以1‑吡啶‑6‑甲氧基‑β‑咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物及其合成方法和应用

摘要

本发明公开了一种以1‑吡啶‑6‑甲氧基‑β‑咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物及其合成方法和应用。该氯化铜(II)螯合物的结构式如下式(I)所示，其制备方法为：取如下式(II)所示化合物和二水合氯化铜，溶于极性溶剂中，进行配位反应，即得。本发明所述的氯化铜(II)螯合物表现出比配体及顺铂更强的抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。式(I)和式(II)所示结构如下。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种以1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物及其合成方法和应用。

背景技术

癌症(又称恶性肿瘤)是一种多基因参与的、逐步发展的全身性、系统性疾病。有资料统计显示，癌症在相当多的国家和地区已成为死亡第一诱因，且呈现多样化、持续增高的发病态势，预计到2020年，全球癌症患者将突破2000万，且这种态势在发展中国家更为严重。如何攻克癌症成为医学界的奋斗目标，随着医学科学的发展人们对肿瘤的认识不断深入，肿瘤发生发展的每个环节都可能成为治疗的潜在靶点。

近年来，随着顺铂等药物的临床应用，金属基螯合物抗肿瘤药物已逐渐成为研究热点。金属的固有属性与生物活性配体分子的结合，为一些高效、低毒、谱广和针对靶向活性的新药研发提供了广阔的空间。

β-咔啉类生物碱是一大类天然来源的生物碱，自然界分布广泛。其中从蒺藜科多年生草本植物骆驼蓬种子中所提取出的最为常见的β-咔啉类生物碱，主要包括去氢骆驼蓬碱及骆驼蓬碱。国内外相关研究发现，β-咔啉类生物碱表现出广谱的抗肿瘤活性，且毒副作用相对较小。β-咔啉类生物碱的结构修饰一直备受科研工作者的关注。一般认为，大多数β-咔啉类生物碱的平面共轭结构以及不同取代基团(如苄基(-C₆H₅)、甲氧基(-OCH₃))的存在与其抗肿瘤活性具有显著关系。目前对β-咔啉类生物碱的研究主要包括以下几个方面：一是基于天然产物化学研究从不同科属的植物中发现并进行分离提纯；二是通过有机合成方法对β-咔啉类生物碱进行全合成或半合成，对其结构进行修饰。另外则是对其药理活性(如抗肿瘤活性)进行分子机理研究。如插入DNA，抑制拓扑异构酶、抑制CDK等。但从目前的研究进展来看，β-咔啉类生物碱在天然植物中的含量一般都比较低，而且提取相对比较复杂，不利于对其进行深入研究，而有机半合成方法在产率上虽具有一定的优势，但受到制取成本的限制，因此目前对β-咔啉类生物碱的拓展研究尚显不足。

另一方面，虽然顺铂已成功上市数十年并成功治疗了多种癌症，但是临床结果显示其仍然存在一些问题，例如抗药性以及毒副作用，有一些癌症天然表现出对顺铂的抗药性，还有的癌症在初步治疗后逐渐也表现出诱发性抗药性。临床前和临床实验均表明：非铂类抗肿瘤药物具有广阔的发展前景，但目前以1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物的研究尚属空白。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖的以1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物，以及它的合成方法和应用。

本发明涉及下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐:

上述式(I)所示化合物的合成方法为：取如下式(II)所示化合物和二水合氯化铜(CuCl₂·2H₂O)，溶于极性溶剂中，进行配位反应，即得到目标产物；

上述合成方法的合成路线如下：

上述合成方法中所涉及的原料式(II)作为配体参与反应，其化学名称为1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉(1-Pyridine-6-Methoxy-β-Carboline)，简称LKL。该化合物可自行设计合成路线进行制备，优选下述方法进行制备：以5-甲氧基色胺和吡啶-2-甲醛为原料，加入酸性物质进行催化闭环(即Pictet-Spengler缩合反应)，所得产物再以Pd/C氧化脱氢，即得。具体合成路线如下：

试剂：(a)二氯甲烷或四氢呋喃；(b)二甲苯或苯甲醚。

上述式(II)所示化合物更为具体的合成方法，包括以下步骤：

①称取5-甲氧基色胺溶于二氯甲烷或四氢呋喃中，再加入吡啶-2-甲醛，搅拌混匀后，向反应体系中滴加酸性物质，搅拌反应；反应结束后，将反应物调至中性或碱性，用乙酸乙酯或氯仿萃取，收集有机相，蒸发溶剂，得到黄色油状固体即化合物1；

②将化合物1溶于二甲苯或苯甲醚中，加入Pd/C，加热条件下反应，所得反应物过滤，洗涤滤饼，收集滤液，蒸发溶剂，即得到式(II)所示化合物的粗产物即化合物2。

上述式(II)所示化合物合成方法的步骤①中，原料5-甲氧基色胺和吡啶-2-甲醛的物质的量之比通常为1：1或1:1.5，优选吡啶-2-甲醛的摩尔量稍大于5-甲氧基色胺的物质的量，以使反应充分进行。滤液的pH值采用碱液调节，所述的碱液可以是氨水，或者是选自乙酸钠、碳酸钠、磷酸钠、碳酸氢钠和碳酸钾中任一种或两种以上碱性物质的水溶液。优选是采用饱和碳酸氢钠溶液或氨水溶液。优选是将反应物的pH值调节至7～9。

上述式(II)所示化合物合成方法的步骤①中，所述的酸性物质可为三氟乙酸、醋酸、盐酸或硫酸。盐酸和三氟乙酸的用量通常为吡啶-2-甲醛体积的4～5倍，若为醋酸，加入量则为吡啶-2-甲醛体积的6～7倍，若为硫酸则加入量为吡啶-2-甲醛体积的2～3倍，本申请中优选三氟乙酸。加入酸性物质后反应优选是在常温下进行。

上述式(II)所示化合物合成方法的步骤①中，原料5-甲氧基色胺与吡啶-2-甲醛在酸催化下发生醛胺缩合反应，形成中间体Schiff碱，Schiff碱在酸的作用下发生闭环反应形成化合物1。合成方法中由于薄层层析(TLC)跟踪检测，通常控制反应时间在1～2h较为合适。反应完成后，须在30～45℃温度范围内减压蒸发溶剂，以防副反应发生。溶剂二氯甲烷或四氢呋喃的用量以能够溶解参加反应的原料为宜，通常情况下，以1mmol 5-甲氧基色胺用0.5～1mL四氢呋喃或0.4～1mL二氯甲烷溶解为基准进行计算。

上述式(II)所示化合物合成方法的步骤②中，Pd/C的加入量通常为化合物1物质的量的1～2倍，所述Pd/C可选择5％Pd/C或10％Pd/C，本方法中优选采用10％Pd/C；该步骤中，反应条件优选在140～160℃条件下进行，更优选是在回流装置中于140～160℃条件下进行回流反应。采用TLC跟踪检测反应是否完全，通常控制反应时间在12～24h较合适。

上述式(II)所示化合物合成方法的步骤②中，通常依次采用甲醇、氯仿、乙酸乙酯多次洗涤滤饼，优选5～10次；对其洗涤顺序并无要求，优选甲醇最先、氯仿次之、乙酸乙酯最后。

上述方法制备得到的是式(II)所示化合物的粗产物，为了进一步提高其纯度，有利于后续反应的进行，优选对上述所得粗产物进行纯化，纯化后再用于本发明目标产物的合成方法中。所述的纯化操作与现有技术相同，具体可以是将粗产物采用快速液相色谱进行纯化，以得到式(II)所示化合物纯品；纯化过程中所用的试剂为由乙酸乙酯和正己烷按3：7～3：9的体积比组成的混合溶剂，或者是由乙酸乙酯和石油醚按3：7～3：9的体积比组成的混合溶剂。

本发明所述式(I)所示化合物的合成方法中，所述的极性溶剂为甲醇与选自水、丙酮、氯仿、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和乙腈中的一种或任意两种以上的组合。优选甲醇在极性溶剂中所占的比例为70～85v/v％。当极性溶剂中含有水、丙酮、氯仿、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和乙腈中的任意两种以上的选择时，在它们的总量不超出30％的前提条件下，它们的配比可以为任意配比。所述极性溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，1mmol式(II)所示化合物和1mmol二水合氯化铜使用35～40mL的极性溶剂来溶解。在具体的溶解步骤中，一般将式(II)所示化合物和二水合氯化铜混合后再加入极性溶剂；也可将式(II)所示化合物和二水合氯化铜分别使用极性溶剂进行溶解，再混合进行反应。

本发明所述式(I)所示化合物的合成方法中，所述二水合氯化铜和式(II)所示化合物的摩尔比为化学计量比，通常为1:1。

本发明所述的式(I)所示化合物具体在合成时，可采用高压溶剂热法或常压溶液法进行合成。

当采用常压溶液法时，其合成方法包括：取式(II)所示化合物和二水合氯化铜溶于极性溶剂中，所得混合液于加热条件下反应，反应物除去部分溶剂，静置，析出，分离出固体，即得目标产物。

上述常压溶液法中，反应优选采用回流反应，反应优选是在45℃至极性溶剂的回流温度范围内进行，更优选是在65～80℃条件下反应。判断反应是否完全可采用薄层层析跟踪检测。在上述限定条件下，反应时间控制在24～48h较为合适。反应物采用浓缩的方式除去部分溶剂，通常是浓缩除去极性溶剂加入量的70～90％。

当采用高压溶剂热法时，其合成方法包括：取式(II)所示化合物和二水合氯化铜溶于极性溶剂中，所得混合液置于容器内，经液氮冷冻后抽至真空，熔封，然后在加热条件下反应，得到目标产物。

上述高压溶剂热法中，所述的容器通常为厚壁硼硅玻璃管，反应温度通常在45～80℃条件下进行，在此温度条件下，反应时间优选控制在48～72h，也可根据实际情况延长至72h以上。

本发明还包括上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物当中的应用。

本发明还包括上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分制备的抗肿瘤药物。

与现有技术相比，本发明提供了一种新的氯化铜(II)螯合物，即以1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物，以及它的合成方法和应用。申请人通过考察其对多种肿瘤细胞株的抑制作用，结果表明该螯合物表现出比其配体及顺铂更强的抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望应用于各种抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的最终产物的核磁共振氢谱图；

图2为本发明实施例1制得的最终产物的核磁共振碳谱图；

图3为本发明实施例1制得的最终产物的电喷雾质谱谱图；

图4为本发明实施例1制得的最终产物的X射线单晶结构图；

图5为本发明实施例4制得的最终产物的X射线单晶结构图；

图6为本发明实施例4制得的最终产物的电喷雾质谱谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：式(II)所示化合物即1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉(LKL)的合成

1)取100mg 5-甲氧基色胺，溶于40mL四氢呋喃中，搅拌并逐滴加入50μL吡啶-2-甲醛，冰浴搅拌20min，然后加入三氟乙酸220μL，反应约1h后移除冰浴，常温继续反应约1h；采用薄层层析(TLC)跟踪检测反应进度，当反应结束后所得反应物用足量的氨水调节至中性，并使用乙酸乙酯萃取，分离有机相，减压蒸馏，得黄色油状液体，此步骤所的产物不提纯直接用于下一步反应；

2)将黄色油状液体加入到100mL二甲苯中，然后加入200mg 10％Pd/C，升温至140℃，回流反应、隔夜；反应结束后，将反应物过滤，滤饼依次用甲醇、氯仿、乙酸乙酯洗涤10次，收集滤液，将滤液减压旋干，得粗产物，之后上快速液相色谱进行纯化(V_乙酸乙酯：V_正己烷＝3:7)，得到黄色晶体(产率约为70％)。

对所得黄色晶体进行核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、电喷雾质谱和单晶衍射分析，具体波谱特性如下：

(1)核磁共振氢谱和碳谱，其谱图分别如图1和2所示。

¹H>3)δ:11.22(s,1H),8.82～8.74(m,2H),8.53(d,J＝5.1Hz,1H),7.98(d,J＝5.1Hz,1H),7.90(td,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.60(d,J＝2.4Hz,1H),7.54(d,J＝8.8Hz,1H),7.37–7.32(m,1H),7.25(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),3.96(s,J＝4.0Hz,3H)。

¹³C>3)δ:157.87,154.08,148.25,138.09,137.44,136.83,135.68,135.30,130.36,122.92,121.41,121.35,118.51,115.36,112.67,103.57,77.30,77.25,77.04,76.79,56.02。

(2)电喷雾质谱，如图3所示，ESI-MS m/z:276.11[M+H]⁺.

(3)X射线单晶衍射分析，确定其单晶结构如图4所示。

因此，可确定上述黄色固体产物即为1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉，其化学结构式如下式(II)所示：

实施例2：配体LKL的合成

1)取100mg 5-甲氧基色胺，溶于60mL二氯甲烷中，搅拌并逐滴加入60μL吡啶-2-甲醛，均匀搅拌10min后，加入醋酸360μL，常温反应约2h；反应结束后，将所得反应物用足量的氨水调节至中性，并用氯仿萃取分离有机相，减压蒸馏，得黄色油状液体，此步骤所的产物不提纯直接用于下一步反应；

2)将黄色油状液体加入到80mL苯甲醚中，然后加入100mg 10％Pd/C，升温至160℃，回流反应20h；反应结束后，将反应物过滤，依次用氯仿、甲醇、乙酸乙酯洗涤5次，收集滤液，将滤液减压旋干，得粗产物，之后上快速液相色谱进行纯化(V_乙酸乙酯：V_石油醚＝3:7)，得到黄色晶体(产率约为55％)。

对所得黄色晶体进行核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、电喷雾质谱和单晶衍射分析，确定其为目标产物1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉。

实施例3：配体LKL的合成

1)取100mg 5-甲氧基色胺，溶于60mL四氢呋喃中，搅拌并逐滴加入40μL吡啶-2-甲醛，冰浴搅拌15min，然后加入硫酸120μL，反应约1h后移除冰浴，常温继续反应约0.5h；反应结束后所得反应物用足量的氨水调节至碱性，并用乙酸乙酯萃取分离有机相，减压蒸馏，得黄色油状液体，此步骤所的产物不提纯直接用于下一步反应；

2)将黄色油状液体加入到80mL苯甲醚中，然后加入240mg 5％Pd/C，升温至150℃，回流反应24h；反应结束后，将反应物过滤，滤饼依次用甲醇、氯仿、乙酸乙酯依次洗涤8次，收集滤液，将滤液减压蒸馏，得粗产物，之后上快速液相色谱进行纯化(V_乙酸乙酯：V_石油醚＝3:7)，得到黄色晶体(产率约为45％)。

对所得黄色晶体进行核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、电喷雾质谱和单晶衍射分析，确定其为目标产物1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉。

实施例4：螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]的合成

在一端开口的厚壁硼硅玻璃管中，直接加入0.15mmol二水合氯化铜和0.1mmol配体LKL，再加入1.9mL由甲醇和二甲基亚砜组成的混合溶剂(甲醇和二水的体积比为15:4)；经液氮冷冻后抽至真空，将开口端熔封，然后在80℃条件下充分反应72h；反应结束后，每小时降温5℃，直至降到室温，即有绿色细毛状结晶型固体产物析出。

将上述所得绿色产物经电喷雾质谱(如图6所示)及X射线单晶衍射分析结构(如图5所示)测定，确定为以1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物，即目标螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]，其结构式如下述式(I)所示：

实施例5：螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]的合成

重复实施例4，不同的是：

反应温度改为45℃，反应时间为72h，反应结束后，直接冷却(产率75％)。

析出绿色粉末经电喷雾质谱和X射线单晶衍射分析进行结构测定，确定为目标螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]。

实施例6：螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]的合成

重复实施例4，不同的是：

极性溶剂改为由甲醇和氯仿组成的混合溶剂(甲醇和氯仿的体积比为5:1)，反应温度依然为80℃，反应时间为48h，反应结束后，直接冷却(产率83％)。

析出绿色产物经电喷雾质谱和X射线单晶衍射分析进行结构测定，确定为目标螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]。

实施例7：螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]的合成

分别称取配体LKL 1mmol、二水合氯化铜1mmol，将配体LKL溶解于25mL甲醇中，将二水合氯化铜溶解于10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，均匀混合两种溶液；在80℃下反应24h，减压蒸馏除去大部分溶剂(溶剂加入量的80％)，冷却至室温，静置，析出绿色固体，分离出固体，用水洗涤、干燥，得到绿色固体产物(产率78％)。

所得产物经过电喷雾质谱结合X射线单晶衍射分析进行结构测定，确定为目标螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]。

实施例8：螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]的合成

重复实施例7，不同的条件是：

将极性溶剂中N,N-二甲基甲酰胺改为丙酮，其中甲醇和丙酮的体积比为10:1，反应温度为75℃，反应时间为48h(产率73％)。

所得产物经过电喷雾质谱结合X射线单晶衍射分析进行结构测定，确定为目标螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]。

实施例9：螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]的合成

分别称取配体LKL 1mmol、二水合氯化铜1mmol，将配体LKL和二水合氯化铜溶解于由10mL甲醇、1mL乙腈和1mL水组成的混合溶剂中，在45℃下反应48h，减压蒸馏除去大部分溶剂(溶剂加入量的90％)，冷却至室温，静置，析出红色固体。分离出固体，用水洗涤、干燥，得到绿色固体产物(产率64％)。

所得产物经过电喷雾质谱结合X射线单晶衍射分析进行结构测定，确定为目标螯合物[Cu^II(LKL)Cl₂]。

为了充分说明本发明所述的以1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物在制药中的用途，申请人对该螯合物及其配体LKL进行了抗肿瘤活性实验。

实验例1：以1-吡啶-6-甲氧基-β-咔啉为配体的氯化铜(II)螯合物(按实施例4所述方法制得)及配体LKL(按实施例1所述方法制得)对多种人类肿瘤株进行体外抑制活性实验

1、细胞株与细胞培养

本实验选用NCI-H-460(人大细胞肺癌)、SK-OV-3(人卵巢腺癌细胞株)、Hep G2(人肝癌细胞)、MGC803(人胃癌细胞)、T24(人膀胱癌细胞)等。

所有细胞株均培养在含10％FBS牛胎血清、1％青链霉素混合液的DMEM培养液内，置37℃含体积浓度5％CO₂孵箱中培养。

2、初筛

各株细胞种96孔板贴壁后换无血清DMEM，12至18小时后加药。本实验用化合物(纯度均≥95％)，将化合物配制成200μmol/L中间浓度，取20μL中间浓度化合物溶液，加入已有180μL细胞液的96孔板内，化合物终浓度为20μmol/L。DMSO终浓度≤1％，测试该浓度下化合物对肿瘤细胞生长的抑制程度。凡是抑制率大于50％，且符合光镜下细胞受抑(或受损)的形态变化(如细胞皱缩，破碎，漂浮等)的，则判定为初筛有效，求得抑制率结果如下述表1所示。

3、细胞生长抑制实验(MTT法)

将待测的受试化合物以DMSO溶解后，无血清培养基稀释中间浓度为200μmol/L，100μmol/L，50μmol/L，25μmol/L，12.5μmol/L，再用直径d＝0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，置于4℃下保存。

分别将处于对数生长期的系列肿瘤细胞株以每孔180μL分别接种于96孔板，边缘孔加200μL PBS(磷酸缓冲盐粉剂配制溶液)，细胞浓度约为1×10⁴/孔，培养12小时，待细胞贴壁后，换无血清DMEM，12至18小时化合物中间浓度液体，化合物每个浓度平行设5个复孔，其中DMSO终浓度≤1％，同时设相应的阴性对照组(培养液中只有细胞和等量DMSO，无药物)和空白对照组(培养液中只有等量的药物，无细胞)，每个组也平行设5个复孔，药物作用时间为48h。培养结束前4小时每孔加入10μL>50，其测试结果如以下表2所示：

表1：

表2：