选择用于癌症治疗的个体化三联疗法的方法

摘要

本发明涉及一种确定用于治疗癌症的至少三种药物的最佳组合的方法，其基于对于个体来说最相关的干预点的确定。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤学领域，尤其涉及癌症疗法中的个体化用药。更特定来说，它涉及治疗方法的一种新型构思，即三联方案疗法；以及用于选择最适于治疗特定对象的癌症的药物组合的方法。

背景技术

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，其中每年有惊人的180万病例被诊断。超过半数的NSCLC在转移性阶段被诊断。即使利用西方世界的主要由化学治疗剂和放射疗法组成的护理标准，对死亡率的影响也很小，其中在1年时所有诊断患者(无论阶段如何)中仅30％存活，并且患有转移性疾病者的惨淡1年和5年存活率分别是约8-15％和4％。对于第一线疗法失败的患者，中值存活率仅为约7个月。

由诸如匹配EGFR活化性突变或ALK易位的靶向疗法所致的进展已显示实质性响应率，从而证明分子匹配靶向疗法具有效能，但诸如这些的单药疗法仅适用于小型患者子集，并且实际上所有患者都显现抗性并死于他们的疾病。这或许并非是出乎意料的，因为患者常常具有需要追究(prosecution)的多个分子畸变。组合疗法的效力已在诸如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)的疾病中得以说明，其中由组合实现了治愈。此外，在现代靶向疗法中，靶向相同通路的组合(例如在BRAF突变黑素瘤中，曲美替尼(trametanib)(MEK)抑制剂以及达拉菲尼(dabrafenib)(BRAF抑制剂))或靶向抗性通路的组合(组合PIK3CA和MEK抑制剂)已被测试，并且已在一些情况下显示功效，但不达成治愈，并且对存活率无显著影响。然而，迄今为止，在NSCLC中，靶向疗法组合的范围极其有限。

当今，在晚期转移性疾病(尤其肺癌)中，个体化用药提供适度益处。单药疗法未能治愈晚期疾病。大多数组合化学疗法缺乏根本的生物或分子基本原理。

因此，强烈需要对于各特定患者确定用于治疗癌症的最佳药物组合。

发明内容

本发明者提供特别是转移性肺癌的癌症的疗法的一种基于关联三种靶向药物的三联疗法的新型构思。他们创建了将来自药物和癌症标志的知识合并的简化干预映射系统(simplified interventional mapping system)(SIMS)。干预点意指活化的并且可由药物阻断的靶标/基因或一组靶标/基因。他们描述了基于183种基因的集合的24个干预点。探究干预点的活化状态的方法基于对根据严格相同各点匹配的肿瘤和正常双重活检的全面基因组学探究，并且优选包括测序，拷贝数变化基因表达和miRNA表达。开发了用以产生例如从1至10的评分系统的算法，从而使得能够对各患者中的活化干预点分级。

基于干预点的评分和共活化趋势，本发明提供一种用以关联疗法组合的新型科学原理论述。因此，本发明涉及一种用于在患有癌症的患者中根据干预点的活化状态来确定它们的分类的方法，其中

-所述干预点包括由HER、CDK4,6、PLK/AURK/驱动蛋白、血管生成(Angiogenesis)、血管生成素(Angiopoietin)、免疫调节物、PI3K、MET、MEK、ERK、抗凋亡、FGF、mTOR、Ras/Raf、端粒酶、IGF/糖酵解、Wnt、PARP、HDAC、JAK-STAT、Hedgehog、NOTCH通路、DNA修复和其它干预点(即RET、ALK、ROS1和UB1)组成的组或其具有至少10个干预点的任何子组；并且各干预点的基因根据表1或9来确定；

-所述方法包括

-与来自相同患者的组织学匹配的正常样品相比而表征肿瘤样品，包括

-对于干预点的组或子组中的各通路，测定如表1或9中公开的干预点的基因的mRNA表达水平，由此确定肿瘤相对于正常组织(tumor vs.normal)的mRNA表达的倍数变化(称为mRNA TvN倍数变化)；

-对表1或9的基因进行完全或部分测序，由此鉴定活化性突变在所述肿瘤样品中的存在；

-任选地，对于干预点的组或子组中的各干预点，测定如表1或9中公开的干预点的基因的miRNA的水平，由此确定肿瘤相对于正常组织的miRNA水平的倍数变化(称为miRNATvN倍数变化)；

-任选地，对于干预点的组或子组中的各干预点，确定如表1或9中公开的干预点的基因的拷贝数变化，由此确定肿瘤相对于正常组织的扩增基因的倍数变化；

-基于表征数据计算各通路的评分，其中

-如果在所述肿瘤样品中，检测到存在干预点的基因的活化性突变，那么对所述干预点赋予最大评分，特别是如果评分是1至10，那么赋予评分10；

-基于干预点的组或子组中各干预点的基因的所述mRNATvN倍数变化的算术平均值计算优选是1至10的评分，前提是仅当基因的所述mRNA TvN倍数变化的值是至少1.3时其才被考虑；并且

-干预点的组或子组中的各干预点的评分是

a)归因于存在活化性突变的评分和由所述mRNA TvN倍数变化的平均值计算的评分的总和；或

b)如果存在突变的话，归因于存在活化性突变的评分，或在不存在突变的情况下，基于所述mRNA TvN倍数变化的算术平均值计算的评分；以及

-根据计算的评分对所述干预点分类。

优选地，对表10的基因进行测序以检测如表10中确定的突变的存在，并且对p53基因进行测序。

优选地，对于干预点的组或子组中的各干预点，方法包括测定如表1或9中公开的通路的基因的miRNA水平，特别是如表11中公开的通路的基因的miRNA的水平。更优选地，在评分计算步骤之前，计算各基因的平均miRNA倍数变化，所述平均miRNA倍数变化是所述基因的miRNA TvN倍数变化的平均值，通过基因的肿瘤相对于正常组织的mRNA倍数变化(mRNATvN倍数变化)除以基因的miRNA的平均倍数变化(平均miRNA TvN倍数变化)来计算修正mRNA TvN倍数变化，并且基因的所述修正mRNA TvN倍数变化接着被用于计算各干预点的基因的mRNA TvN倍数变化的算术平均值。在一优选实施方式中，测定miRNA的水平，并且所述miRNA的水平被用于计算以下干预点的基因的修正mRNA TvN倍数变化：mTOR-AKT-PTEN、RAS、ERK、PI3K和免疫调节物。

优选地，对于干预点的组或子组中的各干预点，方法包括确定如表1或9中公开的通路的基因的拷贝数变化。更优选地，在评分计算步骤之前，通过用基因的CNV倍数变化乘以基因的mRNA TvN倍数变化来计算干预点的基因的修正mRNA TvN倍数变化，并且基因的所述修正mRNA TvN倍数变化接着被用于计算各干预点的基因的mRNA TvN倍数变化的算术平均值。

优选地，干预点的子组在于以下组：Her、CDK4,6、PLK/AURK/驱动蛋白、血管生成、免疫调节物、PI3K、MET、MEK、ERK、抗凋亡、FGF、mTOR、Ras/Raf、IGF/糖酵解、Wnt、PARP和DNA修复。

优选地，它还包括选择患有癌症的患者中三个被活化或被扰乱的干预点的组，其中三个干预点在具有最高评分的干预点之中进行选择，优选是具有最高评分的三个干预点。

本发明也涉及一种用于选择适用于治疗患有癌症的患者的三种药物的组合的方法，其中通过权利要求9的方法选择三个被活化或被扰乱的干预点的组，并且选择针对各个被活化或被扰乱的干预点的药物，由此提供三种药物的组合。

此外，本发明涉及试剂盒用于根据通路的活化状态来对所述通路进行分类的用途，其中所述试剂盒包括用于测量干预点的表1或9的基因的mRNA表达水平的工具，所述干预点包括由HER、CDK4,6、PLK/AURK/驱动蛋白、血管生成、血管生成素、免疫调节物、PI3K、MET、MEK、ERK、抗凋亡、FGF、mTOR、Ras/Raf、端粒酶、IGF/糖酵解、Wnt、PARP、HDAC、JAK-STAT、Hedgehog、NOTCH通路、DNA修复和其它干预点(即RET、ALK、ROS1和UB1)组成的组或其具有至少10个干预点的任何子组。优选地，试剂盒还包括用于检测表10的突变的工具。更优选地，试剂盒还包括用于测量干预点的表11的miRNA的miRNA水平的工具，所述干预点包括由HER、CDK4,6、PLK/AURK/驱动蛋白、血管生成、血管生成素、免疫调节物、PI3K、MET、MEK、ERK、抗凋亡、FGF、mTOR、Ras/Raf、端粒酶、IGF/糖酵解、Wnt、PARP、HDAC、JAK-STAT、Hedgehog、NOTCH、DNA修复和其它干预点(即RET、ALK、ROS1和UB1)组成的组或其具有至少10个干预点的任何子组。任选地，试剂盒还包括用于确定通路的表1或9的基因的拷贝数变化的工具，所述通路包括由HER、CDK4,6、PLK/AURK/驱动蛋白、血管生成、血管生成素、免疫调节物、PI3K、MET、MEK、ERK、抗凋亡、FGF、mTOR、Ras/Raf、端粒酶、IGF/糖酵解、Wnt、PARP、HDAC、JAK-STAT、Hedgehog、NOTCH、DNA修复和其它干预点(即RET、ALK、ROS1和UB1)组成的组或其具有至少10个干预点的任何子组。

最后，本发明涉及一种用于治疗癌症的药物组合，其中所述药物组合在表6、表7、表8中公开的组合之中进行选择或在由以下组成的组中选择：

抗PD1L+全RAF抑制剂+MtorPI3K抑制剂

抗PD1L+全RAF抑制剂+血管生成抑制剂

抗PD1L+全RAF抑制剂+MET抑制剂

抗PD1L+全RAF抑制剂+CDK4,6抑制剂

抗CTLA4+全RAF抑制剂+MtorPI3K抑制剂

抗CTLA4+全RAF抑制剂+血管生成抑制剂

抗CTLA4+全RAF抑制剂+MET抑制剂

抗CTLA4+全RAF抑制剂+CDK4,6抑制剂

抗PD1L+MEK抑制剂+MtorPI3K双重抑制剂

抗PD1L+MEK抑制剂+血管生成抑制剂

抗PD1L+MEK抑制剂+MET抑制剂

抗PD1L+MEK抑制剂+CDK,-6抑制剂

抗CTLA4+MEK抑制剂+MtorPI3K双重抑制剂

抗CTLA4+MEK抑制剂+MET抑制剂

抗CTLA4+MEK抑制剂+血管生成抑制剂，和

抗CTLA4+MEK抑制剂+CDK4,6抑制剂。

优选地，组合中包括的药物选自表1中公开的那些。

更优选地，药物组合在由以下组成的组中选择：

Medi-4736(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+PF-384(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+阿西替尼(Axitinib)(Pfizer)或莫替沙尼(Motesanib)(Takeda)

Medi-4736(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+克唑替尼(Crizotinib)(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+帕博西尼布(Palbociclib)(Pfizer)

曲美木单抗(Tremelimumab)(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+PF-384(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+阿西替尼(Pfizer)或莫替沙尼(Takeda)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+克唑替尼(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+帕博西尼布(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+司美替尼(Selumetinib)(Astra Zeneca)+PF-384(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+阿西替尼(Pfizer)或莫替沙尼(Takeda)

Medi-4736(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+克唑替尼(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+帕博西尼布(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+PF-384(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+克唑替尼(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+阿西替尼(Pfizer)或莫替沙尼(Takeda)，和

曲美木单抗(Astra Zeneca)+司美替尼v+帕博西尼布(Pfizer)。

优选地，癌症是肺癌，更优选是NSCLC。

附图说明

图1.cPCM的框架。将问题分成3个部分：

A.将治疗功效映射至细胞组分；

B.对(A)中确定的干预图中特定节点的状态评分和(C)预测组合功效

图2.评分系统的流程图。

图3.在Y中：各患者中T与N之间差异性基因表达的平均倍数变化。在X中：患者编号NB：对于各图，患者的顺序是不同的。这个系列充当用于计算十分位数的标度。

图4.评分系统的3D表示。Z轴显示从1至10的评分。X轴表示干预点的实例，y轴表示各患者。

发明详述

一般性构思

因为单药疗法未能治愈转移性肺癌疾病，并且当今关于其它疾病报道的双重组合不显著影响存活率，所以本发明者跟随在AIDS中的历史性成功设想应用三联疗法。

由本发明提出的挑战是选择可使患者受益的三联药物组合。

●单一药物的作用不良；患者起响应但常常在数月内不可避免地复发。基于转移性疾病的分子复杂性，需要组合。这个情况可能类似于AIDS的情况，其中单一药剂产生递增效应，但三种药物的组合已显示长期益处。

●不同于始终依赖于相同蛋白质的病毒，肿瘤是异质的，并且生物学对于单一三联疗法组合而言太过复杂以致其不能对所有肿瘤都起作用。

●因此，需要组合性精准癌症用药(cPCM)。

●在转移性肿瘤中，有限数目的通路可能是异常的。

提出的方法

本发明者主张通过合理假设，当今可建立实际框架，其允许以个体化方式鉴定适用药物组合(即基于肿瘤性质使组合匹配于患者)。

主要理念在于分而治之–提出3个步骤：

1.找出一组指示每个类别的药物的特定干预点的标志物：涵盖183种基因的24个标志物

2.找出概述这些标志物在给定患者中的性态的评分，其可与其它类别比较，并且与这个药物将起作用的概率成比例；以及

3.想出如何组合药物以使组合足够普通用以允许进行临床测试，而我们保留以足够精确度使组合匹配于患者的能力。

基于这些假设，本发明者提出用于精准组合性癌症用药的SIMS(简化干预点映射系统)框架(图1)。

●首先，他们提出通过设计仅集中于最大程度指示药物靶标状态的基因的简化图来降低生物通路和通路相互影响的巨大复杂性。他们提出确定“干预点”，其由药物靶标或靶标组以及在靶标上游的基因组成，其共同反映可通过治疗干预来作用的特定生物活性。举例来说，全HER疗法将HER受体组和它们的配体确定为单一干预点(图1a)。

●研究的第二部分，本发明者提出一种用于针对特定患者来区分干预点的优先次序的极其简单方法。评分背后的基本前提是当与干预点相关的基因被更加扰乱(就序列和/或表达水平而言)时，所述干预点更可能对肿瘤至关重要。由此，似乎干预点的基因的扰乱程度越大，靶向那个点处的治疗将使患者受益的可能性越大。本发明者处于开发一类简单评分的过程中，所述评分将肿瘤中的基因表达水平(相对于匹配的正常对照)、见于干预点的基因中的畸变、CNV和miRNA表达水平进行组合。等级标准化(在实施例中，使用十分位数)用于使不同干预点的评分可比较。

●最后，鉴于用于确定哪些药物更可能使患者受益的可靠系统，需要一种用于选择可能使患者受益的组合的方法。在此处，本发明者使用一组123名肺癌患者为例，提出一种统计方法。使用上述方法，他们描述24个干预点在123名患者中的状态。由此，他们应用知识驱动的方法来寻找可能以协同方式使患者受益的药物组合。通过使用专家组，他们鉴定了常常在患者中共同存在，并且在机理方面独立的那些通路。为进一步改进提出的组合的功效，本发明者提出用免疫调节疗法(即抗CD1L和抗CTLA)加强组合的靶向疗法。这个组合背后的基本原理在于降低不可容忍的副作用的可能性，同时维持三联疗法方案的预测功效。

表1概述干预点，其呈现涉及的基因和主要类别的药物

结论

本发明者提出一种旨在同时阻断三种不同生物异常，以及降低显现继发性抗性的可能性的三联方案疗法的新型治疗方法。此外，为确定药物的组合，本发明者在一个患有癌症的特定患者中基于明确上调的通路鉴定了特定的药物干预点。他们在癌症标志的范围内定义了仅包括可用治疗剂靶向的信号传导和调控通路的简化干预映射系统。简化的原理基于活化性信号可由一类药物阻断。

实际上，本发明者通过设计仅集中于最大程度指示药物靶标状态的基因(定义为“干预点”)的简化图来降低生物通路和通路相互影响的巨大复杂性。这些干预点由药物靶标或药物靶标组以及在药物靶标上游的一些基因组成，其共同反映可通过治疗干预来作用的特定生物活性。就上游来说，其涉及编码具有细胞外活性的蛋白质的基因。举例来说，全HER疗法将HER受体组和它们的配体确定为单一干预点。

本发明者提出一种用于针对特定患者来区分干预点的优先次序的极其简单方法。基本前提是当与干预点相关的基因被更加扰乱(就序列和/或表达水平而言)时，所述干预点更可能对肿瘤至关重要或关键。由此，似乎干预点的基因的扰乱程度越大，靶向那个点的治疗将使患者受益的可能性越大。因此，本发明者已开发一类简单评分，其将肿瘤中的基因表达水平(相对于匹配的正常对照)、见于干预点的基因中的突变、CNV和miRNA表达水平进行组合。

因此，本发明者提出一种方法，所述方法通过考虑一个特定对象自身的肿瘤相对于正常组织的状态允许以最高效的方式对所述对象的肿瘤进行表征，以鉴定被扰乱或被活化的干预点并对它们分级。本发明者开发一种用以赋予评分(例如1至10)的基于组学数据，尤其是基因表达、测序、miRNA分析和拷贝数变化确定的整合的新型数学建模和评分系统。

于是，当对干预点分级时，有可能确定靶向被扰乱或被活化的干预点的组合的一种或若干药物组合以便获得针对这个特定患者的最优化癌症疗法。优选地，组合疗法包含以下或由以下组成：三种靶向被扰乱或活化程度最大的干预点的药物。方法可进一步包括将最优化药物组合施用至所述患者。因此，方法产生在科学上可靠，并且在临床上可行的合理组合疗法。

肿瘤表征

方法包括表征一个目标患者中的肿瘤的步骤。特定来说，患者罹患对其无有效疗法被确立或由医师许可的癌症。这个情况的原因可为癌症处于晚期阶段，例如伴有转移的阶段；癌症在一线或若干线治疗之后复发；或甚至癌症无确立和高效治疗与其相关联。特定来说，在本发明中更特定考虑的癌症或肿瘤是肺癌，尤其是NSCLC(非小细胞肺癌)、乳腺癌(特别是三重阴性乳腺癌)、结肠直肠癌、肾癌、黑素瘤、脑癌、肝癌、头颈部癌、胃癌和卵巢癌。

因此，方法包括提供患者的样品的初始步骤。两个样品是必要的，即一个肿瘤样品和一个来自相同患者的正常样品。优选地，肿瘤样品和正常样品从相同类型的组织提供。更特定来说，肿瘤样品和正常样品是组织学匹配组织。通常，样品可由活检提供。非详尽地，各对肿瘤与相应组织学正常参照组织的实例如下：

1.肺癌腺癌或源于其的转移瘤-支气管正常粘膜

2.乳腺癌肿瘤或源于其的转移瘤-正常上皮乳腺细胞

3.结肠癌腺癌或源于其的转移瘤-正常结肠粘膜

4.肾癌或源于其的转移瘤-正常肾细胞

5.黑素瘤或源于其的转移瘤-同期痣

6.横纹肌肉瘤或源于其的转移瘤-正常肌肉组织

7.肝癌或源于其的转移瘤-正常肝细胞

8.口腔-咽部肿瘤(ORL)-正常颊粘膜

9.胃癌或源于其的转移瘤-正常胃粘膜

10.卵巢癌–正常法洛佩管(Fallope tube)粘膜

11.胰腺癌–来自胰腺的正常薄壁组织

为使肿瘤表征最优化，本发明者选择必须被分析以确立可由一类药物靶向的干预点的状态的参数。

本发明者确定主要目标干预点，即HER(人上皮生长因子受体)、CDK4,6(周期素依赖性激酶)、PLK/AURK/驱动蛋白(Polo样激酶/Aurora激酶/驱动蛋白)、血管生成、血管生成素、免疫调节物、PI3K(磷酸肌醇-3激酶)、MET(cMET)、MEK、ERK、抗凋亡、FGF(纤维母细胞生长因子)、mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶标)、Ras/Raf、端粒酶、IGF/糖酵解(胰岛素样生长因子)、Wnt、PARP(聚ADP核糖聚合酶)、HDAC(组蛋白去乙酰化酶)、JAK-STAT(Janus酪氨酸激酶-信号转导子和转录活化子)、Hedgehog、NOTCH、DNA修复和其它干预点(即RET、ALK、ROS1和UB1)。已选择这些干预点，因为它们可与癌症中的活化相关联。在这个选择中指导本发明的选择的规则在于选择可被阻断的活化信号。

任选地，在一替代性方法中，可在以上提及的干预点列表之中选择干预点子组(即具有10、12、14、16或18个干预点的子组)。举例来说，在一特定实施方式中，目标干预点子组包括有药物可用于其的干预点。举例来说，所述子组可包括或在于以下组：Her、CDK4,6、PLK/AURK/驱动蛋白、血管生成、免疫调节物PD1L和CTL14、PI3K、MET、MEK、ERK、抗凋亡、FGF、mTOR、Ras/Raf、IGF/糖酵解、Wnt、PARP和DNA修复。

此外，对于各干预点，本发明者对适用于表征这个干预点的基因进行选择。基因列表公开于表1或9中。

为确定这些干预点在肿瘤中的状态，必须基于需要针对各患者进行探究的基因的有限列表确定若干参数。

在第一方面，测定表1或9的基因在肿瘤样品和正常样品中的表达水平。通过测量mRNA水平来测定表达水平。通过比较肿瘤组织中和相应正常组织中的表达水平来对这些mRNA的表达水平变化进行确定。基因表达分析允许研究独立去调控或归因于染色体畸变的去调控。实际上，对基因的转化活性的调控是复杂的，并且涉及许多调控水平：反式/顺式转录因子、启动子、染色质调控等。通常，所有去调控(过度表达)都被考虑具有至少1.3的肿瘤/正常组织比率。对于各去调控基因(即当比较肿瘤样品和正常样品时具有不同mRNA表达的基因)，确定倍数变化和/或信号强度(与mRNA表达水平成比例)。

可使用的技术包括Northern分析、mRNA或cDNA微阵列、RT-PCT(特别是定量RT-PCR)等。或者，可用包括一组对表1或9的基因列表具有特异性或对具有如表1或9中公开的10、12、14、16或18个干预点的子组的一组特定基因具有特异性的引物或探针的芯片测定表达水平。从癌样品和正常样品获得的表达水平可通过使用已知具有稳定表达的蛋白质诸如RPLPO(酸性核糖体磷蛋白PO)、TBP(TATA框结合蛋白)、GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)或β-肌动蛋白的表达水平来标准化。

重要的是应注意本发明的方法明确不同于整体或完全基因表达分析方法。即使可添加一些基因至表1或9的基因列表中，测定的也是小于200、250或300个基因的基因表达。

在第二方面，通过测序(部分或完全测序)或通过杂交来分析表1和9的基因列表中的一些基因以检测存在或不存在突变。举例来说，可通过任何可用方法，优选通过高通量测序方法诸如Illumina或Ion Torrent方法或等效方法来对表1或9的基因的外显子测序。或者，可仅分析具有已知活化性突变的基因。这样的基因和突变列表可视考虑的癌症而变化。在一特定实施方式中，可分析表10的基因的突变存在性。更优选地，方法包括对实体肿瘤中最常见的突变基因p53测序。举例来说，方法可包括确定基因p53、KRAS或NRAS(优选KRAS)、EGFR、EBBR2、PIK3CA和BRAF中存在/不存在突变。实际上，存在导致功能增加或损失的突变对肿瘤的生物学具有重要影响，而不始终与基因表达或基因拷贝数的变化关联。已知许多突变通过诱导敏感性或抗性增加来对治疗活性具有直接影响。举例来说，EGFR的酪氨酸激酶结构域中的突变常常与对抑制EGFR的小分子的敏感性相关联，KRAS基因中的突变与对用靶向EGFR的单克隆抗体治疗的抗性相关联。可通过本领域中已知的任何方法，例如通过测序、微量测序或杂交来确定突变状态。此外，基因突变列于www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/中。

在第三方面，确定对象的肿瘤样品的基因拷贝数变化。这个分析可通过CGH(比较基因组杂交)来进行，其使得有可能比较肿瘤DNA与相同个体的正常DNA以检测染色体畸变，即拷贝数变化，诸如染色体损失或增加。这个技术为本领域技术人员所熟知。作为对这个知识的说明，可引用以下综述或参考书：Davies等(2005,Chromosome Research,13,237-248)。这个技术适用于鉴定易位。它可容易地用冷冻活检或包括石蜡的肿瘤材料进行。将CGH结果表示为肿瘤材料中和正常组织中的拷贝数比率。0.5的阈值被公认为描述增加或损失。这个比率越高，异常幅度越重要。因此，重要异常可能在生物水平上具有实际影响。在一优选实施方式中，确定拷贝数变化的倍数变化。

在第四方面，测定表1或9的基因的miRNA或微小RNA在肿瘤样品和正常样品中的水平。更优选地，测定各基因的5个miRNA的水平。在一优选实施方式中，分析表11的miRNA。用于测量miRNA的方法在本领域中是熟知的。

接着，针对所述5个miRNA，确定肿瘤相对于正常组织的倍数变化，并且将各基因的平均倍数变化计算为5个miRNA的倍数变化的平均值。

接着，在表征步骤之后，已确定各特定患者的肿瘤的以下参数：

-在表1或9的列表之中的表达以确定倍数变化去调控的基因的列表。

-突变基因的列表。

-任选地，具有拷贝数变化和这个CNV的值(倍数变化)的基因的列表。在一优选实施方式中，仅考虑呈现扩增的基因。

-任选地，特别是具有基于5个miRNA倍数变化的平均倍数变化的去调控miRNA的列表。

在第一实施方式中，表征方法包括基因表达分析和突变基因。在第二实施方式中，表征方法包括基因表达分析、突变基因和拷贝数变化。在第三实施方式中，表征方法包括基因表达分析、突变基因和miRNA分析。在第四实施方式中，表征方法包括基因表达分析、突变基因、拷贝数变化和miRNA分析。对于各干预点，对准则的组合的选择可不同。

举例来说，对于一些干预点，miRNA的影响具有重大影响，而对于其它干预点，miRNA具有微小影响。如实施例章节中所示，对于患有NSCLC的患者，miRNA对干预点mTOR-AKT-PTEN、RAS、ERK、PI3K和免疫调节物具有重大影响，而对于干预点Her、CDK4,6、血管生成、MET、MEK、FGFR、RAF、IGF-Warburg和PARP，影响是微小的。此外，对于患有NSCLC的患者，已确定CNV的影响相当低微。

根据这些参数，方法包括确定患者的肿瘤中被扰乱或被活化的干预点，以及通过计算各干预点的评分来对它们分级。

数学建模/算法

用于计算各干预点的评分的算法的原理如下：

1-评分被设计以与干预点在肿瘤中特别是与相同患者的正常匹配组织相比被(异常)活化或扰乱的可能性相关联。它在1至20的范围内，评分最高，通路被最大程度活化或扰乱。在一优选实施方式中，评分在1至10的范围内。然而，评分的数值范围对结果不具有影响。

2-评分可组合来自4个数据源的证据：

-突变；

-相对于正常组织，在肿瘤中差异性表达的基因的平均倍数变化；

-任选地，肿瘤相对于正常组织的miRNA表达平均倍数变化；以及，

-任选地，拷贝数变化。

活化突变和评分计算

不同数据源可在评分中携带不同权重。实际上，活化性突变(例如RAS通路中的K-RAS)可具有决定性权重。

于是，在方法的第一方式中，对包含具有活化性突变的基因的各干预点赋予最大评分。在一优选实施方式中，与最大评分相关的突变列于表10中。它可进一步包括p53突变。举例来说，如果评分在0至10的范围内，那么对每个包含具有活化性突变的基因的干预点赋予最大评分10。在不存在突变下，评分基于mRNA平均倍数变化的平均值，任选用miRNA表达水平以及在较小程度上用CNV异常加权。

在第二方式中，执行第一方式的规则，但评分是两个评分的总和，第一评分基于突变，并且第二评分基于mRNA平均倍数变化的算术平均值。优选地，两个评分的范围/数值范围是相同的。举例来说，两个评分各自在0至10的范围内。

在第三方式中，评分是两个评分的总和，第一评分基于突变，并且第二评分基于mRNA平均倍数变化。然而，可对突变赋予不同权重/评分。特定来说，不是一旦检测到活化性突变即赋予评分10，而是可对活化性突变赋予较低评分，例如评分3。因此，干预点的基因中的一个突变赋予评分3，两个突变赋予评分6，三个突变赋予评分9，更多突变赋予最大评分10。此外，视活化性突变的影响而定，可赋予不同权重。举例来说，KRAS的活化性突变赋予评分10，而具有较小功能性影响的突变将计为3。因此，表10中所列的突变可具有较高权重，例如可计为10。

计算差异性表达的基因的平均倍数变化：

整体表达样式被用于计算基因i在肿瘤中以及在匹配正常组织中的表达的倍数变化(f_i)。这个倍数变化可被称为mRNA>

对于计算干预点k的表示为E_k的平均倍数变化，使用倍数变化至少1.3的差异性表达的基因的倍数变化。换句话说，对于各干预点，计算干预点k的基因i的平均倍数变化，用≤1.3的阈值修整各值。

在形式上，我们如下计算E_k：让M_k表示属于干预点k的一组基因，并且m_k表示M_k的仅包括绝对倍数变化≥1.3的差异性表达的基因的子组。E_k是基因m_k的倍数变化的平均值。

m_k＝{i|i∈M_k>i|＞1.3}

and：和

我们接着计算m_k中所有基因的平均表达水平：

其中i∈m_k

换句话说，特定干预点的倍数变化是属于如表1或9中确定的干预点，并且具有1.3或更大的T对N倍数变化的基因的倍数变化的平均值或算术平均值。

特定来说，为比较不同干预点的倍数变化，基于百分位数计算产生相对评分，例如1至10。

组合mRNA和miRNA测量

为调整转录中可能的miRNA干预，本发明者提出处罚miRNA与它的靶标mRNA之间的不一致性。对于表1或9的属于干预点或其组的各基因，本发明者使用靶标扫描(Targetscan){http://www.targetscan.org/}确定最可能参与它们的调控的miRNA，选择各基因的前5名miRNA。表11提供表1或9的基因的前5名miRNA的列表。

对于各基因i，可通过对最可能靶向基因i的5个miRNA(或如果鉴定少于5个miRNA，那么更少miRNA)的倍数变化取平均值来计算表示为A_i的平均miRNA倍数变化。接着，对于各基因，确定平均miRNA>

接着，通过基因的肿瘤相对于正常组织的mRNA倍数变化(mRNA TvN倍数变化)除以基因的miRNA的平均倍数变化(平均miRNA TvN倍数变化)来计算干预点的基因的修正倍数变化。基因的修正倍数变化接着被用于通过以下方式来计算特定通路的倍数变化：将它用于属于如表1或9中确定的通路，并且具有1.3或更大的T对N倍数变化的基因的平均倍数变化的计算中。基于通路的修正倍数变化，产生基于百分位数的修正评分，例如评分1至10。

组合mRNA和CNV测量

仅考虑扩增的基因。优选地，扩增2倍或更高的基因被视为扩增。接着，通过用基因的CNV倍数变化乘以基因的肿瘤相对于正常组织的mRNA倍数变化(mRNA TvN倍数变化)来计算干预点的基因的修正倍数变化。基因的修正倍数变化接着被用于通过以下方式来计算特定干预点的倍数变化：将它用于属于如表1或9中确定的干预点，并且具有1.3或更大的T对N倍数变化的基因的平均倍数变化的计算中。基于通路的修正倍数变化，产生基于百分位数的修正评分，例如评分1至10。

评分计算

为比较干预点，在考虑mRNA表达和活化性突变的情况下对各干预点赋予评分。任选地，可考虑3或4个变量：活化性突变、以肿瘤相对于正常组织的mRNA倍数变化、以肿瘤相对于正常组织的miRNA倍数变化和拷贝数变化(扩增、缺失)。在一优选实施方式中，在考虑活化性突变、mRNA表达和miRNA表达的情况下对各干预点赋予评分。在一特定实施方式中，当计算至少以下干预点的评分时考虑miRNA：mTOR-AKT-PTEN、RAS、ERK、PI3K和免疫调节物。

总而言之，在第一方面，如下计算各通路的评分：

1-如果在干预点的一个基因中检测到活化性突变，那么干预点的评分是最大评分，例如当从1至10评分时，评分是10。

2-否则，基于具有至少1.3的绝对倍数变化，并且属于表1或9的基因列表的基因的肿瘤相对于正常组织的倍数变化平均值计算所考虑干预点的评分。

3-任选地，如果测量了表1或9的基因的miRNA水平，特别是表11的那些，那么将各基因的平均miRNA倍数变化计算为这个基因的5个miRNA的倍数变化的算术平均值。接着，通过基因的肿瘤相对于正常组织的mRNA倍数变化(mRNA TvN倍数变化)除以基因的miRNA的平均倍数变化(平均miRNA TvN倍数变化)来计算基因的修正mRNA倍数变化。对于计算干预点的基因的肿瘤相对于正常组织的mRNA倍数变化的平均值，使用基因的修正mRNA>

4-任选地，如果测量到表1或9的基因(或其一些基因)的CNV有2倍或更高扩增，那么通过用基因的CNV倍数变化乘以基因的肿瘤相对于正常组织的mRNA倍数变化(mRNA TvN倍数变化)来计算基因的修正mRNA倍数变化。对于计算干预点的基因的肿瘤相对于正常组织的mRNA倍数变化的平均值，使用基因的修正mRNA>

或者，它也可被选择来将较小权重归于突变，特别是当考虑表1或9的所有基因的测序时。因此，在第一替代方案中，评分是归因于突变状态的评分和归因于mRNA差异性TvN表达的评分的总和。在第二替代方案中，为对突变的影响分级，由于活化性突变而赋予评分3。于是，举例来说，通路的评分是将基于活化性突变的具有最大评分10的评分添加至以上计算的基于mRNA表达的具有最大评分10的评分。因此，对于各干预点，评分将包括在0与20之间。

基于干预点的评分，对干预点分级。通路分级可允许本领域技术人员选择一种或若干种三个被活化或被扰乱的干预点的组合，尤其是三个根据评分被最大程度活化或扰乱的干预点的组合。

各通路已因为对各干预点具有特异性的药物已经或不久可用于治疗患者而被选择(参见表1)。因此，基于所选干预点的组合，靶向这些干预点的药物的组合可被选择和提议用于治疗患者。

因此，本发明涉及一种用于选择适用于治疗患有癌症的患者的三种药物的组合的方法，其中通过本发明方法来选择具有三个被活化或被扰乱的干预点的组，并且选择针对各个被活化或被扰乱的干预点的药物，由此提供三种药物的组合。

在向患者进行任何施用之前，可离体测试药物组合的功效。举例来说，可在基于来自患者的肿瘤的活检体的模型上测试组合。它可在其上已移植来自肿瘤的肿瘤细胞的动物模型上进行测试。或者，它可在称为转移性离体测定法(Metastatic Ex Vivo Assay)(MEVA)的临床前模型中测试。它是通过锚定非依赖性系统进行的体外3D组织培养。

于是，本发明涉及一种治疗患有癌症的患者的方法或一种用于选择用以治疗患有癌症的患者的药物的组合的方法，其包括：

-提供来自所述患者的肿瘤样品和组织学匹配正常组织；

-如上所详述与正常样品相比而表征所述肿瘤样品；

-如上所详述来计算各干预点的评分；

-选择三个被活化或被扰乱的干预点，优选是三个被最大程度活化或扰乱的干预点；

-选择靶向三个所选被活化或被扰乱的干预点的药物的组合；

-任选地，向所述患者施用所选药物的组合。

任选地，本发明方法可提供若干种三种药物的组合。实际上，为防止任何药物抗性，可依序使用组合。

此外，本发明涉及一种试剂盒和所述试剂盒用于根据干预点的状态来对它们分类以及用于选择被选择用于靶向被最大程度活化或扰乱的干预点的三种药物的组合的用途，其中所述试剂盒包括用于测量表1或9的基因的mRNA表达水平的工具。特定来说，所述工具可为对表1或9的各基因具有特异性的引物和/或探针。

任选地，试剂盒可进一步包括用于检测表1或9的基因中的突变的工具。这些工具可适于表1或9的基因的完全测序。更优选地，试剂盒包括用于检测表10的突变的工具。工具可为对编码包括突变的片段的核酸序列具有特异性的探针。它们也可为允许进行基因扩增和测序的引物。

任选地，试剂盒可进一步包括用于测定表1或9的基因的miRNA水平，特别是表11的那些，的工具。最后，试剂盒可进一步包括用于确定表1或9的基因的拷贝数变化的工具。

最后，本发明涉及通过本发明方法鉴定的目标药物组合。在一特定实施方式中，本发明涉及一种药物组合，其包括一种靶向PDL1或CTLA4的药物和两种选自由以下组成的组的药物：RAF抑制剂、血管生成抑制剂、MEK抑制剂；MET抑制剂和CDK 4,6抑制剂。

将三联方案疗法确定为免疫调节剂(抗PD1L或抗CTLA4)和两种靶向疗法的组合的主要原因在于来含有关联毒性。实际上，将靶向疗法组合的主要问题可能是累加毒性。尽管已证明含有双重组合的毒性，但添加第三药物诸如抗PD1L可促成有效耐受疗法，特别是对于转移性NSCLC来说。

因此，本发明涉及一种用于治疗癌症的药物组合，其中所述药物组合在表6、表7、表8中公开的组合之中进行选择。

优选地，药物组合是三种药物的组合。任选地，它可包括额外药物。

在一更特定实施方式中，本发明涉及一种药物组合，其包括靶向PDL1的药物、RAF抑制剂和第三靶向药物，诸如MEK6抑制剂、MET抑制剂、CDK4,6抑制剂或血管生成抑制剂。

基于对被活化的干预点的出现频率的分析，以及基于对共活化趋势的分析，最重要的组合如下：

1.抗PD1L(例如AZ)+全RAF抑制剂(例如Takeda)*+MtorPI3K抑制剂(例如Pfizer)

2.抗PD1L(例如AZ)+全RAF抑制剂(例如Takeda)*+血管抑制剂(angio-inhibitor)(例如Pfizer)

3.抗PD1L(例如AZ)+全RAF抑制剂(例如Takeda)*+met抑制剂(例如Pfizer)

4.抗PD1L(例如AZ)+全RAF抑制剂(例如Takeda)*+CDK4,6抑制剂(例如Pfizer)

这些组合覆盖51％的NSCLC患者，如在对123名患者的回顾性集合的分析中所确定。

除这4种组合之外，本发明者确定用CTL14替代PD1L满足使免疫调节剂与两种其它靶向药物组合的准则。可设想4种额外组合，从而使患者覆盖率增加至72％

5.抗CTLA4(例如AZ)+全RAF抑制剂(例如Takeda)*+MtorPI3K抑制剂(例如Pfizer)

6.抗CTLA4(例如AZ)+全RAF抑制剂(例如Takeda)*+血管抑制剂(例如Pfizer)

7.抗CTLA4(例如AZ)+全RAF抑制剂(例如Takeda)*+met抑制剂(例如Pfizer)

8.抗CTLA4(例如AZ)+全RAF抑制剂(例如Takeda)*+CDK4,6抑制剂(例如Pfizer)

值得提及的是在大多数患者中，可用MEK抑制剂替换全RAF抑制剂。这个替换产生8种组合：

9.抗PD1L(例如AZ)+MEK抑制剂+MtorPI3K双重抑制剂(例如Pfizer)

10.抗PD1L(例如AZ)+MEK抑制剂+血管抑制剂(例如Pfizer或Takeda)

11.抗PD1L(例如AZ)+MEK抑制剂+met抑制剂(例如Pfizer)

12.抗PD1L(例如AZ)+MEK抑制剂+CDK,-6抑制剂(例如Pfizer)

13.抗CTLA4(例如AZ)+MEK抑制剂+MtorPI3K双重抑制剂(例如Pfizer)

14.抗CTLA4(例如AZ)+MEK抑制剂+met抑制剂(例如Pfizer)

15.抗CTLA4(例如AZ)+MEK抑制剂+血管抑制剂(例如Pfizer或Takeda)

16.抗CTLA4(例如AZ)+MEK抑制剂+CDK4,6抑制剂(例如Pfizer)

在一优选实施方式中，以上提及的药物可在表1中公开的那些之中进行选择。

更优选地，药物组合在由以下组成的组中选择：

Medi-4736(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+PF-384(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+阿西替尼(Pfizer)或莫替沙尼(Takeda)

Medi-4736(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+克唑替尼(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+帕博西尼布(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+PF-384(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+阿西替尼(Pfizer)或莫替沙尼(Takeda)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+克唑替尼(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+MLN2480(Takeda)+帕博西尼布(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+PF-384(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+阿西替尼(Pfizer)或莫替沙尼(Takeda)

Medi-4736(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+克唑替尼(Pfizer)

Medi-4736(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+帕博西尼布(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+PF-384(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+克唑替尼(Pfizer)

曲美木单抗(Astra Zeneca)+司美替尼(Astra Zeneca)+阿西替尼(Pfizer)或莫替沙尼(Takeda)，和

曲美木单抗(Astra Zeneca)+司美替尼v+帕博西尼布(Pfizer)。

就“药物组合”来说，它是指包含所述组合的药物的药物组合物，或是指包括用于同时、分开或依序使用的、作为组合式制备物的所述组合的药物的试剂盒或产品。

本发明涉及

-一种特别是用于治疗癌症的药物组合物，其包含组合的药物以及药学上可接受的载体；和/或

-一种产品或试剂盒，其含有用于同时、分开或依序用于特别是癌症治疗的、作为组合式制备物的组合的药物；和/或

-一种组合式制备物，其包含用于同时、分开或依序用于特别是癌症治疗的组合的药物；和/或

-一种用于治疗癌症的包含组合的药物的药物组合物，其与放射疗法和/或其它抗肿瘤剂组合；和/或

-包含组合的药物的药物组合物在制造用以治疗癌症的药剂中的应用；和/或

-包含组合的药物的药物组合物在制造用以与放射疗法和/或其它抗肿瘤剂组合治疗癌症的药剂中的应用；和/或

-一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括施用有效量的包含组合的药物以及药学上可接受的载体的药物组合物；和/或

-一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括施用有效量的组合的药物；和/或

-一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括与放射疗法组合，施用有效量的包含组合的药物的药物组合物。

在一优选实施方式中，癌症是肺癌，并且更优选是NSCLC。

以下章节描述呈现对组合的可能性的完整探究的材料、方法和结果，所述探究基于通过评分系统确定的活化干预点出现的数量和频率。此外，对组合的选择考虑共活化趋势。

实施例

方法

患者和组织样品

本研究由CHEMORES计划(化学疗法抗性联盟(Chemotherapy resistanceconsortium))组织，其是EU提供资金(FP6)的综合项目，涉及8个欧洲国家的19个学术中心、癌症研究组织和研究型生物技术公司。

分析来自一组123名在2002年1月30日与2006年6月26日之间在InstitutMutualiste Montsouris(Paris,France)经受完全手术切除的患者的组织样品。在下表4中给出临床特征。患者的中值年龄是63岁(在41-85的范围内)，34名(28％)是女性，并且89名(72％)是男性。所有肿瘤的组织病理学都由同一名病理学家(JvdO)审查：50名患者患有SCC，57名患有AC，13名患有LCC，并且3名未分类。使用新的第7版TNM分级，56名处于I期，25名处于II期，28名处于III期，并且4名处于IV期。基于铂的辅助化学疗法被施用至61名患者中。59名患者经历复发。2年无复发存活率是64％，并且所述组达到复发的中值时间是5.2年。在40个月(在0-92个月的范围内)的中值追踪期之后，36名患者已死亡，并且23名患者伴有复发而存活。

使用快速冷冻肿瘤和邻近正常肺组织进行这个研究。根据肿瘤分析最佳实践工作组(Tumor Analysis Best Practices Working Group)(Nat Rev Genet 2004；5:229-237)处理样品。在切割载片之前和之后获取以进行分析的苏木精和曙红染色的冷冻切片揭示85％的中值细胞含量(四分位差是65％至95％)。所有组织都在书面知情患者同意之后进行储存，并且研究由古斯塔夫鲁西研究院(IGR)的伦理委员会(Ethics Committee ofInstitut Gustave Roussy)核准。在作为Chemores联盟的基因组工作分项的领导者的IGR，在被授予ISO9001，标识为Agilent technologies的欧洲参考和训练中心的基因组中心核心研究室中进行基因组探究。在IGR和作为综合分析工作分项的领导者的卡罗林斯卡学院(Karolinska Institute)进行分析。

表2-研究群体中的患者的特征

数据可用性

与这个研究相关的微阵列数据已经以登记号E-MTAB-1132(GE)、E-MTAB-1133(CGH)和E-MTAB-1134(MIR)提交至欧洲生物信息学研究所(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)的阵列表达数据储存库。

寡核苷酸aCGH

使用Qiagen QIAamp DNA小型试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从组织提取DNA样品。在各情况下，正常组织样品用作它的相应肿瘤样品的参照。将DNA限制性消化，并且通过Agilent生物分析仪在DNA7500芯片(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)上进行控制。使用Agilent加强型基因组DNA标记试剂盒(Genomic DNA Labelling Kit PLUS)，分别用Cy3-dUTP或Cy5-dUTP标记片段化的参照DNA和测试DNA。使用Microcon YM-30过滤器(Millipore,Billerica,MA)纯化样品。在65℃下在旋转烘箱(Robbins Scientific,Mountain View,CA)中在20rpm下在Agilent 244K阵列上进行杂交24小时，继之以适当洗涤步骤。用Agilent G2505C DNA微阵列扫描器，在使用缺省参数下进行扫描。用FeatureExtraction v10.5.1.1(Agilent Technologies)，在使用缺省参数下对由扫描获得的Cy5和Cy3信号进行定量。

CGH数据处理和分析

所得原始信号和log2(比率)分布曲线(proile)根据它们的染料组成(Cy5/Cy3)和局部GC含量进行标准化和置中。通过在用于R v2.8.1的DNAcopy程序包中使用缺省参数执行循环二元分段算法(Olshen等Biostatistics 2004年10月；5(4):557-72)来用所述算法对这些分布曲线分段。在考虑最少3个连续探针和与每个分布曲线的内部噪声相对应对其特异性的最小绝对幅度阈值的情况下检测DNA拷贝数不平衡。将这个特异性内部噪声计算为跨越基因组上连续探针的距离的绝对log2(比率)的中值的四分之一。在进行的128个aCGH杂交中，丢弃17个：7个由于它们的临床注释，2个由于它们的正常参照的异常，并且8个由于它们的分布曲线的不良品质，从而产生111个可使用的分布曲线。这个研究中的所有aCGH坐标都相对于如通过UCSC编译版本hg18确定的人基因组进行绘制。

为评估在AC、LCC和SCC群体之间具有差异性异常的基因组区域的发现，对分段的aCGH数据集进行ANOVA检验。为说明多重检验，将p值变换成假发现率(FDR)(Benjamini等JRoyal Statist Soc B 1995；57:289-300)。

基因表达和微小RNA微阵列测定法

使用Polytron均质器(Ultraturrax,IMLAB,Lille,France)对40至50个从各NSCLC组织样品切割，具有10微米厚度的冷冻切片进行细胞溶解。用试剂方案(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行RNA提取。用Nanodrop ND-1000光谱仪和生物分析仪-2100(Agilent Technologies)定量和定性总RNA。

对于双色Cy3(正常样品)和Cy5(肿瘤样品)标记，使用适合于少量总RNA(每个反应500ng总RNA)的Agilent荧光低输入线性放大试剂盒，随后通过Qiagen RNeasy小型试剂盒以及通过由Agilent提供的方案来纯化标记的探针。使用来自Agilent的双色244K人外显子阵列(以44K人基因组加195000个探针的内含物定制设计，单个探针针对如UCSC编译版本hg18(http://genome.ucsc.edu/)的refGene列表中确定的各外显子)，以染料调换(dye-swap)进行基因表达剖析。在65℃下在10rpm下进行杂交17小时，继之以洗涤步骤。通过使用10.5.1.1版Feature Extraction软件(Agilent)分析扫描的微阵列图像。

对于微小RNA分析，使正常样品和肿瘤样品在单独的阵列上杂交。将具有miRNA完全标记和杂交试剂盒的Agilent miRNA微阵列系统用于Cy3标记。简要来说，使分离的总RNA脱磷酸，用pCp-Cy3标记并在55℃下在旋转烘箱(Robbins Scientific)中在20rpm下与Agilent 8x15K阵列杂交20小时。洗涤载片，并且使用Agilent G2565C DNA微阵列扫描器，在利用缺省参数下扫描基因表达。

基因突变分析

在IGR以及在皇家理工学院(Royal Institute of Technology)(Stockholm,Sweden)进行测序。用QIAamp DNA小型试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取DNA。在PCR扩增靶标外显子之后，使用终止物循环测序试剂盒(Applied Biosystems,ForsterCity,CA)进行测序反应。引物序列可按要求获得。在48-毛细管3730DNA 上操作测序反应。用软件(Applied Biosystems)进行序列分析和比对。所有检测到的突变都在至少一个独立PCR反应中进行确认。在所有123个样品中，分析包括致癌性突变热点的外显子的完整编码序列，所述外显子对应于TP53(NM_000546.4)外显子5-8；KRAS(NM_004448.2)外显子2和3；EGFR(NM_005228.3)外显子18-21；PIK3CA(NM_006218.2)外显子10和21；BRAF(NM_004333.4)外显子15；ERBB2(NM_004448.2)外显子18、20-24；KDR(NM_002253.1)外显子2、26、27和30；和AKT1(NM_005163.2)外显子4。

基因表达数据处理和标准化

使用集合在R Bioconductor项目(Gentleman等Genome Biology,5:R80)中的函数和程序包以及定制编写程序，对来自Agilent Feature Extraction原始数据文件的中值信号执行用于基因表达分析的所有处理方法。

对于基因表达数据，首先组合(通过获取强度的平均值)染料调换阵列以获得每个条件仅一个阵列。这个组合具有使M值(log2比率)以零为中心的结果。接着，移除标记点以及控制点。接着使用来自R程序包LIMMA的normalizeWithinArrays函数进行标准化(SmythGK Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 2004,第3卷:第1期,文章3)。

对于miRNA数据，系统地移除控制点，并且标记点(来自原始文件的gIsFeatNonUnifOL和gIsSaturated列)被视为遗漏值(“NA”)。使用最小变异集方法进行阵列标准化(Suo等RNA 2010年12月；16(12):2293-303)。

对miRNA表达的差异性表达分析

为评估差异性表达的miRNA，本发明者首先通过用R中的LIMMA程序包的lmFit函数拟合各探针的线性模型来估计两组样品之间的倍数变化和标准误差。接着，他们将经验贝叶斯(Bayes)平滑法应用于来自先前用eBayes函数计算的线性模型的标准误差。

被活化的干预点的评分/分级

算法

数学建模和评分系统旨在基于整合以肿瘤与正常组织之间的差异形式个别地对于各患者测定的组学数据、测序、基因表达、miRNA和拷贝数变化来赋予评分(1至10)。SPRING评分使得能够鉴定和分级被活化的通路，并且总体构思是应当用组合的靶向疗法来阻断这样的被活化的通路。

基于来自123名其测序、拷贝数变化和肿瘤相对于正常组织的基因表达是可用的NSCLC患者的回顾性数据集建立首个数学模型。使用这些数据，已建立一种提供患者的各简化通路的活化评分以及所有以上提及的结构性和功能性结果中的要素的算法。算法的原理公开于图2中。

评分是基于整合肿瘤和正常活检体的4种类型的基因组探究的直观算法

1.突变：在V.1中，本发明者使用一组极其有限的测序数据，仅包括当前在NSCLC的临床护理中使用的基因/突变：EGFr、kRAS、BRAF、PI3KCA和HER2。另外，他们对肺(以及所有实体肿瘤)中最常见的突变基因p53测序。

a.当检测到突变时，算法在相应的简化通路中指定最大评分10。

2.基因表达：对于各简化通路，以肿瘤相对于正常组织的mRNA稳态水平被用于计算通路的平均倍数变化。

a.在阈值1.3处修整单个倍数变化的值。

b.对123个NSCLC的回顾性数据集中各简化通路的单个平均倍数变化的值分级，用作标度。

c.如以下3个实施例中所示，一个通路与另一通路之间的倍数变化的范围不同。为比较它们，本发明者基于百分位数计算产生1至10的相对评分。

3.miRNA表达：对于各基因，本发明者从TargetScan数据库选择前5名匹配miRNA。

a.各miRNA的T对N稳态水平倍数变化被用于产生平均倍数变化。

b.各基因的T对N倍数变化除以5个相应miRNA的T/N平均Fc。

c.他们接着产生各简化通路的修正平均倍数变化。

d.他们基于百分位数产生修正评分1至10。

4.拷贝数变化。当检测到扩增时，本发明者用扩增倍数变化的值乘以各基因的mRNA表达倍数变化的值。接着，他们产生通路的修正平均倍数变化和百分位数评分。

表3概述用于选择干预点的对所有123名NSCLC患者获得的评分

在下一步骤中，本发明者对所有被活化的干预点进行选择。评分8、9和10被视为指示重要/高度活化，而评分6和7被视为指示中等活化。评分<6被视为指示未被活化的干预点。

表6.在考虑共活化趋势的情况下对最常见组合的选择。对于各第一药物和第二药物，显示患者数目(上部框)和％(下部框)。对于各第三药物，显示123名患者中的患者数目和％。

表7概述最常见的三联组合

第一药物NB第二药物NB第三药物Nb％RAS/RAF88mTor/PI3K60PD1L3428RAS/RAF88mTor/PI3K60CTLA43327RAS/RAF88mTor/PI3K60CDK4,63226RAS/RAF88mTor/PI3K60AURKA2924RAS/RAF88mTor/PI3K60DNA修复2823RAS/RAF88mTor/PI3K60ANGIO2722RAS/RAF88mTor/PI3K60MET2722RAS/RAF88mTor/PI3K60FGF2621RAS/RAF88MET40CTLA43226RAS/RAF88CDK4,640CTLA42722CDK4,663RAS/RAF51ANGIO2420CDK4,660mTor/PI3K48AURKA3226CDK4,660mTor/PI3K48DNA修复3226CDK4,660mTor/PI3K48CTLA42924CDK4,660mTor/PI3K48PARP2621MEK54RAS/RAF42CTLA42924MEK54RAS/RAF42PD1L2823MEK54RAS/RAF42mTor/PI3K2823

表8.概述涉及和免疫调节剂的最常见组合

第一药物NB第二药物NB第三药物Nb％RAS/RAF88mTor/PI3K60PD1L3428RAS/RAF88MET40PD1L2218RAS/RAF88CDK4,640PD1L2016PD1L63mTor/PI3K42DNA修复2319PD1L63mTor/PI3K42CDK4,62117PD1L63mTor/PI3K42ANGIO2117PD1L63mTor/PI3K42AURKA2016PD1L63mTor/PI3K42IGF1915PD1L63mTor/PI3K42FGF1815PD1L63mTor/PI3K42MET1613ANGIO56RAS/RAF41PD1L2420

表9：详细的基因列表

表10：基因突变列表

BRAF

EGFR

KRAS-NRAS

ERBB2

PIK3CA

表11：miRNA列表

表12：突变状态

表13：计算的评分

其中P意指患者，(1)是指基于mRNA表达计算的评分，(2)是指基于突变和mRNA表达计算的评分，(3)是指基于突变、mRNA表达和miRNA表达计算的评分，并且(4)是指基于突变、mRNA表达、miRNA表达和拷贝数变化计算的评分。