咔啉类化合物及其合成方法与抗乙酰胆碱酯酶活性

摘要

本发明涉及一类咔啉类化合物及其合成方法与抗乙酰胆碱酯酶活性。咔啉类化合物已被证明具有抗微生物、抗癌、抗病毒等多种生物活性，但尚未见到有关其抗乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性的研究报道。本发明所涉及的咔啉类化合物分为A、B、C、D类，其中B和D类为2‑芳基咔啉盐化合物，A类和C类为2‑芳基‑3,4‑二氢咔啉盐化合物。活性测定表明，本发明所涉及的化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶具有显著的抑制活性，具有作为有效成分用于制备治疗阿尔茨海默病的药物的巨大潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及一类化合物及其应用，具体涉及一类咔啉类化合物及其合成方法与抗乙酰胆碱酯酶活性。

背景技术

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholine Esterase，AChE)是一种丝氨酸水解酶，为体内正常神经传导活动所必须。AChE主要生理功能是把胆碱能突触间隙内的乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)水解为乙酸和胆碱，从而终止神经冲动的传递。AChE对生理浓度的乙酰胆碱具有很强的催化效能和很高的特异性。

阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄有关的不可逆性神经退化性疾病，其主要特征是记忆力渐进性损失、语言功能下降和其他的认知能力的障碍。据估计，全世界患有AD病的人达四千多万。因此，AD病对公众健康和社会的危害是极其巨大的。现代神经病理学研究证明，AD患者的记忆力障碍和行为异常与其中枢神经系统中不同区域，尤其是大脑皮层和海马中的乙酰胆碱的水平较低有关。因此，研发治疗AD病药物的主要策略就是应用AChE抑制剂，后者通过抑制乙酰胆碱的水解可提高大脑神经系统中乙酰胆碱的水平。

目前，由美国食品和药物管理局批准的用于治疗AD病的AChE抑制剂类药物有四种：塔克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)和卡巴拉丁(rivastigmine)。但是，这些药物都存在一些明显的副作用，如扰乱肠道功能、肝毒或与生物利用度有关的一些问题等。因此，研发更理想的治疗AD病的药物仍然是一个很迫切的任务。

咔啉类生物碱(Carboline alkaloids)又称哈曼生物碱(Harman alkaloids)，广泛分布于植物、动物、海洋生物和人体中。该类化合物已被证明具有抗微生物、抗癌、抗病毒等多种生物活性。基于咔啉类生物碱的抗菌活性，我们曾设计并合成了一系列新的β-咔啉化合物，并发现该类化合物对多种植物病原真菌具有优异的抑制活性(Zhu,等.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2016,26,2413–2417)。但是，到目前为止，尚未见到有关2-芳基咔啉盐和2-芳基-3,4-二氢咔啉盐类化合物抗乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一类咔啉类化合物及其合成方法与抗乙酰胆碱酯酶活性，此类化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶具有很强的抑制活性和选择性。

本发明所采用的技术方案为：

咔啉类化合物，其特征在于：

具有如下分子结构：

A类：

B类：

C类：

D类：

其中：

R¹是氢原子、烷基、环烷基、不饱和烃基、芳基或芳杂环基、杂环烃基、含芳基或杂环芳基的脂肪烃基、酰基；

R³和R⁴是氢原子、脂肪烃基、环烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R³和R⁴的取代位置是2′,3′,4′,5′,6′的任何位置；

R²是氢原子、脂肪烃基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R²的取代位置是5,6,7,8的任何位置；

X^-是硫酸根、卤素负离子、磷酸根、磷酸氢根、有机酸酸根或磺酸根。

咔啉类化合物的制备方法，其特征在于：

C类和D类咔啉类化合物的合成方法为：

其中：

R¹是氢原子、烷基、环烷基、不饱和烃基、芳基或芳杂环基、杂环烃基、含芳基或杂环芳基的脂肪烃基、酰基；

R³和R⁴是氢原子、脂肪烃基、环烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R³和R⁴的取代位置是2′,3′,4′,5′,6′的任何位置；

R²是氢原子、脂肪烃基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R²的取代位置是5,6,7,8的任何位置。

2-(2-氯乙基)-3-吲哚甲醛类化合物的合成方法为：

其中：

R¹是氢原子、烷基、环烷基、不饱和烃基、芳基或芳杂环基、杂环烃基、含芳基或杂环芳基的脂肪烃基、酰基；

R³和R⁴是氢原子、脂肪烃基、环烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R³和R⁴的取代位置是2′,3′,4′,5′,6′的任何位置；

R²是氢原子、脂肪烃基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R²的取代位置是5,6,7,8的任何位置。

2-芳基-3,4-二氢-γ-咔啉盐酸盐类化合物的合成方法为：

其中：

R¹是氢原子、烷基、环烷基、不饱和烃基、芳基或芳杂环基、杂环烃基、含芳基或杂环芳基的脂肪烃基、酰基；

R³和R⁴是氢原子、脂肪烃基、环烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R³和R⁴的取代位置是2′,3′,4′,5′,6′的任何位置；

R²是氢原子、脂肪烃基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R²的取代位置是5,6,7,8的任何位置。

如所述的咔啉类化合物的应用，其特征在于：

该类化合物作为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制剂，用于制备治疗人老年性痴呆病药物。

含有所述的咔啉类化合物的药物。

本发明具有以下优点：

本发明所涉及的一类2-芳基咔啉盐类化合物及其3,4-二氢衍生物，对AChE和BChE具有很强的抑制活性，具有作为抑制AChE和BChE的活性成分用于制备治疗AD病的药物的巨大潜力。同时，本发明所涉及的化合物具有可溶于水的特点。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

根据结构特点，本发明所涉及的咔啉类化合物可分为A、B、C、D类，其中B和D类为2-芳基咔啉盐化合物，A类和C类为2-芳基-3,4-二氢咔啉盐化合物。活性测定表明，本发明所涉及的化合物对AChE和BChE具有显著的抑制活性，具有作为有效成分用于制备治疗AD病的药物的巨大潜力。

所述咔啉类化合物具有如下分子结构：

A类：

B类：

C类：

D类：

其中：

R¹是氢原子、烷基、环烷基、不饱和烃基、芳基或芳杂环基、杂环烃基、含芳基或杂环芳基的脂肪烃基、酰基；

R³和R⁴是氢原子、脂肪烃基、环烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R³和R⁴的取代位置是2′,3′,4′,5′,6′的任何位置；

R²是氢原子、脂肪烃基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R²的取代位置是5,6,7,8的任何位置；

X^-是硫酸根、卤素负离子、磷酸根、磷酸氢根、有机酸酸根或磺酸根。

上述A类和B类咔啉类化合物，按照我们以前报道的方法合成(Zhe Hou,etal.J.Agric.Food Chem.,2016,64(14),2847-2854.)。其合成路线如下：

上述C类和D类咔啉类化合物的合成路线为：

其中：

R¹是氢原子、烷基、环烷基、不饱和烃基、芳基或芳杂环基、杂环烃基、含芳基或杂环芳基的脂肪烃基、酰基；

R³和R⁴是氢原子、脂肪烃基、环烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R³和R⁴的取代位置是2′,3′,4′,5′,6′的任何位置；

R²是氢原子、脂肪烃基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R²的取代位置是5,6,7,8的任何位置。

具体地：

2-(2-氯乙基)-3-吲哚甲醛类化合物的合成方法为：

其中：

R¹是氢原子、烷基、环烷基、不饱和烃基、芳基或芳杂环基、杂环烃基、含芳基或杂环芳基的脂肪烃基、酰基；

R³和R⁴是氢原子、脂肪烃基、环烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R³和R⁴的取代位置是2′,3′,4′,5′,6′的任何位置；

R²是氢原子、脂肪烃基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R²的取代位置是5,6,7,8的任何位置。

2-芳基-3,4-二氢-γ-咔啉盐酸盐类化合物的合成方法为：

其中：

R¹是氢原子、烷基、环烷基、不饱和烃基、芳基或芳杂环基、杂环烃基、含芳基或杂环芳基的脂肪烃基、酰基；

R³和R⁴是氢原子、脂肪烃基、环烷基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R³和R⁴的取代位置是2′,3′,4′,5′,6′的任何位置；

R²是氢原子、脂肪烃基、烷氧基、卤素、羟基、硝基、氰基、三氟甲基或酰基；R²的取代位置是5,6,7,8的任何位置。

本发明涉及的该类化合物作为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制剂，可用于制备治疗人老年性痴呆病药物。含有该类咔啉类化合物的药物可治疗老年性痴呆病。

采用Ellman偶合酶法(G.L.Ellman,et al.Biochem.Pharmacol.1961,7,88.)，对上述A-D化合物进行了抑制AChE和BChE活性研究。通过与临床上应用的乙酰胆碱酯酶抑制剂药物——加兰他敏(Galantamin)进行比较，证明本发明所涉及的咔啉类化合物A-D是一类普遍具有强的抗AChE和BChE活性且能够用于治疗人类老年性痴呆病用途的药物。对于其中抗酶活性较强的化合物，进一步测定了其半数抑制浓度(IC₅₀)，证明部分化合物的对AChE的IC₅₀接近加兰他敏，具有作为制备治疗人老年性痴呆病药物的巨大潜力。

表1A-D类化合物对AChE和BChE的抑制活性

以下结合附表和合成方法及活性测定对本发明作进一步详细说明：

一、2-(2-羟基乙基)-3-吲哚甲醛和1-甲基-2-(2-羟基乙基)-3-吲哚甲醛的制备：

通用方法：在搅拌下，将三氯氧磷(0.23mL，383.3mg，2.5mmol)滴加于0℃的5mL干燥的DMF中，然后再加入2-(2-羟基乙基)吲哚或1-甲基-2-(2-羟基乙基)吲哚(1.0mmol)。0℃反应1h，然后加热至40℃下反应10-15h，直至TLC显示反应完全。向反应液中加入10mL水，加入饱和NaHCO₃水溶液调至pH>2SO₄干燥。减压蒸除溶剂，所得残留物进行硅胶(200-300目，100mL)柱层析分离，得红棕色固体(2-(氯乙基)-吲哚-3-甲醛或1-甲基-2-(氯乙基)-吲哚-3-甲醛)，产率74-76％。

二、化合物C、D的制备：

通用方法：将2-(氯乙基)-吲哚-3-甲醛或1-甲基-2-(氯乙基)-吲哚-3-甲醛(1.0mmol)溶于1,4-二氧六环(5-10mL)中，然后苯胺或取代苯胺(1.0mmol)。下搅拌下于65-70℃反应1-2d。将反应液冷却至室温，收率收集不溶物。用约5mL乙酸乙酯洗涤固体，干燥，得化合物C或D。

三、化合物C、D的物理性质和结构分析：

以下是采用上述方法合成的化合物C、D的名称、编号和波谱数据。

氯化1-甲基-2-苯基-3,4-二氢-γ-咔啉(C1)：¹H>6)δ9.57(1H,s),8.02-8.04(1H,m),7.76(3H,d,J＝7.7Hz),7.63(2H,t,J＝8.0Hz),7.52(1H,t,J＝7.4Hz),7.45(1H,2×t,J＝7.2,1.5Hz),7.42(1H,2×t,J＝7.2,1.4Hz),4.59(2H,t,J＝8.5Hz),3.92(3H,s),3.64(2H,t,J＝8.5Hz)；¹³C>6)δ155.8,151.8,143.4,139.5,130.1,129.8,128.7,124.9,124.8,124.4,122.0,119.3,112.3,49.2,31.2,21.3.

氯化1-甲基-2-(2-氟苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C2)：¹H>3OD)δ9.24(1H,s),7.92(1H,d,J＝7.5Hz),7.75(1H,t,J＝7.9,1.5Hz),7.71(1H,d,J＝8.1Hz),7.63-7.58(1H,m),7.49(1H,2×t,J＝7.3,1.2Hz),7.48-7.42(3H,m),(t,J＝8.4Hz,2H),3.96(s,3H),3.67(t,J＝8.5Hz,2H)；¹³C>3OD)δ159.1,157.1(d,J＝250.1Hz),153.8,141.6,132.70(d,J＝8.0Hz)127.6,127.0(d,J＝3.9Hz),126.5,126.4,120.1,118.4(d,J＝19.6Hz),113.2,110.0,51.73(s),31.78(s),22.93(s).

氯化1-甲基-2-(4-氯苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C3)：¹H>3OD)δ9.31(s,1H),7.95(d,J＝7.6Hz,1H),7.70(d,J＝7.8Hz,1H),7.69(d,J＝8.8Hz,2H),7.63(d,J＝8.8Hz,2H),7.48(2×t,J＝7.2,1.3Hz,1H),7.44(2×t,J＝7.4,1.0Hz,1H),4.60(t,J＝8.5Hz,2H),3.95(s,3H),3.66(t,J＝8.5Hz,2H)；¹³C>3OD)δ156.8,153.3,143.7,141.6,135.8,131.2,126.7,126.6,126.3,124.8,120.2,113.2,110.1,50.8,31.7,22.7.

氯化1-甲基-2-(4-溴苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C4)：¹H>3OD)δ9.31(1H,s),7.96(1H,d,J＝7.3Hz),7.77(2H,d,J＝8.9Hz),7.70(1H,d,J＝7.9Hz),7.63(d,J＝8.9Hz,2H),7.48(1H,2×t,J＝7.7,1.3Hz),7.44(1H,2×t,J＝7.5,1.1Hz),4.60(2H,t,J＝8.5Hz),3.95(3H,s),3.66(2H,t,J＝8.5Hz)；¹³C>3OD)δ156.6,153.4,144.2,141.6,134.2,126.7,126.6,126.3,125.0,123.6,120.2,113.2,110.2,50.8,31.7,22.7.

氯化1-甲基-2-(4-碘苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C5)：¹H>6)δ9.56(1H,s),8.01(1H,m),7.99(2H,d,J＝8.8Hz),7.78-7.73(1H,m),7.57(2H,d,J＝8.8Hz),7.47-7.41(2H,m),4.55(2H,t,J＝8.5Hz),3.91(3H,s),3.62(2H,t,J＝8.5Hz)；¹³CNMR(125MHz,DMSO-d₆)δ155.5,152.1,143.0,139.6,138.4,124.92,124.86,124.6,124.1,119.3,112.4,108.1,94.4,48.9,31.3,21.3.

氯化1-甲基-2-(3-甲氧基苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C5)：¹H>3OD)δ9.29(1H,s),7.96(1H,d,J＝7.3,1.2Hz),7.69(1H,d,J＝7.9Hz),7.51(1H,t,J＝8.2Hz),7.47(1H,2×t,J＝7.7,1.4Hz),7.43(1H,2×t,J＝7.5,1.1Hz),7.26(1H,t,J＝2.2Hz),7.24(1H,4×d,J＝7.9,2.2,0.7Hz),7.09(1H,4×d,J＝8.4,2.3,0.6Hz),4.60(2H,t,J＝8.5Hz),3.94(3H,s),3.91(3H,s),3.65(2H,t,J＝8.5Hz)；¹³CNMR(125MHz,DMSO-d₆)δ158.6,152.7,151.6,139.5,132.1,131.1,126.4,124.9,124.8,124.5,121.1,119.1,113.2,112.4,107.3,56.4,50.3,31.3,21.5.

氯化1-甲基-2-(2-甲基苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C6)：¹H>6)δ9.42(1H,s),7.96(1H,d,J＝7.1Hz),7.78(1H,d,J＝7.7Hz),7.64(1H,d,J＝7.2Hz),7.51-7.39(3H,m),4.39(2H,t,J＝8.5Hz),3.93(3H,s),3.67(2H,t,J＝8.6Hz),2.98(3H,s)；¹³CNMR(125MHz,DMSO)δ158.6,151.4,142.8,139.4,132.9,131.7,129.8,127.5,125.9,124.9,124.7,124.4,119.0,112.3,107.1,50.3,31.2,21.4,17.3.

氯化1-甲基-2-(3-甲基苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C7)：¹H>6)δ9.57(1H,s),8.03(1H,dd,J＝6.4,2.1Hz),7.77(1H,dd,J＝6.7,1.9Hz,1H),7.61(1H,s),7.56(br>13C>6)δ155.6,151.7,143.3,139.54,139.50,129.6,129.3,124.9,124.8,124.4,122.4,119.3,119.1,112.3,107.8,49.2,31.2,21.3,20.9.

氯化1-甲基-2-(4-氰基苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C8)：¹H>3OD)δ9.41(1H,s),7.98(3H,d-like,J＝8.9Hz,3H),7.87(2H,d-like,J＝8.9Hz),7.72(1H,d,J＝7.8Hz),7.50(1H,2×t,J＝7.8,1.4Hz),7.46(1H,2×t,J＝7.5,1.1Hz),4.64(2H,t,J＝8.4Hz),3.96(3H,s),3.68(2H,t,J＝8.4Hz)；¹³C>3OD)δ156.5,154.5,148.2,141.8,135.2,127.0,126.6,126.6,123.7,120.4,118.7,113.4,113.2,110.9,50.3,31.8,22.9.

氯化1-甲基-2-(3-三氟甲基苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C9)：¹H>3OD)δ¹H>3OD)δ9.39(1H,s),8.08(1H,s),7.97(1H,d,J＝7.0Hz),7.97(1H,d,J＝6.9Hz),7.85-7.81(2H,m),7.71(1H,d,J＝7.9Hz),7.50(1H,2×t,J＝7.7,1.3Hz),7.46(1H,2×t,J＝7.5,1.1Hz),4.65(2H,t,J＝8.5Hz),3.96(3H,s),3.68(2H,t,J＝8.5Hz)；¹³C>3OD)δ157.2,153.8,145.7,141.7,132.3,127.0(br>

氯化1-甲基-2-(4-三氟甲基苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C10)：¹H>6)δ9.65(1H,s),8.03-7.96(5H,m),7.79(1H,dd,J＝6.2,2.5Hz),7.49-7.44(2H,m),4.62(2H,t,J＝8.4Hz),3.93(3H,s),3.66(2H,t,J＝8.5Hz)；¹³C>6)δ167.0,156.0,152.9,146.4,139.7,126.9(q,J＝4.2Hz),125.1,124.9,124.8,122.7,119.4,113.7,112.5,108.5,48.8,31.4,21.4.

氯化1-甲基-2-(4-硝基苯基)-3,4-二氢-γ-咔啉(C11)：¹H>6)δ9.75(1H,s),8.46(2H,d,J＝9.1Hz),8.07(1H,dd,J＝8.8,2.5Hz),8.04(2H,d,J＝9.1Hz),7.80(1H,dd,J＝6.4,2.6Hz),7.46-7.48(2H,m),4.63(2H,t,J＝8.4Hz),3.94(3H,s),3.68(2H,t,J＝8.4Hz)；¹³C>6)δ155.7,153.7,148.0,146.2,139.9,125.3,125.1,125.0,124.9,122.7,119.6,112.7,109.0,48.7,31.5,21.5.

氯化1-甲基-2-(4-溴苯基)-γ-咔啉(D1)：¹H>3OD)δ9.31(1H,s),7.96(1H,d,J＝7.3Hz),7.77(2H,d,J＝8.9Hz),7.70(1H,d,J＝7.9Hz),7.63(2H,d,J＝8.9Hz),7.48(1H,2×t,J＝7.7,1.3Hz),7.44(1H,2×t,J＝7.5,1.1Hz),4.60(2H,t,J＝8.5Hz),3.95(3H,s),3.66(2H,t,J＝8.5Hz)；¹³C>3OD)δ156.6,153.4,144.2,141.6,134.2,126.7,126.6,126.3,125.0,123.6,120.2,113.2,110.2,50.8,31.7,22.7.

氯化1-甲基-2-(4-碘苯基)-γ-咔啉(D2)：¹H>6)δ9.56(1H,s),8.01(1H,m),7.99(2H,d,J＝8.8Hz),7.78-7.73(1H,m),7.57(2H,d,J＝8.8Hz),7.47-7.41(2H,m),4.55(2H,t,J＝8.5Hz),3.91(3H,s),3.62(2H,t,J＝8.5Hz)；¹³C>6)δ155.5,152.1,143.0,139.6,138.4,124.92,124.86,124.6,124.1,119.3,112.4,108.1,94.4,48.9,31.3,21.3.

三、化合物抑制AChE和BChE活性的测定：

1.试剂的配制

PBS(0.01M，pH 7.4)：将8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O(0.008mol)和0.26g>2PO₄(0.002mol)溶于900mL无离子水中，再用1％盐酸或1％氢氧化钠调节pH至7.4，最后用无离子水定容至1.0L。

乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶溶液：称取一定量的乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶，溶于1mL的甘油和PBS的混合溶液(1:4，v/v)中，得2.0U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液或2/3U/mL的丁酰胆碱酯酶溶液，保存于-20℃冰箱中备用。

碘化硫代乙酰胆碱溶液和碘代硫化丁酰胆碱溶液(底物溶液)：称取8.6754mg(30μmol)碘化硫代乙酰胆碱或5.0mg(16μmol)碘代硫化丁酰胆碱，溶于约2mL的无离子水中，加入10μL 1.0M的盐酸溶液，再用无离子水定容至4mL，得7.5mM的碘化硫代乙酰胆碱溶液或4mM的丁酰胆碱酯酶的底物溶液，储存于棕色瓶，4℃避光保存。

5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液(DTNB)：将0.0198g 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(北京百灵威科技有限公司)和0.0075g NaHCO₃溶于5mL>

供试样品溶液：称取10mmol的供试样品，溶于1mL甲醇，得10mM的供试样品母液。使用前用PBS(0.01M，pH 7.4)稀释至所需浓度。阳性对照药物为氢溴酸加兰他敏(G0293，TCI公司)，采用与上相同的方法配制其供试溶液。

2.活性测定

在96孔酶标板的每孔中依次加入90μL PBS、10μL乙酰胆碱酯酶溶液(或硫代丁酰胆碱酯酶溶液)和10μL供试样品溶液。37℃条件下静置约10min，然后每孔分别加入60μLDTNB溶液。将酶标板放入装有碎冰的保温盒中，充分冷却约20min后，再向每孔分别加入30μL碘化硫代乙酰胆碱溶液(或20μL碘化硫代丁酰胆碱底物溶液)。将酶标板至于37℃保温箱中，反应约40min。用酶标仪测定每孔对波长405nm的吸光度。每个试验设三个重复，以不含供试样品的测定液为空白对照，以不含酶的测定液为相应的本底。按照下法计算各样品对酶的抑制率。

抑制率％＝[(A_空白-A_空白本底)-(A_样品-A_样品本底)/(A_空白-A_空白本底)]×100

采用相同的方法测定供试化合物系列浓度的抑酶活性，以浓度的对数值为横坐标，以相应的抑制率的几率值为纵坐标，采用最小二乘法求出其对酶的毒力方程，由毒理方程再求出相应的半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果表明，在测试浓度下，所有的供试化合物对AChE和BChE均表现出了一定的抑制活性。其中部分化合的活性接近临床上应用的乙酰胆碱酯酶抑制剂药物——加兰他敏。由此可见，本发明涉及的咔啉类化合物普遍具有较强的抑制乙酰胆碱酯酶抑制活性，具有用于制备人老年性痴呆病药物的潜在用途，可作为制备人老年性痴呆病药物的有效成分。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。