一种基于磁共振成像（MRI）的新的三聚氰胺检测方法

摘要

本发明提供了一种基于磁共振成像(MRI)的三聚氰胺检测方法。通过构建三聚氰胺诱导磁共振T1造影剂‑MnO磁性纳米粒子的团聚现象，建立核磁共振造影剂弛豫时间的改变与三聚氰胺浓度间的关系，来实现对三聚氰胺的检测。这一检测方法不仅操作简便，不需要复杂的样品前处理，而且材料成本低，机器操作简单高效，很好地弥补了以往三聚氰胺检测方法的缺点，且能够实现实际牛奶样品中三聚氰胺的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及食品检测领域。

背景技术

食品安全一直是人们关注的重点，早在2008年9月，中国发生震惊国人的三鹿奶粉事件，这便是不法商贩利用“凯式定氮法”来确定蛋白质含量的检测漏洞，通过人为添加三聚氰胺，达到提高蛋白质含量的目的。使得食用者发生泌尿系统疾病甚至导致死亡(周丽,徐新云.三聚氰胺毒性作用及其对健康的危害[J].职业与健康,2010(23):2857-2859.)。

三聚氰胺(Malemine，化学式：C₃N₃(NH₂)₃)，俗称密胺蛋白精，是一种三类含氮杂环有机化合物，含有三个氨基官能团，水溶液状态带有正电性。三聚氰胺作为一种工业原料，广泛用于涂料、塑料、黏合剂、纺织、造纸等工业生产，不可用于食品加工或食品添加。目前，常用的含乳食品中三聚氰胺检测方法主要包括：高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等。这些方法所用仪器都较为昂贵，且样品前处理复杂，检测耗时严重，较难实现经济简单高效应用。(王明辉.乳制品中三聚氰胺的检测方法[J].现代畜牧科技,2016(5):179-179.)。

随着纳米技术的不断完善和发展，基于磁性纳米材料独特的磁学性质，以及其良好的表面可修饰性和生物相容性，磁性纳米粒子在各个研究领域的应用越来越广泛，例如，利用磁性纳米材料的磁学性能开发的肿瘤磁热治疗技术、磁性细胞分离技术、药物靶向运输技术等，具有良好的发展前景。同时，纳米技术的广泛应用也推动了多学科交叉的新型检测技术的发展。目前，基于核磁共振造影剂成像原理，研究合成功能化的磁性纳米粒子造影剂，利用其特殊的磁学性质及对弛豫时间的影响来定性与定量检测目标分析物的方法，不仅对样品前处理要求不高，且方法简单高效，已经成为了当下分析检测学的新突破和研究热点。

顺磁性金属锰原子核外有5个不成对的电子，具有较高的磁化率，并且锰离子的毒性低，因此近年来氧化锰(MnO)磁性纳米粒子作为核磁共振T1造影剂的应用越来越广泛。CN103920168也报道了基于氧化铁磁性纳米粒子检测三聚氰胺的核磁共振传感器及其制备方法和应用，但是其所使用的核磁共振传感器为T2造影剂Fe/Fe₃O₄磁性纳米粒子，其制备过程中需要用到苛刻的合成和分离条件：反应必须在惰性气体下进行，反应产物必须通过柱色谱分离提纯。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于磁共振成像的新的三聚氰胺检测方法。通过构建三聚氰胺诱导MnO磁性纳米粒子的团聚现象，建立核磁共振造影剂弛豫时间的改变与三聚氰胺浓度间的关系，来实现对三聚氰胺的检测。

本发明的技术方案如下：

一种基于磁共振成像的三聚氰胺检测方法，包括如下步骤：

1)制备经过二巯丁二酸改性的MnO纳米材料，即MnO-DMSA,制备方法为：

醋酸锰(Mn(Ac)₂)与三辛胺(TOA)与油酸(OA)按照摩尔比为(1.5-10):17:(1.5-6)，在290-320℃恒温反应10-30min。反应产物MnO纳米晶体用乙醇清洗2-3次。

再称取二巯基丁二酸(DMSA)，同时量取二甲亚砜(DMSO)溶液，配置成1-10mg/mL的DMSA/DMSO溶液A。然后取MnO的纳米晶体，重新分散于乙醇溶液中，得到1-10mg/ml的材料溶液B。将上诉溶液A和溶液B按体积比(1-5)：(1-5)充分震荡混匀后，涡旋振荡过夜(优选为800-1000r/min)。离心收集产物，用无水乙醇和去离子水清洗各2～3次，最后将收集的MnO-DMSA分散在去离子水中。

2)将MnO-DMSA纳米材料配制成标准溶液，其为标准溶液一；同时配制三聚氰胺标准溶液，其为标准溶液二；标准溶液一浓度为0.1-10mg/mL，标准溶液二浓度为10^-4-mM-10^-2mM；

3)在不同试管中加入不同系列体积的标准溶液一以及不同系列体积的标准溶液二；随后加入适量的纯水，使得每管中的溶液体积补齐至同一体积，此为体积一；将每个试管剧烈涡旋使材料充分混匀；

4)再向上述所有试管加入体积二的琼脂溶液，剧烈涡旋2-10min，直至材料充分摇匀固定，琼脂溶液质量体积分数为0.5-5％；体积一：体积二为1:5-5:1；

5)在室温条件下，将样品置于磁共振成像仪进行磁共振成像实验；得到三聚氰胺对应的MnO-DMSA的弛豫时间1/T1与浓度曲线变化关系图；

6)将待测样品配成溶液，与标准溶液一混合，检测三聚氰胺对应的MnO-DMSA的弛豫时间1/T1，对照步骤5)得到的曲线，得到三聚氰胺浓度。

在较佳的实施例中，标准溶液一浓度为0.5-5mg/mL，标准溶液二浓度为10-4mM-10-2mM。

在较佳的实施例中，体积一为100-1000μL。

在较佳的实施例中，步骤5)中，体积二和步骤3)的体积一相等。

在较佳的实施例中，步骤2)：将MnO-DMSA分别配制成浓度为1mg/mL的溶液，同时配制浓度为10^-3mM的三聚氰胺溶液；

步骤3)取1.5mL的试管40个，分成5组；然后分别依次移取1mg/mL MnO-DMSA的50、35、25、16、12.5、8、6.25、4μL加入上述的1组8个试管中，其他4组重复上述操作，而每个体积对应标号1-8；

步骤4)每个浓度下的组分分别依次加入上述配制的10-3mM的三聚氰胺溶液0、5、7.5、10、15、20、25μL于7试管中，试管对应标号1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7等。随后加入适量的纯水，使得每管中的溶液体积补齐至500μL；

6)再向上述所有试管加入质量体积分数为2％的琼脂溶液500μL，剧烈涡旋2min，直至材料充分摇匀固定，便于MRI的弛豫时间的检测。

在较佳的实施例中，步骤7)采用Varian 7.0 T/160mm磁共振成像仪进行磁共振成像实验。

在较佳的实施例中，测试参数设定：TR＝3000ms，TE＝15ms，视野为45×45mm。

本发明优点如下：

顺磁性金属锰原子核外有5个不成对的电子，具有较高的磁化率，并且锰离子的毒性低，因此近年来氧化锰(MnO)磁性纳米粒子作为核磁共振T1造影剂的应用越来越广泛。本发明中，我们通过构建三聚氰胺诱导MnO磁性纳米粒子的团聚现象，建立核磁共振造影剂弛豫时间的改变与三聚氰胺浓度间的关系，来实现对三聚氰胺的检测。和背景技术相比，本发明所采用的核磁共振探测器是核磁共振T1造影剂MnO磁性纳米粒子，其合成在温和的试验条件下就可以完成；产物分离过程也只需要用乙醇和纯水清洗即可。同时，本发明所制备的MnO磁性纳米粒子具有很强的抗干扰能力，在复杂的实际食品检测中，可以直接用来检测市售牛奶中的三聚氰胺，检测过程不需要复杂的样品前处理，材料成本低，机器操作简单高效，很好地弥补了以往三聚氰胺检测方法的缺点。

附图说明

图1是实施例1中制备的MnO纳米粒子的透射电镜照片，从图1中可以看出，所制备的MnO纳米粒子粒径比较均匀。

图2是实施例1中制备的MnO-DMSA纳米粒子的透射电镜(TEM)照片。

图3是MnO改性前(A)与改性后(B)的红外傅立叶转换红外线光谱图(Fouriertransform infrared spectroscopy，FTIR)，2920cm-1和2849cm-1的吸收强度已基本消失，即改性后的MnO-DMSA已经没有-CH2-，说明油酸分子已基本被DMSA替换掉了，即得到了MnO-DMSA复合粒子。

图4是MnO-DMSA用于三聚氰胺检测机理示意图。

图5是加入三聚氰胺后团聚的MnO透射电镜(TEM)图片，从图中可以看出，大量粒子发生团聚。

图6是0～315ppb三聚氰胺对应的MnO-DMSA的1/T1与浓度曲线变化图。

图7是0～315ppb三聚氰胺对应MnO-DMSA的r1的变化图。

图8是在市售某品牌奶粉中检测三聚氰胺所得到的MnO的弛豫率r1的变化图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。

实施例1：

一种基于磁共振成像的新的三聚氰胺检测方法。

1)制备DMSA修饰的MnO纳米粒子：称取0.2862g的醋酸锰(Mn(Ac)₂)，5.8mL的三辛胺(TOA)，1.55mL的油酸(OA)于圆底烧瓶中，至于反应加热套上，升温至310℃恒温反应30min。反应结束后产物MnO纳米晶体用乙醇清洗2-3次。

再称取15mg的二巯基丁二酸(DMSA)，同时量取3mL的二甲亚砜(DMSO)溶液，配置成5mg/mL的DMSA/DMSO溶液A。然后取15mgMnO的纳米晶体，重新分散于5mL的乙醇溶液中，得到材料溶液B。将上诉溶液A和溶液B充分震荡混匀后，涡旋振荡过夜(900r/min)。离心收集产物，用无水乙醇和去离子水清洗各2～3次，最后将收集的MnO-DMSA分散在去离子水中(1mg/ml)。

2)将经过二巯丁二酸(DMSA)改性的MnO纳米材料(MnO-DMSA)分别配制成浓度为1mg/mL的溶液，同时配制浓度为10^-3mM的三聚氰胺溶液；

取1.5mL的试管40个，分成5组。然后分别依次移取1mg/mL MnO-DMSA的50、35、25、16、12.5、8、6.25、4L加入上述的1组8个试管中，其他4组重复上述操作，而每个体积对应标号1～8；

3)每个浓度下的组分分别依次加入上述配制的10^-3mM的三聚氰胺溶液0、5、7.5、10、15、20、25L于7试管中，试管对应标号1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7等。随后加入适量的纯水，使得每管中的溶液体积补齐至500μL；每个试管剧烈涡旋2min，使得材料充分混匀；

4)再向上述所有试管加入质量体积分数为2％的琼脂溶液500μL，剧烈涡旋2min，直至材料充分摇匀固定，便于MRI的弛豫时间的检测。

5)在室温条件下，将样品置于Varian 7.0 T/160mm磁共振成像仪进行磁共振成像实验。测试参数设定：TR＝3000ms，TE＝15ms，视野为45×45mm。

图1是实施例1中制备的MnO纳米粒子的TEM照片，从图1中可以看出，所制备的MnO纳米粒子粒径比较均匀。

图2是实施例1中制备的MnO-DMSA纳米粒子的TEM照片。

图3是MnO改性前(A)与改性后(B)的FTIR图，2920cm-1和2849cm-1的吸收强度已基本消失，即改性后的MnO-DMSA以及没有-CH2-，说明油酸分子已基本被DMSA替换掉，证明得到了MnO-DMSA复合粒子。

图5是加入三聚氰胺后团聚的MnO的TEM图片，从图中可以看出，大量粒子发生团聚。

图6是0～315ppb三聚氰胺对应的MnO-DMSA的弛豫时间(1/T1)与浓度曲线变化关系图，可以看出随着浓度越高，对应的r1越低。

实施例2：

一种基于磁共振成像的新的三聚氰胺检测方法，步骤同实施例1，不同之处在于步骤1)中，制备MnO纳米粒子的恒温反应时间为20min。

实施例3：

一种基于磁共振成像的新的三聚氰胺检测方法，步骤同实施例1，不同之处在于步骤1)中，加入1.7g的醋酸锰(Mn(Ac)₂)。

实施例4：

一种基于磁共振成像的新的三聚氰胺检测方法，步骤同实施例1，不同之处在于步骤2)中，所配制三聚氰胺溶液浓度为2×10^-3mM，在步骤3)中，随后加入适量的纯水，使得每管中的溶液体积补齐至1000μL。

实施例5：

一种基于磁共振成像的新的三聚氰胺检测方法，步骤同实施例1，不同之处在于步骤1)中，所配制三聚氰胺溶液浓度为0.5×10^-3mM，在步骤3)中，随后加入适量的纯水，使得每管中的溶液体积补齐至250μl。

实施例6：

一种基于磁共振成像的新的三聚氰胺检测方法，步骤同实施例1，不同之处在于步骤4)中所有试管加入质量体积分数为1％的琼脂溶液500μL，剧烈涡旋2min。

实施例7：

一种基于磁共振成像的新的三聚氰胺检测方法，步骤同实施例1，不同之处在于步骤3)中，向每个浓度下的组分分别依次加入上述配制的10-3mM的三聚氰胺溶液0μL、50μL于8试管中,然后向每个试管中加入浓度为100mg/mL的市售某品牌奶粉溶液补齐至500μL。图8为在市售某品牌奶粉中检测三聚氰胺所得到的MnO的弛豫率r1的变化。从图中可以看出，当检测到奶粉中的三聚氰胺时，r1值发生了明显的变化，从8.4降低到6.1mM/s。