甲基包囊菌及其在选择性拆分制备(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸盐上的应用

摘要

本发明公开了甲基包囊菌及其在立体选择性拆分制备(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸盐上的应用，对产酶的甲基包囊菌进行细胞固定化后，应用于生物拆分外消旋体(R，S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸乙酯制备高光学纯(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸乙酯，进一步通过水解反应获得(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸盐。本发明实现转化产率最高可达50.0％以上，立体选择性好，(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸乙酯对映体过量值e.e.

说明书

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，具体地说涉及甲基包囊菌及其在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用。

背景技术

左乙拉西坦(Levetiracetam)化学名称为(S)-α-乙基-2-氧合-1-乙酰胺吡咯烷，是一种乙酰吡咯烷类化合物的新型抗癫痈药物。该药不仅治疗指数很高，而且药动学特征独特，口服吸收快且安全，生物利用度可达100％，是一种高效、毒副作用小的广谱抗癫痫药，具有极高的开发价值。文献报道，右旋体(R)-α-乙基-2-氧合-1-乙酰胺吡咯烷对于抑制癫痫发作只有轻微或者不明显的药效作用，而左乙拉西坦则是一种安全、高效的抗癫痫药物。

左乙拉西坦合成的关键是在反应过程中控制左旋体的光学纯度。(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯经酯水解可获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，该构型的酸是合成左乙拉西坦的关键手性中间体，其结构式如下：

单一对映异构体可以由化学、酶法或者化学-酶法等制备。早期文献介绍了左乙拉西坦的制备工艺：将外消旋的左乙拉西坦中间体(±)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸与光学纯的拆分试剂(R)-(+)-α-苯基乙胺或手性膦生成盐，再冷却结晶，将其分离出相应的2个对映体。在传统的对映体拆分过程中存在着能耗高、操作繁琐、收率较低、产物纯度较低、环境污染严重等问题，不利于制药企业节能减排。

与化学法相比，生物催化的优点是催化反应通常表现出高的立体选择性和区域选择性，且其催化条件温和，能耗低，效率高。中国专利“耐酪氨酸冢村氏菌及其催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸”(公开号CN 101748087A)公开了种耐酪氨酸冢村氏菌， 其可用于手性生物催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸中，该方法的产率达到48.1％，但其反应时间过长(12～60h)，反应底物浓度过低(外消旋底物浓度5.2～31.2g/L)，投酶量过大(湿菌体细胞5.2～31.2g/L)，难以实现工业化生产。中国专利申请“微生物催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法及菌株”(公开号CN102994429A)公开了一种蜡状芽孢杆菌，以外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯为底物，该菌产生的酯水解酶催化立体选择性水解(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯从而获取S构型产物的方法，该技术中底物最大投量只有100g/L，反应时间长达60h，最高产率为48.9％，应用于实现工业化生产较难。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种新的甲基包囊菌；本发明还有一个目的是提供前述甲基包囊菌在立体选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，以适用于工业大规模化生产；本发明还有一个目的是提供一种拆分效率高、易于放大生产的细胞固定化技术。

技术方案：对于所述的甲基包囊菌cxzy-L013(Methylopila sp.cxzy-L013)，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉大学，430072，保藏日期：2016年9月18日，保藏编号：CCTCC NO.：M2016494。

所述甲基包囊菌(Methylopila sp.cxzy-L013)是从浙江临海市杜桥镇华海药业厂区内土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，通过检测酶活性，比较立体选择性酯水解酶酶活力大小而获得。

该菌落的特征如下：菌落形态：在LB琼脂平板上30℃培养48～72h，菌落呈规则状圆形，边缘整齐，直径0.5～1mm，表面隆起，湿润，有光泽，乳白色；菌体呈短圆杆状，单个分散排列，大小为(0.3～0.4)μm×(1.0～1.2)μm；革兰氏阴性菌；在以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源的培养基上生长缓慢，以甲醇、甲胺盐酸盐、甲酸铵为碳源时生长较快。

本发明提供了利用前述甲基包囊菌在立体选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，同时也提供了所述甲基包囊菌立体选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐的方法，包括如下步骤：

(1)通过细胞固定化方法处理所述甲基包囊菌的菌液，获得固定化菌剂；

(2)以(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯为底物，加入一定量的水和所述固定化菌剂进行拆分反应，获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯；

(3)然后利用酶水解或碱水解获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐。

所述甲基包囊菌的菌液是将甲基包囊菌经斜面培养、种子液培养、接种发酵步骤获得的含有湿菌体不少于50wt％的含酶菌悬液。具体获得步骤如下：

斜面培养

将Methylopila sp.cxzy-L013甘油管菌株在LB斜面试管划线，30℃培养2～3天；

种子液培养

斜面菌体接种至种子培养基：30℃培养2～3天，获得种子液；所述种子培养基浓度组成为：MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>4)₂SO₄>

接种发酵

种子液接种至发酵罐发酵：接种量为1～10v/v％，发酵温度30℃，氨水控制pH6.5～7.0，通气量：0.5～1vvm，机械搅拌100～1000r/min，发酵过程间歇补加75％的甲醇浓度为5.0mL/L，发酵时长3～4天，当pH不降反升时即可放罐收集菌体；此时OD600≥40，菌体湿重可达70～90g/L。

所述发酵培养基浓度组成：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>4)₂SO₄>

本发明在接种培养中培养基的碳源可选用包括但不限于甲醇、甲胺盐酸盐、甲酸铵的任意一种，优选甲醇。如改用葡萄糖、甘油、乙醇作为碳源时，菌体生长非常缓慢。

为获得不少于50wt％的含酶菌悬液，将发酵液经高速离心机离心分离后获得含酶湿菌体，按等质量比例将湿菌体与水稀释搅匀，冷藏待用；或直接将发酵液经微滤膜浓缩至含湿菌体质量分数约为50wt％的菌悬液，冷藏待用。

所述细胞固定化方法是将甲基包囊菌的菌液溶于缓冲液中，至少加入一种吸附剂和/或一种交联剂，搅拌、抽滤获得固定化菌剂；所述吸附剂选自硅藻土、活性炭的任意一种；所述交联剂选自戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺的任意一种。利用该固定化方法实现的固定化酶的酶活回收率不低于90％，吸附率不低于95％，固定化菌剂可重复利用次数不低于35次。

细胞或酶固定化后的酶活回收率计算公式为：

A＝W₀/(W₁-W₂)*100％

式中：A为固定化酶的酶活回收率，W₁为加入游离酶的总活力，W₂为固定化后上清液的总酶活力，W₀为固定化酶的总酶活力。

细胞或酶固定化后的吸附率计算公式为：

B＝(W₁-W₂)/W₁*100％

式中：B为固定化酶的吸附率，W₁为加入游离酶的总活力，W₂为固定化后上清液的酶活力。

在细胞固定化技术中，包埋法、交联法、吸附法、共价固定法是常用的技术手段，包埋法一般使用海藻酸钠、卡拉胶等对细胞或酶进行包埋，但包埋后的固定化颗粒机械强度较小，在搅拌过程中容易破碎。吸附法操作简便，易实现固定化，条件温和固定化载体廉价易得，且可以重复利用，但是吸附的酶或细胞数量有限且与载体之间的结合能力较弱，易脱落，导致活力下降并污染反应产物。共价结合法中酶的氨基、羧基、酚基、巯基、羟基、咪唑基等功能基团可以参与共价结合，其中以氨基和羧基的结合法最为常见，通常该方法得到的固定化酶中酶与载体之间结合牢固不易发生酶脱落现象，但是酶蛋白高级结构易在比较剧烈的反应条件下遭到破坏。交联法制备的固定化细胞或酶稳定性良好，可使用时间长；戊二醛是最常见的交联剂，它是通过具有双功能醛基的小分子物质能够与细胞或酶上的官能团氨基发生席夫碱反应，将细胞或酶交联进而达到稳定细胞或酶结构的目的，但单一使用交联法的固定化细胞疏松度较差，难以解决催化反应过程中固定化细胞与反应液的有效分离。

作为本发明的进一步优化，所述细胞固定化方法是先加入吸附剂，搅拌混合均匀后再加入交联剂。先利用吸附法形成包埋小球，再通过交联法联合，可显著增大机械强度和提高其稳定性。

作为本发明的更进一步优化，所述交联剂加入时还加入了聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺具有高附着性和吸附性，其胺基能与细胞或酶分子中的羟基反应生成氢键，与羧基反应生成离子键，还也能与碳酰基反应生成共价键；同时，由于具有极性基团(胺基)和疏水基(乙烯基)构造，能够与不同的物质相结合。

作为本发明的最优方案，细胞固定化的步骤是：将含湿菌体质量分数约为50％的菌悬液20g溶于100mL甲酸铵缓冲液(pH为7.0)，搅拌混合均匀，加0.6g硅藻土或活 性炭，加入5％聚乙烯亚胺3mL交联1小时，再加25％戊二醛1mL交联1小时，最后经真空抽滤得到固定化菌剂，用自来水洗涤2次并抽滤，置于4℃冷藏保存。

通过联合使用戊二醛和聚乙烯亚胺，戊二醛的醛基与聚乙烯亚胺的氨基聚合形成致密网状结构将菌体细胞包裹；硅藻土的添加有助于吸附作用，同时增加了固定化酶的颗粒度和疏松度，使固定化后的颗粒更易分离。

利用上述细胞固定化方法获得的固定化菌剂对外消旋体底物进行拆分，可使底物浓度大大增加，使工业化大批量生产成为可能。所述(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯为500～900g/L的甲苯溶液，优选浓度在700～800g/L。

所述步骤2中拆分反应的条件是：反应温度为25～37℃，滴加15～25v/v％的碳酸钠水溶液控制反应过程pH 6.5～8.5，反应2～15小时。

进一步地，(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯在反应体系中的质量浓度为160～500g/L。所述固定化菌剂以湿重计，在反应体系中的投量浓度为5～25g/L。

拆分反应结束后，利用HPLC检测反应转化结果，对映体过量值e.e._s(％)不小于99.5，转化率不低于49％。

拆分反应后的混合液分离纯化方法为：将反应液直接用高速离心机离心或板式过滤机过滤，液体部分分层后保留有机相，水层中加入1∶0.3～1.5的甲苯进行3～5次萃取，合并有机相，35～60℃蒸出甲苯，获得浓缩物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯。

作为本发明的进一步优化，步骤(2)之后回收水相中的(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，经消旋化和成酯化后获得起始底物原料。

对于获得的(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯，可再次通过固定化酯水解酶酶水解方法获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的盐：向反应器中分别添加1份工业用水和1～2份(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的浓缩物，加入1/20～1/5份酯水解酶，搅拌，控制温度和pH，直至酯水解反应结束，滤出固定化酯水解酶获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的盐溶液，再经浓缩结晶制得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐的固体粗品。

所述酯水解酶选用本领域技术人员熟知的现有酯水解酶，优选适用于稳定水解(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的酶，并在该酶的最适温度和pH下反应，获得的盐溶液再经浓缩制晶。该酯水解酶的固定化方法包括但不限于使用现有的包埋法、交联法、共价固定法、吸附法的任意一种，根据本领域技术人员掌握的知识和现有技术的教导可选择性地使用。对酯水解酶进行固定化的目的是使获得的水解物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯 烷乙酸盐所含杂质更少，并且更有利于分离粗品，可提高一次粗品收率和纯度。

对于获得的(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯，还可通过碱水解方法获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的盐：向反应器中分别添加2～3份去离子水和2～3份(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的浓缩物，搅拌，再加入1～2份200～400g/L的离子膜碱液使反应pH不小于13，10～20℃水解1～5h，直至底物水解反应结束，获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的盐溶液，再经浓缩结晶制得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐的固体粗品。

本发明还提供了一种细胞固定化菌剂，利用该菌剂可将(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯从其外消旋体溶液中拆分出来，所述细胞固定化菌剂的酶活回收率不低于90％，吸附率不低于95％，固定化菌剂可重复利用次数不低于35次；该菌剂是通过如下方法获得的：

将如权利要求1所述甲基包囊菌的菌液溶于缓冲液中，至少加入一种吸附剂和/或一种交联剂，搅拌、抽滤获得固定化菌剂；所述吸附剂选自硅藻土、活性炭的任意一种；所述交联剂选自戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺的任意一种。

优选地，通过联合使用吸附法和交联法进行细胞固定，可有效提高固定化酶的酶活回收率和吸附率。

更进一步地，在加入吸附剂后，先加入聚乙烯亚胺，再加入交联剂；所述吸附剂选用硅藻土，交联剂选用戊二醛。

本发明本发明将Methylopila sp.cxzy-L013菌种发酵的产酶菌体细胞进行固定化，并利用该固定化菌剂对外消旋底物(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯在一定条件下进行立体选择性酯水解反应，实现转化产率最高可达50.0％以上，立体选择性好，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯对映体过量值e.e._s(％)不小于99.5；催化效率高，拆分反应中的外消旋底物浓度最高可达500g/L，反应时间不超过15小时，细胞固定化后重复利用次数不低于35次，易于工业化生产，下游分离简单，环境污染小。

附图说明

图1为(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的出峰图谱；

图2为外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的出峰图谱；

图3为催化拆分外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯3h的有机相HPLC图谱；

图4为催化拆分外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯3h的水相HPLC图谱；

图5为催化拆分外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯结束时的有机相HPLC图谱；

图6为催化拆分外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯结束时的水相HPLC图谱；

图7为试验例3中反应时长随着酶使用次数的变化趋势图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，需要说明的是，在未进行特殊说明的情况下，下文所述百分比浓度都为质量百分比浓度。

实施例1

甲基包囊菌cxzy-L013(Methylopila sp.cxzy-L013)，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉大学，430072，保藏日期：2016年9月18日，保藏编号：CCTCC NO.：M2016494。

甲基包囊菌Methylopila sp.cxzy-L013是从浙江临海市杜桥镇华海药业厂区内土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，通过检测酶活性，比较立体选择性酯水解酶酶活力大小而获得。

该菌落的特征如下：菌落形态：在LB琼脂平板上30℃培养48～72h，菌落呈规则状圆形，边缘整齐，直径0.5～1mm，表面隆起，湿润，有光泽，乳白色；菌体呈短圆杆状，单个分散排列，大小为(0.3～0.4)μm×(1.0～1.2)μm；革兰氏阴性菌；在以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源的培养基上生长缓慢，以甲醇、甲胺盐酸盐、甲酸铵为碳源时生长较快。

实施例2

对于实施例1获得的甲基包囊菌，应当进一步活化培养，以进行发酵获得甲基包囊菌的菌液。具体获得步骤如下：

斜面培养

将Methylopila sp.cxzy-L013甘油管菌株在LB斜面试管划线，30℃培养2～3天；

种子液培养

斜面菌体接种至种子培养基：30℃培养2～3天，获得种子液；种子培养基浓度组成为：MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>4)₂SO₄>

接种发酵

种子液接种至7L发酵罐发酵：接种量为100mL，发酵液初始体积为5L，发酵温度30℃，氨水控制pH6.5～7.0，通气量：0.5vvm，将机械搅拌从100r/min逐渐增加至900r/min使DO≥30％，发酵过程间歇补加75％的甲醇浓度为5.0mL/L，发酵3天，当pH不降反升时即可放罐收集菌体；此时OD600≥40，菌体湿重可达70～90g/L。

发酵培养基浓度组成：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>4)₂SO₄>

如表1所示，若将发酵过程中所使用的甲醇改用葡萄糖、甘油、乙醇作为碳源时，菌体生长非常缓慢，可见甲醇作为碳源显著优于其他三种碳源。所用的培养基配方除碳源外其余均与种子液培养基配方相同，培养方法也与种子液培养相同。

表1不同碳源在菌液发酵时的效果

碳源种类 碳源浓度 发酵方式 菌体浓度OD₆₀₀体积分数为75％的甲醇 5.0mL/L 摇瓶发酵 5±0.5 葡萄糖 5g/L 摇瓶发酵 2±0.5 甘油 5g/L 摇瓶发酵 1±0.5 体积分数为75％的乙醇 5.0mL/L 摇瓶发酵 2±0.5

如表2所示，若将发酵培养基中的酵母浸出粉改用玉米浆干粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏等作为碳源时，菌体生长速度一般，酵母浸出粉优于其他三种氮源。所用的培养基配方除氮源外其余均与种子液培养基配方相同，培养方法也与种子液培养相同。

表2不同碳源在作为菌液发酵培养基碳源的效果

碳源种类 碳源浓度 发酵方式 菌体浓度OD₆₀₀酵母浸出粉 6g/L 摇瓶发酵 5±0.5 玉米浆干粉 6g/L 摇瓶发酵 3.5±0.5 牛肉浸膏 6g/L 摇瓶发酵 2±0.5 胰蛋白胨 6g/L 摇瓶发酵 2.5±0.5

为获得不少于50wt％的含酶菌悬液，将发酵液经高速离心机离心分离后获得含酶 湿菌体，按等质量比例将湿菌体与水稀释搅匀，冷藏待用；或直接将发酵液经微滤膜浓缩至含湿菌体质量分数约为50％的菌悬液，冷藏待用。

实施例3

利用实施例1甲基包囊菌立体选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐，包括如下步骤：

(1)通过细胞固定化方法处理甲基包囊菌的菌液，获得固定化菌剂；甲基包囊菌的菌液获得方式在实施例2中已阐述。

(2)以(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯为底物，加入一定量的水和固定化菌剂进行拆分反应，获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯；

(3)利用酶水解或碱水解获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐。

(4)步骤(2)之后回收水相中的(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，经消旋化和成酯化后获得起始底物原料。

其中，步骤(1)细胞固定化方法是先加入吸附剂，搅拌混合均匀后再加入交联剂。先利用吸附法形成包埋小球，再通过交联法联合，可显著增大机械强度。细胞固定化方法实现的固定化酶的酶活回收率不低于90％，吸附率不低于95％，固定化菌剂可重复利用次数不低于35次。

步骤(2)中，(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯为500～900g/L的甲苯溶液，优选浓度为700～800g/L。(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯在反应体系中的质量浓度为160～500g/L。固定化菌剂以湿重计，在反应体系中的投量浓度为5～25g/L。

拆分反应的条件：反应温度为25～37℃，滴加体积分数为15～25％的碳酸钠(V/V)水溶液控制反应过程pH 6.5～8.5，反应2～15h，利用HPLC检测反应转化结果，对映体过量值e.e._s(％)不小于99.5，转化率最高为50％。

拆分反应后的混合液分离纯化方法为：将反应液直接用高速离心机离心或板式过滤机过滤，液体部分分层后保留有机相，水层中加入1∶0.3～1.5的甲苯进行3～5次萃取，合并有机相，35～60℃蒸出甲苯，获得浓缩物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯。

步骤(3)中任何能水解(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯酯键的酯水解酶都可以使用。向反应器中分别添加1份工业用水和1～2份(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的浓缩物，加入1/20～1/5份酯水解酶，搅拌，控制温度和pH，直至酯水解反应结束，滤出 酯水解酶获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的盐溶液，再经浓缩结晶制得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐的固体粗品。

步骤(3)中对于获得的(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯，还可通过碱水解方法获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的盐：向反应器中分别添加2～3份去离子水和2～3份(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的浓缩物，搅拌，再加入1～2份300g/L的离子膜碱液使pH达到14，10～20℃水解1～5h，直至底物水解反应结束，获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的盐溶液，再经浓缩结晶制得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐的固体粗品。

实施例4

本实施例基于实施例3进一步优化了步骤(1)中细胞固定化方法的步骤：以含湿菌体质量分数为50％的菌悬液20g溶于100mL甲酸铵缓冲液(pH为7.0)进行反应为优选例，搅拌混合均匀，加0.4～0.8g硅藻土或活性炭，加5％聚乙烯亚胺3～4.5mL交联1h，再加25％戊二醛1～1.5mL交联1h，最后真空抽滤得到固定化菌剂，用自来水洗涤2次并抽滤，置于4℃冷藏保存。固定化酶的酶活回收率≥90％，吸附率≥95％。

实施例5

本实施例基于实施例3的方法，选用日本天野酶制剂公司的Protin AP Conc.脂肪酶作为酯水解酶获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐。

将上述酯水解酶粉末2g溶于于100mL纯化水中，加入海藻酸钠2g，缓慢搅拌直至完全溶解，将混合液用针头或喷头均匀泵入100mM的氯化钙溶液中，并缓慢搅拌，待珠状凝胶硬化后用蒸馏水反复洗涤2～3次，得到海藻酸钙固定化酶，置于4℃保存待用。

实施例6

一种细胞固定化菌剂，利用该菌剂可将(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯从其外消旋体溶液中拆分出来，固定化酶的酶活回收率不低于90％，吸附率不低于95％，固定化菌剂可重复利用次数不低于35次；是通过如下方法获得的：

将实施例2所述的甲基包囊菌(Methylopila sp.cxzy-L013)的菌液溶于缓冲液中，至少加入硅藻土作为吸附剂，然后加入聚乙烯亚胺，再加入戊二醛作为交联剂，搅拌获得 固定化细胞溶液。真空抽滤获得所述固定化菌剂。具体方法参照实施例4所述。

实施例7

本实施例基于实施例3进一步描述步骤(2)中(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯拆分的步骤：

以300mL催化反应体系为例：(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯浓度约为500g/L的甲苯溶液100mL，按照实施例4和实施例6的方法制备细胞固定化菌剂。

具体为：在500mL的转化瓶中加水200mL，加入约含50g的(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯甲苯溶液100mL，使(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯在反应体系中的初始浓度约为166g/L，开启搅拌，用Na₂CO₃溶液(20％，V/V)将pH调至7.0，加入实施例6制备细胞固定化菌剂2g，使固定化菌剂投量浓度为6.6g/L，37℃，用Na₂CO₃溶液(20％，V/V)将pH维持在7.0～7.5，拆分反应2～3h。利用HPLC检测反应转化结果，对映体过量值为99.8e.e._s(％)，转化率为50.0％。

实施例8～实施例13

实施例8～实施例13的拆分方法与实施例7基本相同，但细胞固定化菌剂的投量、所用底物在甲苯溶液中的浓度、底物在反应体系中的浓度不同，从表3可以看出不同实施例拆分效果的差异。

表3生物催化拆分底物(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯结果

基于实施例8～实施例13可知：当底物的甲苯溶液投量较多时，反应时间较长，转 化率有所下降；底物在甲苯溶液中的浓度越高，且在反应体系中的投量越大，反应会有所延长，可通过适当增加固定化菌剂投量的方法，使转化率仍可以达到理想效果。

试验例1拆分反应液监测

仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器

色谱柱：CHIRALPAK AS-H 250×4.6mm 5μm

流动相∶正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝80∶20∶0.2(％V/V/V)

流速：0.8mL/min，波长：210nm，柱温：30℃，运行时间：30min，进样量：20μL

稀释液：流动相，空白溶液：稀释液

供试品溶液：称取20mg供试品置于10mL容量瓶中，用稀释液溶解，定容。供试品包括：外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯及其单体，外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸及其单体。

样品处理：基于实施例4的方法步骤，取反应液稀释100倍，混匀后用0.45μm的微孔滤膜过滤，待进样。

(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯对映体过量值e.e.和底物转化率C按以下公式计算：

式中，[C]_S和[C]_R分别为色谱测得样品中底物S和R型的含量，e.e._s(％)为拆分反应的(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的对映体过量值，C_P为产物的摩尔浓度，C_S为剩余底物摩尔浓度，C(％)为转化率。

从图1至图6可以看出，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯出峰时间为9.4min，(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯出峰时间为15.9min，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸出峰时间为11.5min，(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸出峰时间为10.4min。

图5是催化拆分外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯结束时的HPLC有机相图谱，可以看出，(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯已经水解完全。

试验例2固定化方法的比较

本发明在固定化方法中同时使用吸附剂和交联剂，以聚乙烯亚胺配合戊二醛提高交联效果，细胞的固定效果得到了显著提升，进而再与高浓度有机底物参与酶催化反应时，易于实现工业化生产目的。

固定化对象：实施例2中Methylopila sp.cxzy-L013菌种发酵后的菌体细胞和菌体细胞经超声波破碎获得的酶液。

首先，本试验例分别就吸附法、包埋法以及吸附-交联法的使用进行了对比，并阐述了菌液处理方法不同所造成的细胞中酶的固定效果的差异，结果如表4所示：

表4不同固定方法和菌液处理方法对固定效果的影响

其次，针对试验组D，分别再对吸附剂(硅藻土或活性炭)和交联剂的投加量进行固定化优化实验，结果如表5所示：

表5不同固定方法和菌液处理方法对固定效果的影响

试验例3细胞固定化重复使用次数验证

验证方法：用5g实施例4获得的固定化菌剂催化100mL外消旋(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯，该外消旋底物在甲苯中的含量为500g/L，反应体系为300mL，以消耗30mL Na₂CO₃溶液(20％，V/V)为反应终点，对反应结束后的固定化菌剂进行抽滤，将抽滤后的固定化菌剂投入相同体系，并在相同反应条件进行下一次反应。

图7为随着使用次数增加反应结束所需时间的变化趋势图，从图中可以看出第1次反应结束需要1.2h，此后反应时长逐渐增加，第7次为2.6h，但第8次反应时长又开始降低，考虑到由于酶重复抽滤以及使用重量会有损耗，第12次后整体反应耗时呈上升趋势，但细胞固定化菌剂使用了36次后反应时长基本维持在5h内，效果理想，达到预期。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。