人参皂苷M1用于治疗IGA肾炎之用途

摘要

本发明提供一种治疗患有IgA肾炎(IgAN)之个体的方法，其包含投予该个体有效量之人参皂苷M1，以治疗该个体。

说明书

相关申请案

本申请案主张2014年11月3日申请之美国临时申请案第62/074,247号之优先权，其内容在此全部并入作为参考资料。

技术领域

本发明有关人参皂苷M1用于治疗IgA肾炎(IgAN)之新颖用途。

背景技术

IgA肾炎(IgAN)是一种目前世界上最常见的肾小球肾炎(GN)，IgAN发病可能会引起上呼吸道感染[1,2]。在大多数情况，C3和其他类型的免疫球蛋白被侦测到和IgA有类似的沉积情形。在最常见的组织病理学上改变包括伴随增生细胞和胞外基质的肾小球系膜区域的局部或弥漫性扩张[3]。此外，在病患身上可以看到各种更严重的损伤，包含弥漫性微血管管内增生、节段型硬化症、节段型坏死、细胞新月体形成[4,5]。活性氧化物质(ROS)已经被报导在广大范围的人类及实验的肾小球病变(包含IgAN)之发展上扮演很重要的致病角色[6-8]。虽然IgAN被认为是一种经由IgA-免疫复合体(IgA-IC)肾小球损伤所造成的免疫复合体疾病，真正造成疾病的原因和发病机转仍然是未知的。

虽然糖皮质类固醇已经被用于治疗部分IgAN患者，其防护IgAN肾脏功能恶化的功效仍然不确定，且长期使用这类药品会因为潜在无法控制的免疫抑制效果导致严重的副作用[9-11]。

人参皂苷是人参之主要成分，已知具有多种药理学活性，例如，抗肿瘤、抗糖尿病、抗疲劳、抗过敏及抗氧化活性。人参皂苷类具有相同的基础结构，其系由具17个碳原子排成四个环的甾烷类固醇核心(gonane steroid nucleus)组成。人参皂苷会在体内代谢，近来许多研究指出，在体内易吸收而作为活性成分的是人参皂苷代谢物而非天然存在之人参皂苷。其中，人参皂苷M1已知为原人参二醇型(protopanaxadiol-type)人参皂苷代谢物之一，其系经由人体肠道细菌之绞股蓝皂苷(gypenoside)途径生成。迄今，尚未有前案报导人参皂苷M1于IgAN的治疗功效。

发明内容

本发明不可预期地发现，人参皂苷M1可有效减轻IgA肾炎(IgAN)之症状。因此，本发明提供一种于个体治疗IgAN之新颖方法。

具体而言，本发明提供一种治疗罹患IgAN之个体的方法，包含将有效量之人参皂苷M1投予至该个体。

特定而言，本发明之方法系于个体有效降低IgAN之一或多种症状，该症状系选自于由以下所组成之群组：(1)于肾小球：内在细胞增生，包含系膜细胞增生、新月体形成、嗜中性白血球浸润、及节段型硬化症；以及(2)于肾小管间质腔室：间质(尤其是肾小球周围)单核白血球发炎、纤维化、及肾小管萎缩伴随蛋白质圆柱。此外，本发明之方法系于个体有效降低蛋白尿或血尿，或降低血清尿素氮的量或血清肌酸酐的量。

在部分具体实施例，人参皂苷M1系以肠外或肠内的路径投予。

在部份具体实施例中，人参皂苷M1结合一或多种已知用于治疗IgAN之治疗药剂而投予，包括但不限于，皮质类固醇(如肾上腺皮质酮)、非类固醇消炎药物(non-steriodal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、细胞毒性药物(如环磷酰胺、氯芥苯丁酸、及硫唑嘌呤)、免疫抑制剂(如环孢素及霉酚酸酯)、及血管扩张剂(如血管紧张素转化酶抑制剂)

本发明亦提供一种人参皂苷M1用于制造供治疗IgAN之药物的用途。

本发明之一或多个具体实施例之详述系列于下方之说明中。本发明之其他特征或优势可由下列数个具体实施例之详细说明及所附之主张而更臻清楚。

附图说明

欲说明本发明，图式具体实施例如下。然而，应理解到，本发明未局限于所示之较佳具体实施例。在图式中：

图1显示LCHK168对尿蛋白的效果。尿蛋白量随时间变化的研究(尿蛋白对血清肌酸酐[Cr]的比例)。**p<0.01、***p<0.005。

图2显示藉由LCHK168治疗增进IgA肾炎(IgAN)小鼠模型的肾功能。(A)血清中血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)量。(B)血清肌酸酐(Cr)量。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005。

图3显示藉由LCHK168治疗改善IgA肾炎(IgAN)小鼠模型中严重肾脏组织病理学特征。(A)以H&E染色法进行之肾脏组织病理学评估。原始放大倍率为400X。(B)受所示参数影响的肾小球的百分比之评分。**p<0.01、***p<0.005，“#”未测得数据。

图4显示LCHK168对T细胞浸润的影响。在以LCHK168治疗之IgAN小鼠，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组。对肾脏组织进行染色(A)CD3⁺T细胞。(B)在肾小球和周围肾小球中的被染色细胞之评分。原始放大倍率为400X。**p<0.01、***p<0.005，“#”未测得数据。

图5显示LCHK168对单核球/巨噬细胞浸润的影响。在以LCHK168治疗之IgAN小鼠，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组。对肾脏组织进行染色(A)F4/80⁺单核球/巨噬细胞。(B)在肾小球和周围肾小球中的被染色细胞之评分。原始放大倍率为400X。*p<0.05、***p<0.005，“#”未测得数据。

图6显示LCHK168对Th细胞浸润的影响。在以LCHK168治疗之IgAN小鼠，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组。对肾脏组织进行染色(A)CD4⁺T细胞。(B)在肾小球和周围肾小球中的被染色细胞之评分。原始放大倍率为400X。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005，“#”未测得数据。

图7显示LCHK168对Tc细胞浸润的影响。在以LCHK168治疗之IgAN小鼠，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组。对肾脏组织进行染色(A)CD8⁺T细胞。(B)在肾小球和周围肾小球中的被染色细胞之评分。原始放大倍率为400X。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005，“#”未测得数据。

图8显示LCHK168对树突细胞浸润的影响。在以LCHK168治疗之IgAN小鼠，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组。对肾脏组织进行染色(A)CD11c⁺T细胞。(B)在肾小球和周围肾小球中的被染色细胞之评分。原始放大倍率为400X。**p<0.01、***p<0.005，“#”未测得数据。

图9显示LCHK168对肾脏纤维化相关基因表现的影响。在以LCHK168治疗之IgAN小鼠，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组。(A)在治疗的第14、28天，藉由以肾脏组织的免疫组织化学染色法检测胶原蛋白IV。(B)在肾小球和周围肾小球中的被染色细胞之评分。原始放大倍率为400X。**p<0.01、***p<0.005。

图10显示LCHK168保护对抗IgA肾炎(IgAN)小鼠肾脏中活性氧化物质(ROS)的产生。在治疗的第14、28天，在来自以LCHK168治疗之IgAN小鼠的肾脏组织，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组，评估其超氧阴离子量(其系以相对发光单位[RLU]/15分钟/mg干重)分析。*p<0.05、***p<0.005。

图11显示流式细胞仪分析，以LCHK168治疗调节IgA肾炎(IgAN)小鼠之细胞免疫。在治疗的第14、28天，在以LCHK168治疗之IgAN小鼠，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组，评估其免疫反应，其系以记忆CD4⁺T细胞活性的程度分析。*p<0.05。

图12显示以LCHK168治疗减少IgA肾炎(IgAN)小鼠之肾脏TLR2mRNA量。在以LCHK168治疗之IgAN小鼠，比较以载剂治疗之疾病对照组及正常对照组，肾脏组织TLR2mRNA的表现量(相对于GADPH)是由及时反转录-聚合酶连锁反应测定。*p<0.05。

图13显示LCHK168减缓IgA-免疫复合体(IgA-IC)DCs成熟。在以LCHK168治疗具有IgA-IC的DCs，比较IgA-IC及模拟对照，藉由流式细胞仪测定(A)CD40、(B)CD80、以及(C)CD86的表现量。(D)表现CD40、CD80、以及CD86之树突状细胞的细胞群比例。

图14显示经IgA-IC刺激之DCs中NLRP3的活性受LCHK168降低。在以LCHK168治疗具有IgA-IC的DCs，比较IgA-IC及模拟对照，对于(A)NLRP3，以β-肌动蛋白作为装载对照之代表性西方墨点法，以及(B)NLRP3之半定量分析。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的技术性及科学性术语具有本发明领域之技术人员所能常规理解的意义。除非另有指明，本文所使用的下列术语具有赋予其之涵义。

本文所使用的冠词“一”与“一者”是指一个或多于一个(亦即，至少一者)之该冠词语法对象。举例而言，“一组件”是指一个组件或多于一个之组件。

本发明不可预期地发现，藉由投予至IgA小鼠人参皂苷M1可防止IgAN恶化。具体而言，本发明发现患有IgAN的动物表现出以下各种症状：(1)于肾小球：内在细胞增生，包含系膜细胞增生、新月体形成、嗜中性白血球浸润、及节段型硬化症；以及(2)于肾小管间质腔室：间质(尤其是肾小球周围)单核白血球发炎、纤维化、及肾小管萎缩伴随蛋白质圆柱、或蛋白尿或血尿、或异常升高的血清尿素氮量或血清肌酸酐量。

因此，本发明系提供一种治疗患有IgA肾炎之个体的方法，其包含投予该个体有效量之人参皂苷M1，以治疗该个体。本发明亦提供一种人参皂苷M1用于制造供在有需求之个体治疗IgAN之药物的用途。

本发明之方法有效用于改善IgAN病患的该等症状之任一者。

人参皂苷M1，即20-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)，为本领域习知之皂素代谢物之一。人参皂苷M1之化学结构如下：

人参皂苷M1已知为原人参二醇型人参皂苷之代谢物之一，其系经由人体肠道细菌之绞股蓝皂苷途径产生。人体服用人参后，可于血液或尿液中发现人参皂苷M1。人参皂苷M1可制备自人参植物，其系以本领域习知方法如真菌发酵方式进行，例如，中国台湾发明专利申请案第094116005号(I280982)及美国专利第7,932,057号，其全部内容在此列入本案以作为参考数据。在部分具体实施例中，用于制备人参皂苷M1的人参植物包括五加科(Araliaceae)、人参属(Panax genus)，如人参(P.ginseng)及假人参(P.pseudo-ginseng)(亦称作三七)。一般而言，人参皂苷M1之制备方法包括步骤：(a)提供人参植物材料(如叶或茎)的粉末；(b)提供真菌，以进行人参植物材料之发酵，其中发酵温度范围为20至50℃、发酵湿度范围为70至100％、pH值范围为4.0至6.0、及发酵时间范围为5至15天；(c)萃取及收集发酵产物；以及(d)自发酵产物分离20-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇。

在本发明中，当以“分离”或“纯化”描述人参皂苷M1时，其应理解为非绝对的分离或纯化，而是相对的分离或纯化。举例而言，纯化的人参皂苷M1是指相较于其天然存在形式而言，纯度更高。在一具体实施例中，含有纯化的人参皂苷M1的制剂可包含的人参皂苷M1之含量为总制剂的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％(w/w)。应理解的是，当以某数字显示比例或剂量时，该数字通常包括其10％上下之范围，或更特别地，包括其5％上下之范围。

本文所使用的“个人”或“个体”等词包括人类或非人类动物，例如陪伴动物(如狗、猫等)、农场动物(如牛、绵羊、猪、马等)、或实验动物(如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。特定而言，该个体是罹患IgAN者。

本文所使用的“治疗”乙词是指施加或投予包括一或多种活性药剂的组合物至具有疾病、疾病之症状或病况、或疾病恶化之个体，其目的在于治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进、或影响疾病、疾病之症状或病况、疾病引发之失能、或疾病恶化。

本文所使用的“治疗有效量”乙词是指于治疗之个体产生治疗功效之活性成分的量。举例而言，用于治疗IgAN之有效量为可抑制、改进、缓解或减轻一或多个症状或病况的量，该症状或病况诸如(1)于肾小球：内在细胞增生，包含系膜细胞增生、新月体形成、嗜中性白血球浸润、及节段型硬化症；或者(2)于肾小管间质腔室：间质(尤其是肾小球周围)单核白血球发炎、纤维化、及肾小管萎缩并伴随蛋白圆柱、或蛋白尿或血尿、或异常升高的血清尿素氮量或血清肌酸酐量。可使用本领域习知之方法，基于各种疾病恶化相关指标，以决定及评估症状，例如，分析尿蛋白量、血尿素氮量或血清肌酸酐量、或分析肾切片。治疗有效量可因各种因素而有所变化，如投予途径及频率、接受该药物之个体的体重及物种、及投予目的。熟习本领域之技术人员可基于本文之揭示、建立之方法、及其本身之经验确定各情况的剂量。举例而言，在部分具体实施例中，本发明所使用的人参皂苷M1口服剂量为每日10至1,000mg/kg。在部分实例中，本发明所使用的人参皂苷M1口服剂量为每日100至300mg/kg、每日50至150mg/kg、每日25至100mg/kg、每日10至50mg/kg、或每日5至30mg/kg。此外，在本发明之部分具体实施例中，人参皂苷M1系周期性投予一段时间，例如，每日投予达至少15天、一个月或二个月或更久。

依据本发明，人参皂苷M1可作为活性成分，以治疗IgAN。在一具体实施例中，针对输送及吸收目的，治疗有效量之活性成分可与医药上可接受载体配制成适当形式之医药组合物。依据投予模式，本发明之医药组合物较佳为包含约0.1％重至约100％重之活性成分，其中百分比重系以组合物之总重量为基准计算。

本文所使用的“医药上可接受”乙词是指载体与组合物之活性成分兼容，且较佳为可稳定该活性成分且对于接受治疗之个体具安全性。该载体可为活性成分之稀释剂、载剂、赋形剂、或介质。适用之赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、及甲基纤维素。本组合物可额外包含润滑剂如滑石、硬脂酸镁、及矿物油；润湿剂；乳化剂及悬浮剂；防腐剂如甲基及丙基羟基苯甲酸酯；增甜剂；以及调味剂。在投予至病患后，本发明之组合物可提供活性成分快速、持续、或缓慢释放之效果。

依据本发明，该组合物之形式可为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、悬剂、乳液、溶液、糖浆、软与硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液、及包装粉剂。

本发明之组合物可经由任何生理上可接受途径输送，例如，口服、非口服(如肌内、静脉、皮下、及腹腔)、经皮、栓剂、及鼻内方法。关于非口服投予，较佳为使用无菌水溶液，其可包含其他物质，如足以使溶液与血液等张的盐类或葡萄糖。水溶液可视需求适当地经缓冲(较佳为具pH值3至9)。本领域之技术人员可由习知之标准药理学技术于无菌条件下制备适合的非口服组合物。

依据本发明，含有以人参皂苷M1作为活性成分的人参皂苷M1或组合物可用于治疗罹患IgAN之个人。特定而言，含有以人参皂苷M1作为活性成分的人参皂苷M1或组合物可投予至罹患IgAN之个人或具有罹患IgAN风险之个人，以预防疾病发生或改善症状或推迟症状恶化。

此外，依据本发明，含有以人参皂苷M1作为活性成分的人参皂苷M1或组合物可用于结合现有的疗法或药剂，如医药治疗，包括但不限于，皮质类固醇(如肾上腺皮质酮)、非类固醇消炎药物(NSAIDs)、细胞毒性药物(如环磷酰胺、氯芥苯丁酸、及硫唑嘌呤)、免疫抑制剂(如环孢素及霉酚酸酯)、及血管扩张剂(如血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)。在一具体实施例中，用于结合之药剂或疗法可同时(并行)或依序使用。当结合药剂使用时，可将药剂混入相同配方或分别使用不同配方，如个别的胶囊、丸剂、片剂、及注射剂。

本发明进一步以下列实例说明，其目的旨在阐述而非局限。

实施例

1.材料及方法

1.1动物模式及实验步骤

B细胞缺乏小鼠皆购自台湾研究院(中国台湾，台北，分子生物所，John T.Kung教授)且饲养于NDMC(中国台湾，台北)。藉由每日腹腔注射纯化的IgA抗磷酸胆碱抗体和肺炎球菌C多醣抗原(PNC)[14]诱导IgAN。所有的动物实验皆于中国台湾的NDMC的实验动物照护及使用委员会的伦理审议下进行，并符合NIH实验动物照护及使用指南的伦理规范。

1.2人参皂苷M1

人参皂苷M1，即20-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)(以下命名为LCHK168)，系以本领域习知之方法制备，如中国台湾专利申请案第094116005号(I280982)及美国专利第7,932,057号所揭示者。在实验当中，小鼠每天经由管喂喂食60mg/kg LCHK168或载剂，第一剂喂食是在诱导疾病两天前。

1.3尿蛋白及肾功能分析

每周测量体重，每周于代谢笼中收集尿液样本以测定尿蛋白量。在第14、28天收集血清样本以测定血清中血尿素氮(BUN)及肌酸酐(creatinine，Cr)之含量。肾组织以10％缓冲福尔马林固定、石蜡包埋、及制成切片(3μm)并以苏木紫及伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色，以进行肾组织病理学检查。肾小球所表现出的细胞增生、嗜中性球浸润、硬化、或周围肾小球发炎比例，在光学显微镜在400X放大下藉由随机计数50肾小球样本(counting 50randomly sampled glomeruli)决定。

1.4病理学评估

对于IHC，将福尔马林固定、石蜡包埋或冷冻的切片及抗CD3、F4+/80、CD4、CD8、CD11c、或胶原蛋白IV抗体(以DAKO抗体稀释溶液稀释)于4℃隔夜培养，再与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase HRP)-结合之二次抗体(DAKO)在相同溶液里，放置于室温1小时，在辣根过氧化物酶-结合之抗体，同时加入DAB(DAKO)。以苏木紫对染细胞核。在光学显微镜在400X放大下藉由PAX-It数量影响分析软件，在连续20个肾小球或20个随机选择的皮质小管间质腔室区域计数阳性细胞。

1.5活性氧化物质(reactive oxygen species，ROS)之侧定

为了测定活性氧化物质(ROS)，将检体培养在室温，以含有1.25mM光泽精(lucigenin)之Krebs-Hepes缓冲液为基质，然后以多重标记微孔盘计数器(multilabel microplate reader)(Hidex)每间隔15秒进行发光计数(二重复)。活性氧化物质的活性以每毫克干重每15分钟之反应性发光单位(reactive luminescence units，RLU)表示(亦即，RLU/15min/mg干重)。

1.6流式细胞仪

小鼠脾脏经由Tris-缓冲氯化铵处理以消除红血球，以含有10％胎牛血清、Hepes缓冲液、L-谷氨酰胺、及盘尼西林/链霉素之RPMI1640培养液冲洗及悬浮。使用FITC-共轭抗老鼠CD44、藻红蛋白(phycoerythrin)-共轭抗老鼠CD62抗体、及别藻蓝蛋白(allophycocyanin)-共轭抗老鼠CD4在细胞对于活化的T细胞亚型进行三重染色，并使用FACSCalibur分析。

以上游共同调控分子的表现决定树突状细胞(DCs)的成熟。以IgA-IC、LCHK168(1，2μM)治疗之细胞，以对老鼠CD40、CD80、CD86专一之mAbs染色，再以流式细胞仪分析。

1.7实时反转录-聚合酶连锁反应(RT-PCR)

依据制造商的指示，使用TRIzol试剂，萃取肾皮质的RNA，并使用实时反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)测量TLR2基因表现。引子如下：对于TLR2，5’-GTCTCTGCGACCTAGAAGTGGA-3’(序列编号1)及5’-CGGAGGGAATAGAGGTGAAAGA-3’(序列编号2)以及对于GADPH，5’-TCCGCCCCTTCTGCCGATG-3’(序列编号3)及5’-ACGGAAGGCCATGCCAGTGA-3’(序列编号4)。依据制造商的指示，使用Applied Biosystems系统进行实时定量。增幅量使用2^-ΔCt方法校正于GAPDH之量。

1.8西方墨点法分析

每个蛋白质样品跑8％SDS-PAGE胶，并将蛋白质电墨点印到聚偏二氟乙烯膜，并放置于阻断液(含有5％脱脂牛奶之Tris缓冲盐水)中室温反应1小时，之后和抗NLRP3或β-肌动蛋白之兔子抗体4℃隔夜反应。冲洗后，将膜和HRP-共轭抗兔子IgG之山羊抗体在相同溶液中室温反应1小时。以UVP Biospectrum侦测已结合抗体。

1.9统计分析

结果以平均值±SEM表示。以Student’s t检定进行二组别间之比较。p值<0.05视为具有显着差异。

2.结果

2.1人参皂苷M1显着减少蛋白尿及血尿并保护IgA肾炎小鼠之肾功能

疾病对照组，即，载剂治疗之IgAN小鼠(对照IgAN小鼠)在诱导疾病后第14天表现出尿蛋白量增加的情形，且持续增加至研究结束的第28天(图1)。这个效果明显的被LCHK168抑制(IgAN+LCHK168)，虽然相对正常对未治疗照组仍然有些微蛋白尿的情形。此外，在第28天，相对于表现出明显增加血清中血尿素氮(BUN)(图2A)和血清肌酸酐(Cr)(图2B)量的疾病对照组，IgAN+LCHK168组小鼠表现出明显较好的肾功能。在第14天时，在IgAN+LCHK168组和正常对照组小鼠之间BUN及Cr的血清量没有显着的差异。

2.2以人参皂苷M1治疗小鼠避免严重肾脏病理学特征

如图3所示，在第28天，疾病对照组表现出弥漫性和与局部有关的增生，在肾小球：典型的新月体、节段型硬化症、及/或嗜中性白血球浸润，在肾小管间质腔室：严重的周围肾小球单核白血球浸润、及零星的肾小管萎缩伴随蛋白质圆柱，但这些症状明显的藉由LCHK168的投予而抑制。

2.3以人参皂苷M1治疗小鼠抑制肾脏发炎和纤维化

更进一步，我们进行IHC评估浸润小鼠肾脏之单核白血球的表现型和分布。虽然在第14天在肾脏只有观察到非常少的发炎细胞和纤维化，但在第28天，相对于正常对照组，疾病对照组小鼠在肾脏间质组织(尤其是周围肾小球部分)观察到局部但强烈的CD3⁺T细胞(图4)、F4/80⁺单核球/巨噬细胞(图5)、CD4⁺T细胞(图6)、CD8⁺T细胞(图7)、CD11c⁺树突状细胞(图8)、及胶原蛋白IV(图9)的染色。相反地，在第28天，相较于疾病控制组，IgAN+LCHK168组小鼠表现出显着较少的发炎细胞浸润及纤维化(*p<0.05，**p<0.01，***p,0.005)。

2.4以LCHK168抑制活性氧化物质的产生

活性氧化物质(ROS)被认为是导致包含IgAN的各种形式的肾脏疾病加速及恶化之主要有害因子。我们因此全身性地测量肾脏组织内的ROS量。疾病对照组相较于正常对照组在第28天显示较高的肾脏组织内ROS量(图10)。相较于疾病对照组，投予LCHK168在第14天大幅地抑制肾脏组织内ROS量的增加，以及在第28天实质地抑制肾脏组织内ROS量的增加(*p<0.05，***p,0.005)。

2.5以LCHK168调整全身性免疫

因为细胞调节之免疫力已知与IgAN的恶化有关，我们以流式细胞仪检视脾脏的T细胞活化。如图11所示，疾病对照组小鼠相较于正常对照组观察到记忆CD4⁺T细胞明显地增加。相较于疾病控制组小鼠，投予LCHK168诱导记忆CD4⁺T细胞的显着降低(*p<0.05)。

2.6以LCHK168抑制TLR2的表现

研究员已证实TLR2的表现量和IgAN中肾脏发炎及纤维化有关。我们因此以实时RT-PCR测量肾脏内TLR2mRNA量(图12)。虽然在第14天没有显着的差异，相较于在第28天表现出显着增加TLR2mRNA量的IgAN疾病对照组，IgAN+LCHK168组别小鼠有显着较低的TLR2mRNA量(*p<0.05)。

2.7以LCHK168抑制DCs的成熟

成熟是DCs调节之免疫反应调控最关键的步骤。为了研究LCHK168对树突状细胞成熟的影响，我们以流式细胞仪检视树突状细胞内CD40、CD80、及CD86的表现量。同时以西方点墨法侦测发炎体NLRP3的表现。相较于对照组细胞，IgA-IC刺激使DCs内CD40、CD80、及CD86的表现量增加。相反地，LCHK168治疗显着地降低这些分子的表现量(图13)。再者，经LCHK168治疗的DCs显示显着减少的NLRP3蛋白表现(图14)。

总而言之，我们的研究显示人参皂苷M1有效地治疗IgA肾炎及防止IgA肾炎之发展。特定来说，藉由人参皂苷M1的治疗结果显示(1)减少肾脏组织病理学的特征，(2)防止T细胞和单核球/巨噬细胞浸润，(3)防止肾脏间质组织纤维化和胶原蛋白沉积，(4)抑制活性氧化物质的产生，(5)减少全身性记忆CD4⁺T细胞，(6)抑制树突状细胞的成熟，以及(7)抑制发炎体NLRP3的表现。以上这些发现指出人参皂苷M1有潜力可以进一步发展成治疗或预防IgA肾炎的新药。

相信熟习本发明领域普通知识之技术人员可基于本文之阐述最大限度利用本发明，而毋须进一步说明。因此，应理解到，所提供之说明及主张仅用于示例之目的，而非以任何方式局限本发明之范畴。

参考资料

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