Lys Asn Ile Leu AlaPhe Asp Ile Gly GluHis Arg Lys Phe MET

260265270

His Leu Asp Thr ValPhe Thr MET Ile AspTyr Asp Lys Phe Thr

275280285

Ile His Pro Glu IleGlu Gly Gly Leu ValVal Tyr Ser Ile Thr

290295300

Glu Lys Ala Asp GlyAsp Ile Gln Ile ThrLys Glu Lys Asp Thr

305310315

Leu Asp Asn Ile LeuCys Lys Tyr Leu HisLeu Asp Asn Val Gln

320325330

Leu Ile Arg Cys GlyAla Gly Asn Leu ThrAla Ala Ala Arg Glu

335340345

Gln Trp Asn Asp GlySer Asn Thr Leu AlaIle Ala Pro Gly Glu

350355360

Val Val Val Tyr AspArg Asn Thr Ile ThrAsn Lys Ala Leu Glu

365370375

Glu Ala Gly Val LysLeu Asn Tyr Ile ProGly Ser Glu Leu Val

380385390

Arg Gly Arg Gly GlyPro Arg Cys MET SerMET Pro Leu Tyr Arg

395400405

Glu Asp Leu***

408

<210>SEQ ID No.4

<211>1227

<212>DNA

<213> 野生精氨酸脱亚胺酶突变体氨基酸序列

<400> 1

ATGAGTCATC CAATTAATGT ATTTTCTGAA ATCGGGAAAT TGAAAACAGT GATGTTACAT60

CGTCCAGGTA AGGAATTAGA AAATTTAATG CCAGATTATC TGGAGAGACT GTTGTTTGAT 120

GATATTCCGT TTTTAGAAAA AGCACAAGCA GAACATGATG CATTTGCAGA GTTGTTACGA 180

TCAAAAGATA TCGAAGTGGT CTATTTAGAG GACTTAGCTG CTGAAGCGTT GATTAATGAA 240

GAGGTCCGCC GACAATTTAT TGACCAATTC TTAGAAGAAG CCAATATTCG CAGTGAATCA 300

GCAAAAGAAA AAGTTAGAGA GTTAATGTTA GAAATTGACG ACAACGAAGA ACTTATTCAA 360

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CGTGATAACT TTGCGACAAT GGGCCACGGG ATTTCTTTAA ATCATATGTA TTCAGTAACT 540

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TTAATTCTTT CAAAAGAAGT GGTGGCCATT GGGATTTCTC AAAGAACGGA CGCCGCGTCA 720

ATTGAAAAAA TTGCGAGAAA TATTTTTGAA CAAAAATTAG GATTCAAAAA TATCTTGGCT 780

TTTGATATCG GTGAACATCG TAAATTCATG CATTTAGATA CCGTTTTTAC CATGATTGAC 840

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GAAAAAGCAG ATGGAGACAT CCAAATTACA AAAGAAAAAG ATACATTAGA TAACATTTTA 960

TGCAAATACT TGCATTTAGA CAATGTTCAA CTAATCCGTT GCGGCGCTGG AAATTTAACA1020

GCAGCAGCCC GTGAACAATG GAACGACGGT TCAAATACAT TAGCAATTGC CCCTGGGGAA1080

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TTGAATTACA TTCCAGGAAG TGAACTAGTA CGTGGCCGTG GTGGCCCTCG TTGTATGAGT1200

ATGCCACTTT ACCGTGAAGA TCTTTAA1227

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