基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的制备方法及其应用，特点是包括铱配合物的合成步骤；阳离子共轭聚合物的合成步骤；阳离子共轭聚合物与铱配合物发生FRET，得到基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的步骤；该荧光传感器体系可应用于检测凝血酶、三磷酸腺苷、血小板衍生生长因子、可卡因和溶菌酶，优点是特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速，且过程极其简单。

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光传感器体系，尤其是涉及一种基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的制备方法及其应用。

背景技术

荧光共振能量转移(FRET)是目前设计荧光传感器使用较为广泛的原理。荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移即发生能量共振转移。能量供给体-接受体之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。基于荧光共振能量转移的荧光传感方法具有操作过程简单、灵敏度高、选择性好、响应时间短等特点。

FRET因其对距离的敏感性，广泛地被用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。因此，能量转移荧光分析非常适合于对环境、生物医学科学和临床化学等方面复杂、低含量组分的分析，也是基因工程中的一种新手段。

众所周知，同样是八面体配位的金属铱配合物，具有强的可见吸收和良好的光致发光性能，与联吡啶钌类配合物相比，铱配合物具有量子效率高、发射寿命长、发光波长可调、大的Stokes位移，以及可见光激发和光稳定性等特点，使其在化学、生物传感及生物成像领域引起广泛的关注。

阳离子共轭聚合物(CCP)作为一种新型的水溶性荧光分子，具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点。同时，共轭聚合物具有分子导线的功能，能够实现荧光信号的放大。共轭作用可以使共轭聚合物具有较高的光能采集效果和良好的荧光特性，而亲水性的基团能赋予它们一些其他优秀的特性，比如：能够与带相反电荷的物质相互作用，对熄灭基团高灵敏度的响应，而更具有吸引力的是它能够溶于水，并以此为基础，可以实现对DNA、蛋白质等生物分子的高灵敏度的检测。基于这些独特的荧光性质，阳离子共轭聚合物在生物化学分析方面具有非常广阔的应用前景。目前国内外未见基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系及其应用的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速，且过程极其简单的基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的制备方法及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的制备方法，具体步骤如下：

(1)铱配合物的合成

A.将10～15mmol 2-氯嘧啶，10～20mmol 2,4-二氟苯基硼酸，1.25～1.5mmol三苯基膦，10～15mL乙二醇二甲醚和15～20mL碳酸钾溶液加入到三颈烧瓶中，室温下通氮气30～60min，再在三颈烧瓶中加入0.3～0.5mmol醋酸钯，磁力搅拌，并于110～150℃回流15～20h后停止反应，冷却至室温，分出有机相和水相；将水相用30～60mL乙酸乙酯萃取，再将水相用30～60mL乙酸乙酯重复萃取三次；将有机相合并后用40～80mL水和40～80mL盐水依次洗涤，再用无水硫酸镁干燥，旋蒸除去乙酸乙酯萃取剂，将所得固体于60～80℃真空干燥12～24h；将干燥物用二氯甲烷/丙酮溶液(体积比10:1)在硅胶柱上柱层析，通过层析硅胶板分析成分，将第二个峰的洗脱液合并，通过减压旋蒸除去溶剂二氯甲烷和丙酮，65℃下真空干燥12～24h，得浅黄色固体4-(2,4-二氟苯基)嘧啶(DFPPM)；

B.将2～4mmol IrCl₃·3H₂O、4～5mmol>

C.将0.07～0.10mmol氯桥联溶于10～20mL二氯甲烷中后加入到反应瓶中，将0.10～0.20mmol辅助配体4,4′-二羧酸-2,2′-联吡啶溶于10～20mL甲醇中后加入到反应瓶中，将反应瓶于60～100℃下回流2～5h；再将0.2～0.4g醋酸钠溶于2～5mL甲醇后加入到反应瓶中，回流1～5h，冷却至室温；将六氟磷酸铵加入到2～5mL甲醇溶液至饱和后加入到反应瓶中，常温搅拌30～60min，旋蒸除去溶剂甲醇，再在所得固体中加入1～3M 10～20mL的盐酸溶液，悬浮液搅拌10～30min，过滤；将固体用10～20mL的水洗涤2次后，将固体用2mL甲醇提取，在提取液中加入2～5mL饱和的六氟磷酸铵甲醇溶液，搅拌30～60min，旋蒸除去溶剂甲醇，将所得固体置于真空干燥箱中干燥12～24h；将干燥物用二氯甲烷/甲醇溶液(体积比5:1)在硅胶柱上柱层析，通过层析硅胶板分析成分，将第二个峰的洗脱液合并，通过减压旋蒸除去溶剂二氯甲烷和甲醇，65℃下真空干燥12～24h，得黄色铱配合物；

(2)阳离子共轭聚合物的合成

A.将30～60wt％的氢氧化钾溶液倒入圆底烧瓶，冷却至室温，加入0.1～0.5mmol的四丁基溴化铵，置于油浴锅中，开启磁力搅拌，油浴加热至75～100℃后，依次加入0.9～1.2mmol的1,6-二溴己烷和0.1～0.5mmol的2,7-二溴芴，剧烈搅拌，反应30～60min，停止搅拌，静置冷却至室温；然后加入20mL二氯甲烷萃取3～5次，将有机相合并后用依次水和0.1～0.5M的稀盐酸洗涤，再用无水硫酸镁干燥后，减压旋蒸除溶剂二氯甲烷，得到黄色粘稠液体；将黄色粘稠液体在120℃条件下，用油泵减压蒸馏，除去大部分过量的1,6-二溴己烷，再用石油醚冲洗硅胶柱，通过层析硅胶板分析成分，将第三个峰的洗脱液合并，减压旋蒸除去溶剂石油醚，得到白色晶体共轭聚合物1；¹HNMR(400MHz，CDCl₃，ppm)：δ7.43-7.54(m，6H)，3.28-3.31(t，4H)，1.90-1.95(m，4H),1.65-1.69(m,4H),1.08-1.20(m,8H)，0.48-0.61(m，4H)；

B.先将0.5～1mmol的2,7-二溴-9,9-二(6’-溴己基)芴，0.05～0.1mmol的1,4-亚苯基二硼酸，0.01～0.05mmol的二茂铁二氯化钯加入圆底烧瓶中，重复用油泵抽真空后充入氩气操作2～3次；然后在圆底烧瓶中加入3mL水和6mL四氢呋喃，置于冰水浴中10～30min，待溶液温度到-7～-10℃后，抽成真空再充入氩气操作2～3次；待溶液温度恢复至室温后，将圆底烧瓶置于油浴锅中，开启磁力搅拌，于85～100℃条件下，反应24～36h后，冷却至室温，然后在圆底烧瓶中加入10mL甲醇，静置析出沉淀，过滤，取沉淀依次用预先冷却的甲醇和丙酮洗涤后，减压旋蒸除溶剂甲醇，得到灰黑色固体；在灰黑色固体中加入100～150mL四氢呋喃，超声溶解，静置1～2h后，用0.45μm的尼龙膜抽滤，除去固体钯黑，将滤液旋干，得到黄色固体共轭聚合物2；¹H>3):δ7.84(m,5H),7.70-7.60(m,4H),7.5(m,1H),3.31(t,4H),2.11(m,4H),1.70(m,4H),1.26-1.15(m,8H),0.80(m,4H)；

C.将60～80mg的共轭聚合物2和10～30mL四氢呋喃加入到圆底烧瓶中，于-78～-100℃下预冷15～30min，待溶液降温到-78～-100℃后，抽成真空再充入氩气操作2～3次；用注射器在圆底烧瓶中缓慢地逐滴加入2～5mL三甲胺后，关闭制冷，等1～2h后将圆底烧瓶置于冰水浴中，逐渐恢复至室温后，磁力搅拌，反应24～36h，再通过注射器逐滴加入10～20mL水，搅拌混匀后，冷却至-78～-100℃，抽成真空充入氩气后，逐滴加入2～5mL三甲胺，关闭制冷，待1～2h后将圆底烧瓶置于冰水浴中，逐渐恢复至室温后，磁力搅拌，反应24～36h，然后减压除去大部分的四氢呋喃溶剂，再加入预冷的10mL丙酮，析出沉淀，用滴管小心地吸取上层清液，将沉淀用预冷的丙酮洗涤2～3次，每次等沉淀下沉完全后，用滴管小心地吸取上层清液，合并上层清夜，减压旋蒸，除去溶剂丙酮，干燥得到阳离子共轭聚合物；¹H>3OD):δ8.07-7.51(m,10H),3.31-3.22(t,4H),3.04(s,18H),2.25(br,4H),1.57(br,4H),1.18(br,8H),0.77(br,4H)；

(3)阳离子共轭聚合物与铱配合物发生FRET

将阳离子共轭聚合物(最终的浓度为2.95×10^-6M)、铱配合物(最终的浓度为1×10^-5M)与水按体积比90：1：9混合，即得到基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系。

上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的应用，该荧光传感器体系用于检测凝血酶，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的凝血酶适配体溶液加入到100μL上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的凝血酶溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的凝血酶对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与凝血酶浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中凝血酶的浓度；所述的凝血酶适配体是一小段经体外筛选得到的能与凝血酶进行高亲和力和强特异性结合的寡核苷酸序列，其核苷酸序列为5'-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGACT-3'。

所述的缓冲溶液为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.1～0.2M。

所述的荧光测定条件如下：激发波长是380nm，狭缝宽度是10nm，电压是700V，响应时间是0.01s，扫描速度是1200nm/min。

上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的应用，该荧光传感器体系用于检测三磷酸腺苷(ATP)，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的三磷酸腺苷适配体溶液加入到100μL上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的三磷酸腺苷凝血酶溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的三磷酸腺苷对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与三磷酸腺苷浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中三磷酸腺苷的浓度。

上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的应用，该荧光传感器体系用于检测血小板衍生生长因子(PDGF)，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的血小板衍生生长因子适配体溶液加入到100μL上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的血小板衍生生长因子溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的血小板衍生生长因子对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与血小板衍生生长因子浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中血小板衍生生长因子的浓度。

上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的应用，该荧光传感器体系用于检测可卡因(Cocaine)，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的可卡因适配体溶液加入到100μL上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的可卡因溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的可卡因对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与可卡因浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中可卡因的浓度。

上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的应用，该荧光传感器体系用于检测溶菌酶(Lysozyme)，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的溶菌酶适配体溶液加入到100μL上述基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的溶菌酶溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的溶菌酶对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与溶菌酶浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中溶菌酶的浓度。

发明原理：阳离子共轭聚合物将单个的敏感分子通过化学共轭键连接成为一个相互关联的整体，π键中的电子云可沿着共轭聚合物的整个共轭骨架扩散。长程电子共轭不仅大大缩小成键和反键能带间的能隙，而且使两个能带增宽，能带内轨道数增加，轨道间能隙减小。通过吸收光子或化学掺杂，电子可以很容易实现从成键能带到反键能带的电子跃迁。多个敏感单体通过π电子共轭体系相互连接，形成了具有特定结构的共轭聚合物，因此阳离子共轭聚合物是一种非常高效的能量/电子传递介质，具有“分子导线”的功能，即受光子激发产生的激发子(exciton)可以沿共轭主链自由迁移或者说激发态能量可以沿共轭聚合物主链进行传递。此外，由于共轭作用的存在，阳离子共轭聚合物除了具有信号放大的特点外，它还具有较大的摩尔消光系数，其值可达10⁶M^-1cm^-1数量级，吸光能力强，荧光量子产率高。铱配合物具有量子效率高、发射寿命长、发光波长可调、大的Stokes位移，使得其得到广泛的应用。FRET作为1.0～10.0nm距离范围内的光学分子尺，具有高分辨率、高灵敏度、简单方便等优点。

本发明依据荧光共振能量转移的原理，构建一种简单、高灵敏、高选择性的“turn-on”分析传感方法。由于阳离子共轭聚合物带正电，与带有负电的铱配合物之间通过静电作用发生FRET，当两者同时存在时，二者的荧光强度比值改变。存在适当比例的目标物适配体时，二者的荧光强度比值减少；当有目标物存在时，由于目标物与其适配体的特异性结合作用使得二者的荧光强度比值增大。目标物浓度越大，二者的荧光强度比值越大，荧光强度比值与目标物浓度的对数之间呈线性关系。据此可以实现待测样品中目标物的浓度的检测。本发明均适用其它待测物作用体与待测物通过荧光强度变化检测待测物浓度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)高灵敏度，本发明的检测灵敏度大约是现有方法的10倍以上，本发明灵敏度为2.3fM，原因在于：首先，荧光传感器的灵敏度远远高于其他的传感器；其次，阳离子共轭聚合物具有分子导线的功能，能够实现荧光信号的放大，自身具有较强的荧光。

(2)高特异性，常见其他的酶对本检测体系均无干扰，原因在于：本发明是基于目标物适配体与目标物之间的特异性识别与结合而构建的荧光传感器，干扰物质不是目标物适配体的目标物，因此待测液中的干扰物质并不能与目标物适配体结合，故对本检测体系无干扰。

(3)检测过程简单、快速，将阳离子共轭聚合物与铱配合物混合在一起就可以发生FRET，加入目标物孵育完成后，即可检测得到荧光发光信号，实现定量检测。

(4)结果准确，回收率均在90％～110％之间。

综上所述，本发明是基于上述水溶性阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系，具有高灵敏度、高特异性、简单、快速、易于操作等优点。

附图说明

图1为阳离子共轭聚合物与铱配合物的激发和发射光谱(A和B分别是阳离子共轭聚合物的激发和发射光谱；C和D分别是铱配合物的激发和发射光谱)；

图2为在不同浓度的凝血酶条件下，基于阳离子共轭聚合物和铱配合物检测方法的归一化荧光发射光谱；

图3为在不同浓度的凝血酶条件下，归一化荧光强度与浓度对数值的线性关系图；

图4为本发明荧光传感器体系对凝血酶的选择性实验图；

图5为本发明荧光传感器体系对凝血酶的抗干扰实验图；

图6为在不同浓度的三磷酸腺苷(ATP)条件下，归一化荧光强度与浓度对数值的线性关系图；

图7为在不同浓度的血小板衍生生长因子(PDGF)条件下，归一化荧光强度与浓度对数值的线性关系图；

图8为在不同浓度的可卡因(Cocaine)条件下，归一化荧光强度与浓度对数值的线性关系图；

图9为在不同浓度的溶菌酶(Lysozyme)条件下，归一化荧光强度与浓度对数值的线性关系图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

实施例1

一种基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系的制备方法，具体步骤如下：

(1)铱配合物的合成

A.将10～15mmol 2-氯嘧啶，10～20mmol 2,4-二氟苯基硼酸，1.25～1.5mmol三苯基膦，10～15mL乙二醇二甲醚和15～20mL碳酸钾溶液加入到三颈烧瓶中，室温下通氮气30～60min，再在三颈烧瓶中加入0.3～0.5mmol醋酸钯，磁力搅拌，并于110～150℃回流15～20h后停止反应，冷却至室温，分出有机相和水相；将水相用30～60mL乙酸乙酯萃取，再将水相用30～60mL乙酸乙酯重复萃取三次；将有机相合并后用40～80mL水和40～80mL盐水依次洗涤，再用无水硫酸镁干燥，旋蒸除去乙酸乙酯萃取剂，将所得固体于60～80℃真空干燥12～24h；将干燥物用二氯甲烷/丙酮溶液(体积比10:1)在硅胶柱上柱层析，通过层析硅胶板分析成分，将第二个峰的洗脱液合并，通过减压旋蒸除去溶剂二氯甲烷和丙酮，65℃下真空干燥12～24h，得浅黄色固体4-(2,4-二氟苯基)嘧啶(DFPPM)；

B.将2～4mmol IrCl₃·3H₂O、4～5mmol>

C.将0.07～0.10mmol氯桥联溶于10～20mL二氯甲烷中后加入到反应瓶中，将0.10～0.20mmol辅助配体4,4′-二羧酸-2,2′-联吡啶溶于10～20mL甲醇中后加入到反应瓶中，将反应瓶于60～100℃下回流2～5h；再将0.2～0.4g醋酸钠溶于2～5mL甲醇后加入到反应瓶中，回流1～5h，冷却至室温；将六氟磷酸铵加入到2～5mL甲醇溶液至饱和后加入到反应瓶中，常温搅拌30～60min，旋蒸除去溶剂甲醇，再在所得固体中加入1～3M 10～20mL的盐酸溶液，悬浮液搅拌10～30min，过滤；将固体用10～20mL的水洗涤2次后，将固体用2mL甲醇提取，在提取液中加入2～5mL饱和的六氟磷酸铵甲醇溶液，搅拌30～60min，旋蒸除去溶剂甲醇，将所得固体置于真空干燥箱中干燥12～24h；将干燥物用二氯甲烷/甲醇溶液(体积比5:1)在硅胶柱上柱层析，通过层析硅胶板分析成分，将第二个峰的洗脱液合并，通过减压旋蒸除去溶剂二氯甲烷和甲醇，65℃下真空干燥12～24h，得黄色铱配合物；

(3)阳离子共轭聚合物的合成

A.将30～60wt％的氢氧化钾溶液倒入圆底烧瓶，冷却至室温，加入0.1～0.5mmol的四丁基溴化铵，置于油浴锅中，开启磁力搅拌，油浴加热至75～100℃后，依次加入0.9～1.2mmol的1,6-二溴己烷和0.1～0.5mmol的2,7-二溴芴，剧烈搅拌，反应30～60min，停止搅拌，静置冷却至室温；然后加入20mL二氯甲烷萃取3～5次，将有机相合并后用依次水和0.1～0.5M的稀盐酸洗涤，再用无水硫酸镁干燥后，减压旋蒸除溶剂二氯甲烷，得到黄色粘稠液体；将黄色粘稠液体在120℃条件下，用油泵减压蒸馏，除去大部分过量的1,6-二溴己烷，再用石油醚冲洗硅胶柱，通过层析硅胶板分析成分，将第三个峰的洗脱液合并，减压旋蒸除去溶剂石油醚，得到白色晶体共轭聚合物1；¹HNMR(400MHz，CDCl₃，ppm)：δ7.43-7.54(m，6H)，3.28-3.31(t，4H)，1.90-1.95(m，4H),1.65-1.69(m,4H),1.08-1.20(m,8H)，0.48-0.61(m，4H)；

B.先将0.5～1mmol的2,7-二溴-9,9-二(6’-溴己基)芴，0.05～0.1mmol的1,4-亚苯基二硼酸，0.01～0.05mmol的二茂铁二氯化钯加入圆底烧瓶中，重复用油泵抽真空后充入氩气操作2～3次；然后在圆底烧瓶中加入3mL水和6mL四氢呋喃，置于冰水浴中10～30min，待溶液温度到-7～-10℃后，抽成真空再充入氩气操作2～3次；待溶液温度恢复至室温后，将圆底烧瓶置于油浴锅中，开启磁力搅拌，于85～100℃条件下，反应24～36h后，冷却至室温，然后在圆底烧瓶中加入10mL甲醇，静置析出沉淀，过滤，取沉淀依次用预先冷却的甲醇和丙酮洗涤后，减压旋蒸除溶剂甲醇，得到灰黑色固体；在灰黑色固体中加入100～150mL四氢呋喃，超声溶解，静置1～2h后，用0.45μm的尼龙膜抽滤，除去固体钯黑，将滤液旋干，得到黄色固体共轭聚合物2；¹H>3):δ7.84(m,5H),7.70-7.60(m,4H),7.5(m,1H),3.31(t,4H),2.11(m,4H),1.70(m,4H),1.26-1.15(m,8H),0.80(m,4H)；

C.将60～80mg的共轭聚合物2和10～30mL四氢呋喃加入到圆底烧瓶中，于-78～-100℃下预冷15～30min，待溶液降温到-78～-100℃后，抽成真空再充入氩气操作2～3次；用注射器在圆底烧瓶中缓慢地逐滴加入2～5mL三甲胺后，关闭制冷，等1～2h后将圆底烧瓶置于冰水浴中，逐渐恢复至室温后，磁力搅拌，反应24～36h，再通过注射器逐滴加入10～20mL水，搅拌混匀后，冷却至-78～-100℃，抽成真空充入氩气后，逐滴加入2～5mL三甲胺，关闭制冷，待1～2h后将圆底烧瓶置于冰水浴中，逐渐恢复至室温后，磁力搅拌，反应24～36h，然后减压除去大部分的四氢呋喃溶剂，再加入预冷的10mL丙酮，析出沉淀，用滴管小心地吸取上层清液，将沉淀用预冷的丙酮洗涤2～3次，每次等沉淀下沉完全后，用滴管小心地吸取上层清液，合并上层清夜，减压旋蒸，除去溶剂丙酮，干燥得到阳离子共轭聚合物；¹H>3OD):δ8.07-7.51(m,10H),3.31-3.22(t,4H),3.04(s,18H),2.25(br,4H),1.57(br,4H),1.18(br,8H),0.77(br,4H)；

(3)阳离子共轭聚合物与铱配合物发生FRET

将阳离子共轭聚合物(最终的浓度为2.95×10^-6M)、铱配合物(最终的浓度为1×10^-5M)与水按体积比90：1：9混合，即得到基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系。

分别测定阳离子共轭聚合物和铱配合物的激发光谱及发射光谱，确定两者可以发生荧光共振能量转移，如图1所示，可以看出阳离子共轭聚合物的发射光谱(B)与铱配合物(C)的激发光谱有重叠，所以此体系有可能发生FRET，阳离子共轭聚合物做供体，铱配合物做受体。

发生FRET的首要条件是能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠，其次是能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。分别测定阳离子共轭聚合物和铱配合物的激发光谱及发射光谱，确定两者可以发生荧光共振能量转移。测定阳离子共轭聚合物、铱配合物Zeta电位。实验数据表明，纯阳离子共轭聚合物的Zeta电位为103mV，在与铱配合物混合之后，Zeta电位下降到13.1mV，这表明因为静电作用使得铱配合物聚集在阳离子共轭聚合物周围，而铱配合物表面的正电荷降低了阳离子共轭聚合物的Zeta电位，通过共轭效应形成复合物。

二、应用实施例

实施例1

基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系检测凝血酶

1、检测方法

将2μL 10μM的凝血酶适配体溶液加入到100μL上述具体实施例一中制备的基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的凝血酶溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的凝血酶对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与凝血酶浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中凝血酶的浓度；

其中凝血酶适配体是一小段经体外筛选得到的能与凝血酶进行高亲和力和强特异性结合的寡核苷酸序列，其核苷酸序列为5'-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'。

上述缓冲溶液为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.1～0.2M；荧光测定条件如下：激发波长是380nm，狭缝宽度是10nm，电压是700V，响应时间是0.01s，扫描速度是1200nm/min。

实验结果如图2所示，随着凝血酶溶液的加入，破坏了DNA，阳离子共轭聚合物与铱配合物重新发生了FRET，530nm处的荧光增强，415nm处的荧光减弱。根据凝血酶浓度与荧光强度比值的关系曲线如图3所示，说明该传感器对0.01pM～200pM的凝血酶溶液有线性响应，线性方程为：I＝0.20logc+0.83，相关系数R²＝0.9971，检测限为2.3fM。

2、特异性实验

选择性实验与抗干扰实验所用到的其他酶的缩写如下：辣根过氧化物酶(HRP)，糜蛋白酶(CHY)，羧肽酶(CPY)，溶菌酶(Lysozyme)，乙酰胆碱酯酶(AchE)，木瓜蛋白酶(Papain)，牛血清蛋白(BSA)。

选择性实验设计说明，结果如图4所示。从图可以看出，当加入其他酶(浓度：10nM)时，FRET效率与空白对照相比没有变化，而加了100pM凝血酶的荧光强度的比值达到最大，说明本体系选择性良好。

抗干扰实验设计说明，结果如图5所示，分别将辣根过氧化物酶、糜蛋白酶、羧肽酶、溶菌酶、乙酰胆碱酯酶、木瓜蛋白酶、牛血清蛋白酶(各酶浓度均为10nM)与100pM凝血酶混合时，415nm和530nm处的荧光强度比值与单个的凝血酶相比几乎没有变化，此外，这八种物质共存时也不会明显影响传感器对凝血酶的响应信号，说明本体系抗干扰性良好。

实施例2

基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系检测三磷酸腺苷，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的三磷酸腺苷适配体溶液加入到100μL上述具体实施例一中制备的基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的三磷酸腺苷溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的三磷酸腺苷对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与三磷酸腺苷浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中三磷酸腺苷的浓度。上述缓冲溶液为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.1～0.2M；荧光测定条件如下：激发波长是380nm，狭缝宽度是10nm，电压是700V，响应时间是0.01s，扫描速度是1200nm/min。

实验结果如图6所示，荧光强度比值与三磷酸腺苷浓度的对数值之间呈现线性关系，线性方程为：I＝0.19logc+0.24，相关系数R²＝0.9947，线性范围为10pM～20nM，检测限为2pM。线性良好，可以用于未知样品检测。

实施例3

基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系检测血小板衍生生长因子，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的血小板衍生生长因子适配体溶液加入到100μL上述具体实施例一中制备的基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的血小板衍生生长因子溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的血小板衍生生长因子对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与血小板衍生生长因子浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中血小板衍生生长因子的浓度。上述缓冲溶液为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.1～0.2M；荧光测定条件如下：激发波长是380nm，狭缝宽度是10nm，电压是700V，响应时间是0.01s，扫描速度是1200nm/min。

实验结果如图7所示，荧光强度比值与血小板衍生生长因子浓度的对数值之间呈现线性关系，线性方程为：I＝0.58+0.22logc，相关系数R²＝0.9855，线性范围为0.1pM～1000pM，检测限为0.01pM。线性良好，可以用于未知样品检测。

实施例4

基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系检测可卡因，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的可卡因适配体溶液加入到100μL上述具体实施例一中制备的基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的可卡因溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的可卡因对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与可卡因浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中可卡因的浓度。上述缓冲溶液为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.1～0.2M；荧光测定条件如下：激发波长是380nm，狭缝宽度是10nm，电压是700V，响应时间是0.01s，扫描速度是1200nm/min。

实验结果如图8所示，荧光强度比值与的对数之间呈现线性关系，线性方程为：I＝0.78+0.20logc，相关系数R²＝0.9822，线性范围为0.01nM～150nM，检测限为3pM。线性良好，可以用于未知样品检测。

实施例5

基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系检测溶菌酶，具体方法步骤如下：将2μL 10μM的溶菌酶适配体溶液加入到100μL上述具体实施例一中制备的基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系中，然后分别将不同浓度的溶菌酶溶液加入到荧光传感器体系中，然后加入缓冲溶液，于37℃下温育40～60min，检测荧光强度的变化，计算阳离子共轭聚合物(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的溶菌酶对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与溶菌酶浓度之间的定量关系；根据两者定量关系，检测待测样品中溶菌酶的浓度。上述缓冲溶液为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.1～0.2M；荧光测定条件如下：激发波长是380nm，狭缝宽度是10nm，电压是700V，响应时间是0.01s，扫描速度是1200nm/min。

实验结果如图9所示，荧光强度比值与溶菌酶的对数之间呈现线性关系，线性方程为：I＝1.16+0.32logc，相关系数R²＝0.9907，线性范围为0.005nM～2nM，检测限为1pM。线性良好，可以用于未知样品检测。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

序列 表

<110> 宁波大学

<120> 基于阳离子共轭聚合物与铱配合物FRET 效应的荧光传感器体系的制备

方法及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 凝血酶适配体

<400> 1

5'-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3' 29