纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极在电化学生物传感器中的应用

摘要

本发明公开了一种纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极在电化学生物传感器中的应用，所述复合电极包括复合电极材料和在所述复合电极材料表面组装的生物分子，其中，所述复合电极材料包括石墨纤维和附着在石墨纤维表面的纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在所述石墨纤维的表面上原位生成。本发明的电极应用于电化学生物传感器，极大提高了传感器的灵敏度和可重复性。

说明书

技术领域

本发明涉及纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极在电化学生物传感器中的应用。

背景技术

生物传感器在临床诊断、生物工程、疫病防治和环境保护等方面发挥着重要应用。其中，电化学方法以其快速、简单、廉价、高灵敏度获得了越来越多的青睐。各种构建电化学生物传感器的方法已经发展起来，如基于各种纳米材料、生物大分子和高分子材料的电化学生物传感器等。各种电化学检测手段也已经应用在电化学生物传感器中，包括方波伏安、差分脉冲伏安、循环伏安、电化学阻抗等。

近年来，一维纳米二氧化钛无机材料以其优良的生物相容性、较好的电子传输能力和成熟的制备方法引起了物理、化学、材料等领域科学家的极大兴趣，一些以一维纳米二氧化钛无机材料为构筑材料的传感器件应运而生。目前的研究中，二氧化钛一维纳米材料主要通过水热法和溶胶凝胶法制备得到，再将其滴涂在电极上，通过物理吸附和化学组装生物分子修饰和设计生物传感器。常规电极如玻碳电极或金电极直径一般仅为1-3mm，表面积较小，用以进行组装或修饰的部位较少，同时在常规电极上层层组装较为复杂且不稳定容易脱落，极大程度的影响了传感器的灵敏度和可重复性。

因此，本领域亟需开发一种比表面积大、易于组装或修饰且用于传感器稳定、灵敏度高的电极材料。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的电极材料比表面积小、用于进行组装或修饰的部位少且在其表面组装复杂以及组装后稳定性差的缺陷，提供一种比表面积大、组装或修饰部位多且表面组装简单以及组装后稳定性好的纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极在电化学生物传感器中的应用。

本发明的发明人在研究中发现，将石墨纤维与含有钛酸四丁酯溶液进行接触，烧结后得到表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维，然后将得到的表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维与钛酸四丁酯的水溶液在酸的存在下混合并进行水热反应，能够在石墨纤维表面原位生成一维纳米二氧化钛，该复合材料作为电极材料具有较大的比表面积，易于进行组装或修饰。该电极材料应用于电化学生物传感器，能够极大提高传感器的灵敏度和可重复性。

为了实现上述目的，本发明提供一种纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极在电化学生物传感器中的应用，所述复合电极包括复合电极材料和在所述复合电极材料表面组装的生物分子，其中，所述复合电极材料包括石墨纤维和附着在石墨纤维表面的纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在所述石墨纤维的表面上原位生成。

根据本发明提供的复合电极材料具有较大的比表面积，使得电极表面的组装或修饰更加容易，并且组装后稳定性好，不易脱落。采用这样的电极材料组装有生物分子形成的复合电极应用于电化学生物传感器，极大提高了传感器的灵敏度和可重复性。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明制备例1中的纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料A1和商购的石墨纤维的扫描电镜SEM图，其中，a和b是商购的石墨纤维，c和d是纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料A1。

图2是本发明制备例1中的二氧化钛、石墨纤维和纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料A1的X射线衍射图，其中，a为二氧化钛，b为石墨纤维，c为纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料A1。

图3本发明的实施例1(图3 a)和对比例1(图3 b)的循环伏安检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，术语“原位生成”是指在石墨纤维表面成核生长。

本发明提供了一种纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极在电化学生物传感器中的应用，所述复合电极包括复合电极材料和在所述复合电极材料表面组装的生物分子，其中，所述复合电极材料包括石墨纤维和附着在石墨纤维表面的纳米二氧化钛，所述纳米二氧化钛在所述石墨纤维的表面上原位生成。

根据本发明，所述复合电极是指由纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料作为复合电极材料，并在其表面组装上生物分子而制得的传感器的工作电极。优选地，所述复合电极材料由石墨纤维和附着在石墨纤维表面的纳米二氧化钛组成。在本发明中，对于制备这样的工作电极的方法并没有特别的限定，可以为本领域常规使用的方法，例如可以包括：将纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料，通过银胶粘在FTO玻璃上并接出一根电极导线，然后使用环氧树脂及四氟乙烯带进行封装，并组装上生物分子。

根据本发明，所述纳米二氧化钛和所述石墨纤维的含量可以在较宽范围 变化，优选情况下，以所述复合电极材料的总量为基准，所述纳米二氧化钛的含量为7-21重量％，所述石墨纤维的含量为79-93重量％。进一步优选情况下，以所述复合电极材料的总量为基准，所述纳米二氧化钛的含量为12-16重量％，所述石墨纤维的含量为84-88重量％。

根据本发明，在所述石墨纤维的表面上原位生成的纳米二氧化钛可以为一维结构的纳米二氧化钛，本申请对这样的一维结构的纳米二氧化钛并没有特别的限定，例如所述纳米二氧化钛可以为二氧化钛纳米线、二氧化钛纳米棒、二氧化钛纳米管中的一种或多种。为了进一步提高电极材料的综合性能，优选情况下，所述纳米二氧化钛为二氧化钛纳米线、二氧化钛纳米棒和二氧化钛纳米管中的一种或多种。其中，在本发明的一种优选的实施方式中，所述纳米二氧化钛为直径为15-20nm，长度为400-500nm的纳米线。其中，在本发明的另一种优选的实施方式中，所述纳米二氧化钛为直径为100-150nm，长度1-1.5μm的纳米棒。其中，在本发明的另一种优选的实施方式中，所述纳米二氧化钛为内径为50-80nm，外径100-150nm，长度1-1.5μm的纳米管。

根据本发明，对于所述石墨纤维也没有特别的限定，可以为本领域常规的石墨纤维，例如所述石墨纤维可以通过商购获得。在本发明中，所述石墨纤维可以为丝状的，例如可以为直径为5-6μm丝状纤维。

根据本发明，上述纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料的制备方法优选包括：

(1)将石墨纤维与含有钛酸四丁酯的溶液进行接触，并将接触得到的产物进行煅烧，得到表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维；

(2)在酸的存在下，将步骤(1)得到的表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维与钛酸四丁酯在水中混合并进行水热反应。

根据本发明，在步骤(1)中，对于所述石墨纤维和含有钛酸四丁酯的溶液的用量并没有特别的限定，为了使得石墨纤维与含有钛酸四丁酯的溶液 充分的接触，优选情况下，相对于1g的石墨纤维，所述含有钛酸四丁酯的溶液用量为30-40ml。所述含有钛酸四丁酯的溶液可以为含有钛酸四丁酯的醇溶液，所述醇可以为乙醇、甲醇、乙二醇等中的一种或多种。为了防止钛酸四丁酯的水解，所述含有钛酸四丁酯的溶液还可以含有水解抑制剂，所述水解抑制剂可以为本领域常规使用的水解抑制剂例如二乙醇胺。优选情况下，所述含有钛酸四丁酯的溶液为含有钛酸四丁酯和二乙醇胺的乙醇溶液。更优选地，在所述含有钛酸四丁酯的溶液中，钛酸四丁酯、二乙醇胺和乙醇的体积比为1：0.1-0.5：3-5。

根据本发明，在步骤(1)中，优选情况下，所述接触的条件包括：温度为15-35℃，时间为30-40min。对于所述接触的过程并没有特别的限定，例如可以将石墨纤维加入到含有钛酸四丁酯的溶液中，进行浸泡接触。

优选地，所述煅烧的条件包括：温度为450-500℃，时间为1-3h。所述煅烧可以在本领域常规使用的马弗炉中进行。

根据本发明，在步骤(2)中，对于表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维与钛酸四丁酯的用量并没有特别的限定，为了使得表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维与钛酸四丁酯充分的接触，优选情况下，相对于1g表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维，钛酸四丁酯的用量为0.5-2mL，更优选为0.5-1.5mL。

根据本发明，优选情况下，在步骤(2)中，钛酸四丁酯与水的体积比为1：15-20。

根据本发明，对于在酸存在下的所述表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维与钛酸四丁酯在水中混合过程并没有特别的限定，例如可以将表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维加入到钛酸四丁酯、酸和水的混合溶液中进行混合。

根据本发明，对于所述酸并没有特别的限定，优选情况下，所述酸为盐 酸、硫酸和硝酸中的一种或多种，更优选为盐酸。优选地，相对于所述水热反应的体系(即相对于水热反应体系的整个反应溶液来说)中，所述酸的用量为5-6mol/L。所述盐酸的浓度例如可以为10-12mol/L。

根据本发明，在步骤(2)中，所述水热反应的条件使得所述纳米二氧化钛以一维纳米结构的形式在所述石墨纤维的表面上原位生成，优选情况下，所述水热反应的条件包括：温度为130-180℃，时间为8-12h。所述水热反应可以在本领域常规使用的容器中进行，例如聚四氟乙烯反应釜中。

根据本发明，该方法还可以包括对所述水热反应得到的产物洗涤和干燥的步骤。所述洗涤可以为使用去离子水洗涤产物。所述干燥可以为自然干燥。

在本发明所提供的纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料在制备电化学生物传感器中的应用中，所述电化学生物传感器可以为电化学DNA传感器、电化学免疫传感器或电化学葡萄糖传感器。

如上文所描述的，所述复合电极是指由纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料作为复合电极材料，并在其表面组装上生物分子而制得的传感器的工作电极。为了在电极上进行组装或修饰，还可以包括对上述制备好的工作电极的表面处理的过程。所述表面处理的方法可以为本领域常规使用的方法，例如表面羟基化、硅烷化、氨基化以及利用成膜性好的物质改变电极表面成膜性等。所述表面羟基化可以通过将工作电极与浓硫酸接触的方法实现。所述硅烷化和氨基化可以通过将上述表面羟基化的工作电极与3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)接触的方法实现。所述改变电极表面成膜性可以通过将制备好的工作电极与壳聚糖溶液接触来实现。

根据本发明，为了减少残留表面处理溶液对后续生物分子的组装的影响，优选情况下，使用水对表面处理后的工作电极进行洗涤。

根据本发明，所述应用还可以包括将上述表面处理后的工作电极进行生物分子组装的过程，例如可以将上述硅烷化和氨基化的工作电极与戊二醛交 联，然后与带有氨基的生物分子溶液接触，所述带有氨基的生物分子可以为末端氨基化的DNA探针分子、抗体分子或酶等；也可以将制备好的工作电极与含有酶或抗体等蛋白分子的壳聚糖溶液进行接触。当组装有抗体的工作电极用作免疫传感器时，还可以用磷酸缓冲溶液对电极进行冲洗后与牛血清白蛋白(BSA)进行接触并进行封闭。

根据本发明，所述应用可以采用电化学阻抗技术对生物分子进行检测，这是由于生物分子在电极表面的固定或生物分子识别可以改变电容及电极表面电子转移阻抗。根据本发明提供的应用，还可以采用循环伏安技术对生物分子进行检测，这是由于生物分子在电极表面的固定可以在电化学体系中发生氧化还原反应。

在本发明中，当所述电化学生物传感器为电化学DNA传感器时，其中，在所述电化学DNA传感器中，所述复合电极优选通过将复合电极材料与3-氨丙基三乙氧基硅烷和戊二醛交联后组装上末端氨基化的DNA探针分子而制得，将所述复合电极作为工作电极在不同浓度的互补DNA溶液中采用三电极体系通过电化学阻抗技术进行检测。具体地可以包括：(1)将制备好的工作电极浸入浓硫酸中过夜，然后浸入1-3重量％的APTES溶液反应1-3h，然后在100-120℃下干燥1-2h。(2)接着将上述(1)处理后的工作电极与1-5重量％的戊二醛交联2h并使用二次水进行洗涤。然后与末端氨基化的DNA探针分子(1-100μM)溶液接触，2-8℃下反应16-20h。(3)将上述(2)处理后的工作电极浸入不同浓度的互补DNA溶液中，反应0.5-1.5h，取出后用pH为7-7.4的磷酸缓冲液冲洗，采用铂片或铂丝作为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极的三电极体系，通过电化学阻抗技术进行检测。

当所述电化学生物传感器为电化学免疫传感器时，在所述电化学免疫传感器中，所述复合电极优选通过将复合电极材料与3-氨丙基三乙氧基硅烷和戊二醛交联后组装上末端氨基化的抗体分子而制得，将所述复合电极作为工 作电极在不同浓度的抗原溶液中采用三电极体系通过电化学阻抗技术进行检测。具体地可以包括：(1)将制备好的工作电极浸入浓硫酸中过夜，然后浸入1-3重量％的APTES溶液反应1-3h，然后在100-120℃下干燥1-2h。(2)接着将上述(1)处理后的工作电极与1-5重量％的戊二醛交联2h并使用二次水进行洗涤。然后与抗体分子(1-100μM)溶液接触，2-8℃下反应16-20h。使用pH为6-7的磷酸缓冲液对反应后的工作电极进行洗涤后与牛血清白蛋白(BSA)进行接触并进行封闭。(3)将上述(2)处理后的工作电极浸入不同浓度的抗原溶液中，37-55℃下反应0.5-1.5h，取出后用pH为6-7的磷酸缓冲液冲洗，采用铂片或铂丝作为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极的三电极体系，通过电化学阻抗技术进行检测。

当所述电化学生物传感器为电化学葡萄糖传感器时，在所述电化学葡萄糖传感器中，所述复合电极优选通过将复合电极材料与葡萄糖氧化酶和壳聚糖接触使得复合电极材料上组装上葡萄糖氧化酶而制得，将所述复合电极作为工作电极在含有不同浓度的葡萄糖分析液中采用三电极体系通过电化学计时电流技术进行检测。具体地可以包括：(1)将制备好的工作电极浸入含有10-20mg/ml葡萄糖氧化酶和0.3-0.5重量％的壳聚糖的溶液，15-35℃下反应0.5-1h。(2)然后2-8℃下自然干燥过夜。(3)通过改变磷酸缓冲液(PBS)中葡萄糖的浓度进行不同程度的氧化还原反应，采用铂片或铂丝作为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极的三电极体系，通过电化学阻抗技术进行检测。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

在本发明中：

石墨纤维购于日本东丽公司，牌号为M40-JB 12k，直径为5-6μm的丝状纤维。

钛酸四丁酯购于国药公司，纯度为99重量％。

二乙醇胺购于国药公司，纯度为99重量％。

APTES溶液购于sigma公司。

银胶购于新兴百瑞公司。

FTO玻璃购于新兴百瑞公司。

电镜图通过日立公司S-8020型号的电子扫描电镜测得。

X射线衍射图通过BrukerAXS公司D8-advance型号的X射线衍射仪测得。

制备例1

本制备例用于说明本发明的纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料。

(1)将1g石墨纤维加入到含有钛酸四丁酯的乙醇溶液(7ml钛酸四丁酯、2ml二乙醇胺和27ml无水乙醇)中超声3分钟后接触30min，并将接触得到的产物在500℃下煅烧1h，得到表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维；

(2)将1g步骤(1)得到的表面生长有二氧化钛种子层的石墨纤维加入到装有1ml的钛酸四丁酯、20ml去离子水和20ml盐酸(浓度为12mol/L)的混合液的聚四氟乙烯反应釜中，在150℃下进行水热反应8h。将水热反应得到的产物水洗并自然干燥，得到纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料A1(纳米二氧化钛的含量为20重量％，石墨纤维的含量80重量％)，其中，纳米二氧化钛呈现纳米棒结构，直径为100nm，长度为1.2μm。A1的扫描电镜SEM图如图1的c和d所示(另外，商购的石墨纤维的扫描电镜SEM图如图1的a和b所示)，X射线衍射图如图2的c所示(另外，二氧化钛和商购的石墨纤维的X射线衍射图分别如图2的a和b所示)。

实施例1

本实施例用于说明本发明的纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料在电 化学葡萄糖传感器中的应用。

(1)截取1cm制备的纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料A1，通过银胶粘在FTO玻璃上，并在一端通过银胶粘接上铜线作为电极导线，其余部分通过环氧树脂及聚四氟乙烯带封闭。得到电化学葡萄糖传感器的工作电极；

(2)接着将上述步骤(1)处理后的工作电极浸入葡萄糖氧化酶与壳聚糖的混合溶液(其中，葡萄糖氧化酶浓度为15mg/ml，壳聚糖的质量分数为0.3重量％)中，室温(20℃)搅拌1h，并将反应后得到的工作电极在4℃下干燥过夜；

(3)将上述步骤(2)处理后的工作电极浸入不同浓度葡萄糖的浓度的磷酸缓冲液(PBS)中，采用铂片作为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极的三电极体系，通过电化学循环伏安技术进行检测，其结果如图3 a所示。

对比例1

根据实施例1的方法，不同的是，用商业化的石墨纤维替代纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料A1，其循环伏安检测结果如图3 b所示。

如上所述，本发明提供的纳米二氧化钛/石墨纤维复合电极材料，具有更大的比表面积，更容易进行组装或修饰，并且一维纳米结构的二氧化钛排列有序，不会团聚，应用于生物传感器的工作电极，能够显著提高电极的稳定性和灵敏度。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。