测定土壤有效磷的全解离型DGT 结合膜及其制备方法

摘要

本发明涉及一种测定土壤有效磷的全解离型DGT结合膜及其制备方法，材料组成为：有效态磷结合材料纳米Mg‑Al‑Fe‑LDHs、结合材料分散剂、丙烯酰胺凝胶等。将上述材料超声混匀，经蠕动泵泵入四周加有一定厚度垫片的高硅玻璃平板槽，封口后在42‑46℃下反应至少1h，制成DGT结合膜。本发明的结合膜材料能高效、快速的富集有效态磷，且在加入8ml～10ml浓硝酸后30min内能完全解离，本结合膜克服了传统DGT结合膜解离慢且不完全、实验室制备困难、通用性差、对磷吸附能力差、价格高等缺点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤中有效磷的测定方法，特别涉及一种有效态磷结合材料纳米Mg-Al-Fe-LDHs做成的固体结合膜的薄膜梯度扩散技术测定土壤中有效磷的方法。

背景技术

土壤磷元素作为植物营养的主要来源之一，对植物生长起着重要作用，植物根系早期的形成和生存需要土壤提供充分的磷。但是随着磷肥的过量使用，水体富营养化等一系列全球变化问题的加剧，使人们更意识到农田资源环境的重要性。因此，发明一种新型测定土壤磷的方法，合理施肥，增加磷肥的利用率，对提高作物产量和农产品利用率有着深远的意义。

土壤有效磷的含量是指能为当季作物吸收的磷量，是土壤磷素养分供应水平高低的指标。土壤磷素含量高低在一定程度反映了土壤中磷素的贮量和供应能力。目前，土壤磷测定的主要方法有：Olsen法，在国内外广泛使用，适用于中性微酸性和石灰性土壤；Bray法，在酸性土壤效果良好；树脂法，测定结果和植物生长相关性高。但是常规方法测定土壤有效磷的过程较为复杂、耗时较长，不适合进行现场测试。所以为了得到简单、快捷的土壤有效磷测定方法而且所测得的土壤有效磷与测定时间的相关性良好，运用DGT进行土壤有效磷的测定尤为重要。

DGT(diffusive gradients in thin films，薄膜扩散梯度技术)是近十几年快速发展起来的一种用于水体、沉积物和土壤中有效态(非稳态)重金属原位富集的方法。与其他传统的形态分析技术相比，该技术可以有效地测定自然界中重金属生物有效态，能更好的反映生物体所吸收的重金属含量。将DGT技术应用于测定土壤有效磷的含量是一个新的突破，并且使用纳米Mg-Al-Fe-LDHs做结合膜，能够百分百解离，克服了传统DGT结合膜解离慢且不完全、实验室制备困难、通用性差、对磷吸附能力差、价格高等缺点，利于DGT在国内大面积的推广和使用。

发明内容

本发明目的在于提供一种以纳米Mg-Al-Fe-LDHs为固态结合膜的薄膜梯度扩散技术测定土壤中有效磷的含量，具体是一种测定土壤有效磷的全解离型DGT结合膜及其制备方法。

本发明实现目的的技术方案是：

一种测定土壤有效磷的全解离型DGT结合膜，材料组成为：有效态磷结合材料纳米Mg-Al-Fe-LDHs、结合材料分散剂、丙烯酰胺凝胶等。将上述材料超声混匀，经蠕动泵泵入四周加有一定厚度垫片的高硅玻璃平板槽，封口后在42～46℃下反应至少1h，制成DGT结合膜。

所述的测定土壤有效磷的全解离型DGT结合膜，所述纳米Mg-Al-Fe-LDHs中Mg²⁺：(Al³⁺+Fe³⁺⁾＝2：1，其中Fe³⁺/(Al³⁺+Fe³⁺)的比例为0～1。所述分散剂为0.1～0.5体积％的酒精溶液。

纳米Mg-Al-Fe-LDHs按以下方法制备：保持总盐浓度0.5mol/L，V_(H2O)：V_(NH4(OH))＝4:1～4.5:1，随后使盐溶液剧烈搅拌，搅拌频率为40Hz～50Hz/s；缓慢加入20～25体积％的氨水溶液(氨水浓度为25～28质量％)，在8min～10min内加完，连续搅拌30min，然后用MQ水冲洗3-5次，直至滤液加入硝酸银溶液后无沉淀产生。将滤饼取出后放入高压反应釜60℃10Mpa下陈化反应60min。再将陈化后的Mg-Al-Fe-LDHs立即放入超低温冰箱冷冻24h后取出，再进行冷冻干燥72h后过200目筛，得到纳米Mg-Al-Fe-LDHs。

所述丙烯酰胺凝胶的组成为：10～15wt％的丙烯酰胺和0.4wt％的交联剂，所述交联剂为烯丙基改性低温活性琼脂糖。

丙烯酰胺凝胶的制备方法：制备100mL凝胶溶液。称取0.4g交联剂，溶解在15mL水中，再加入47.5mL去离子水混合在一个清洁的容器中，摇动混合物然后加入37.5mL浓度为40wt％丙烯酰胺溶液。通过摇动或搅拌确保凝胶溶液被混合均匀。

烯丙基改性低温活性琼脂糖的制备方法为：将200-400mg硼氢化钠加入10-20mL的烯丙基缩水甘油醚中，得到溶液A；将5-15g琼脂糖加入300mL0.3-0.5mol/L NaOH溶液中，不断搅拌形成琼脂糖悬浊液B；将溶液A加入悬浊液B中形成溶液C，将溶液C连续搅拌12h；将混合液过滤，用蒸馏水洗至中性；脱水，真空干燥，得到所需的交联剂。所述硼氢化钠：烯丙基缩水甘油醚：琼脂糖：NaOH重量比＝0.2-0.4:9-20:5-15:3.6-6。

测定土壤有效磷的全解离型DGT结合膜，其制备方法步骤如下：

⑴称取纳米Mg-Al-Fe-LDHs，加入丙烯酰胺凝胶溶液，使之形成均匀的膜液，混匀，再加入四甲基二乙胺和过硫酸铵溶液，所述四甲基二乙胺：过硫酸铵的体积比为1:3～1:4。再加入分散剂，超声均匀；

⑵经蠕动泵泵入四周加有一定厚度垫片的高硅玻璃平板槽，封口后在42-46℃下反应至少1h，制成DGT结合膜；

⑶将结合膜放于MQ水中进行水合作用，24小时内换水4-5次；水合后的凝胶膜储存在去离子水中待用。

所述丙烯酰胺凝胶：过硫酸铵：四甲基二乙胺的体积比为400:3:1。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明的结合膜价格便宜、制作过程优化，该结合膜在物理强度和吸附性能方面有着优异的性能。与Chelex 100等其他固体结合膜相比，全解离型纳米Mg-Al-Fe-LDHs的制备成本低廉，即该物质的盐溶液与适量氨水的共沉淀反应；制作过程简单，采用冷冻干燥的方法可使产物达到纳米等级，均匀程度好；并且有着极强的吸附性能，短时间内就能达到99％～100％的吸附效率；该结合膜可被HNO₃解离，解离率达100％。

2、本发明与其他化学分析方法不同的是采用DGT原位动态采样技术测定土壤中有效磷的含量，模拟了植物目标物质的吸收过程来完成对植物生物有效性的研究，使其在土壤动力学研究方面有着很大程度的应用空间，避免化学提取法可能存在的形态变化，可以客观反映土壤中磷的存在形式，利于DGT在国内大面积的推广和使用。

3、本发明的结合膜材料能高效、快速的富集有效态磷，且在加入8ml～10ml浓硝酸后30min内能完全解离，克服了传统DGT结合膜解离慢且不完全、实验室制备困难、通用性差、对磷吸附能力差、价格高等缺点。并且运用DGT测定的土壤中有效磷的含量与吸附时间显著相关，测得的生物有效磷浓度与植物体内所吸收的磷显著相关，利于DGT在国内大面积的推广和使用。

附图说明

图1是本发明的DGT装置(diffusive gradients in thin films，薄膜扩散梯度技术)装置示意图；图中：1-结合膜，2-扩散膜，3-滤膜，4-外壳；

图2是纳米Mg-Al-Fe-LDHs结合膜在溴甲酚染色下的显微镜图像(放大40倍)；

图3是有效磷测定的标准曲线；

图4是土壤中有效磷的浓度与吸附时间的相关性；

图5是韭菜叶磷含量与土壤有效磷的相关性。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。

本发明公开了一种用于测定土壤有效磷的全解离型DGT结合膜制备方法，该全解离型DGT结合膜材料是由有效态磷结合材料纳米Mg-Al-Fe-LDHs、结合材料分散剂、丙烯酰胺凝胶等组成。

一、其材料组成为：

⑴纳米材料Mg-Al-Fe-LDHs的化学式通常可以写成[M_1-x^ⅡM_x^Ⅲ(OH)₂]^x+[(A^n-)_x/n·mH₂O]^x-，其中M^Ⅱ、M^Ⅲ分别表示二价、三价阳离子；A^n-表示阴离子，n为其电荷；x为M^Ⅲ/(M^Ⅱ+M^Ⅲ)的摩尔比；m为水的摩尔量；

⑵丙烯酰胺凝胶：由10～15wt％的丙烯酰胺和0.4wt％的交联剂(烯丙基改性低温活性琼脂糖)组成；烯丙基改性低温活性琼脂糖(公开文献为2014100085993，CN103752285A)。

凝胶的制备方法：制备100mL凝胶溶液。称取0.4g交联剂，溶解在15mL水中，再加入47.5mL去离子水混合在一个清洁的塑料瓶中(或烧杯中)，摇动混合物然后加入37.5mL浓度为40wt％丙烯酰胺溶液。通过摇动或搅拌确保凝胶溶液被混合均匀。凝胶溶液可以储存在一个4℃的冰箱中至少3个月。

其中，烯丙基改性低温活性琼脂糖的制备方法为(公开文献为2014100085993CN103752285A,)：将200-400mg硼氢化钠加入10-20mL的烯丙基缩水甘油醚中，得到溶液A；将5-15g琼脂糖加入300mL 0.3-0.5mol/L NaOH溶液中，不断搅拌形成琼脂糖悬浊液B；将溶液A加入悬浊液B中形成溶液C，将溶液C连续搅拌12h；将混合液过滤，用蒸馏水洗至中性；脱水，真空干燥，得到所需的交联剂。所述硼氢化钠：烯丙基缩水甘油醚：琼脂糖：NaOH重量比＝0.2-0.4:9-20:5-15:3.6-6。

⑶分散剂为：0.1～0.5％体积比的酒精。

二、制备方法为：

1、纳米材料的制作方法为：

溶质体系中Mg-Al-Fe-LDHs物质的量比Mg²⁺：(Al³⁺+Fe³⁺)＝2：1，其中Fe³⁺/(Al³⁺+Fe³⁺)的比例为0～1，随后使盐溶液剧烈搅拌，搅拌频率40Hz～50Hz/s；并缓慢加入浓度25～28质量％氨水(20％～25％(v/v))溶液，在8min～10min内加完，连续搅拌30min，然后用MQ水冲洗3-5次，直至滤液加入硝酸银溶液后无沉淀产生。将滤饼取出后放入高压反应釜60℃10Mpa下陈化反应60min。

再将陈化后的Mg-Al-Fe-LDHs立即放入超低温冰箱冷冻24h后取出，再进行冷冻干燥72h后过200目筛，得到纳米Mg-Al-Fe-LDHs。

溶质体系配置方法和具体浓度如下：总盐浓度为1mol/L总体积为1L，其中，Mg²⁺：Al³⁺：Fe³⁺＝2:0.5:0.5；

其中原料液如下：Mgcl₂·6H₂O:1mol/L×1L×2/3×203.3g/mol＝135.53g；

Alcl3·6H₂O：1mol/L×1L×1/6×241.43g/mol＝40.24g；

Felcl3·6H₂O：1mol/L×1L×1/6×270.3g/mol＝45.05g。

2、结合膜的制备过程为：

⑴称取2～4g纳米Mg-Al-Fe-LDHs，加入10mL～15mL丙烯酰胺凝胶溶液使之形成均匀的膜液，超声3～5min，再加入15～20μL的四甲基二乙胺和60～65μL的10wt％～15wt％的过硫酸铵溶液，和1～1.5mL 0.1～0.5体积％的酒精溶液；搅拌均匀；

⑵经蠕动泵泵入四周加有一定厚度垫片的高硅玻璃平板槽，封口后在42-46℃下反应至少1h，制成DGT结合膜；

⑶将结合膜放于MQ水中进行水合作用，24小时内换水4-5次；水合后的凝胶膜储存在去离子水中待用。

本发明的结合膜材料能高效、快速的富集有效态磷，且在加入8ml～10ml浓硝酸后30min内能完全解离，本结合膜克服了传统DGT结合膜解离慢且不完全、实验室制备困难、通用性差、对磷吸附能力差、价格高等缺点。并且运用DGT测定的土壤中有效磷的含量与吸附时间显著相关，测得的生物有效磷浓度与植物体内所吸收的磷显著相关，利于DGT在国内大面积的推广和使用。

本申请提供以下具体的制备及检测实施例。

用于测定土壤有效磷的全解离型DGT结合膜制备方法，步骤如下：

1、土壤采集

采集自然风干土壤，去除土样中的植物残体和石块，研磨后过2mm尼龙筛，混匀备用；

2、结合膜的准备

⑴移取10mL～15mL上述丙烯酰胺凝胶溶液到一个清洁的容器中，加入2～4g含水率40±10％的纳米Mg-Al-Fe-LDHs，微波超声3～5min，使之混合均匀得到成膜液；

⑵并向其中加入60～65μl 10wt％～15wt％的过硫酸铵溶液及15～20μl TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)，1～1.5mL 0.1～0.5体积％的酒精溶液，经蠕动泵泵入四周加有一定厚度垫片的高硅玻璃平板槽；

⑶要使用良好的控制方式，如果出现气泡，移除气泡，封口后放置在42～46℃条件下至少1h，直到结合膜完全形成。

⑷将结合膜放于MQ水中进行水合作用，24小时内换水4-5次；水合后的凝胶膜储存在去离子水中待用。

3、扩散膜的准备

⑴移取10ml～15ml丙烯酰胺凝胶到一个清洁的容器中，然后分别加入70～75μL过硫酸铵溶液(10wt％～15wt％)及25～30μL的TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)，并将它们混合均匀；

⑵经蠕动泵泵入四周加有一定厚度垫片的高硅玻璃平板槽。如果出现气泡，在继续移液之前倾斜器皿，移除气泡，封口后放置在42～46℃条件下至少1h，直到扩散膜完全形成。

⑶将扩散膜放于MQ水中进行水合作用，24小时内换水4-5次；水合后的凝胶膜储存在去离子水中待用。

4、DGT装置的安装：

DGT装置分为三层，由下至上的顺序依次是结合膜、扩散膜和滤膜。本发明中所用结合膜厚度为0.4mm，扩散膜为0.8mm，滤膜为0.13mm。两侧为外壳，其中一侧具有面积为A的开口，由开口侧开始依次为滤膜、扩散膜、结合膜。

5、DGT采样装置准备

⑴称取过2mm筛的风干土50.0g，放入塑料容器中，使土层厚度为1.5cm。添加超纯水使待测土壤中土壤持水量达到60％，密封后平衡48h，然后再次添加超纯水使土壤持水量达到100％平衡24h，使土壤呈黏糊状且表面光滑。

⑵将DGT装置用超纯水冲洗后，用少量待测土壤轻轻涂抹于DGT装置的窗口(滤膜处)表面，用手轻轻扭转将装置压入土壤表面0-1cm，确保DGT装置和土壤接触良好，立即记录时间和环境温度。放置24h后，迅速取出DGT装置，并用超纯水缓缓冲洗，再用滤纸将装置表面的水分擦去。取出DGT结合膜于1.5mL离心管，加入1mL1M的HNO₃，放置24h后稀释待用。

6、结合膜中有效磷的测定

吸取澄清液1mL注入10mL容量瓶中，用水冲稀至6mL，加10微升二硝基酚指示剂，滴加4mol/L NaOH溶液直至溶液变为黄色，再加5微升2mol/L(1/2H₂SO₄)，使溶液的黄色刚刚褪去。然后加钼锑抗试剂1mL，再加水定容至10mL，摇匀。30min后，用880nm或700nm波长进行比色，以空白液的透光率为100(吸光度为0)，读出测定液的透光度或吸收值。

7、配制标准曲线

准确吸取5μg/mL，P标准溶液0、1、2、4、6、8、10mL，分别放入50mL容量瓶中，加水至约30mL，然后加钼锑抗试剂5mL，最后用水定容至50mL。30min后进行比色。各瓶比色液磷的浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mLP。

8、计算土壤中有效磷的含量

按照公式：计算土壤中有效磷的浓度；式中，C_DGT是土壤中有效磷的浓度，μg/L；M是结合膜中有效磷的累积量，ng；Δg是扩散膜和滤膜的厚度之和，cm；T是DGT装置的测量时间，s；D_d是磷在扩散膜里的扩散系数，cm²/s；A是DGT的开口面积，cm²。(如图1中，最右侧的开口A面积)

图4中，实验测得，DGT放置时间24h、48h和72h的过程中，土壤中有效磷的含量为0.099mg/L、0.142mg/L和0.212mg/L，呈现出逐渐上升的趋势。说明土壤有效磷含量与DGT吸附时间呈正相关，相关性系数为0.98149。

图5中，实验测得，抽样选取30个种植韭菜土壤的有效磷最高为11.80mg·L^-1，最低为1.26mg·L^-1，韭菜叶磷含量最高为7.20g·L^-1，最低为1.37g·L^-1。由图5可以看出韭菜叶磷含量与土壤有效磷的相关性曲线呈显著正相关，相关系数R²为0.9327。