一种应用松香基高分子分离喜树碱与10‑羟基喜树碱的方法

摘要

本发明公开一种应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树碱与10‑羟基喜树碱的方法，以α‑甲基丙烯酸(或甲基丙烯酸甲酯)为单体，马来松香丙烯酸乙二醇酯为交联剂，采用微悬浮自由基聚合方法制备松香基高分子微球；微球为球形多孔材料，其粒径分布为3‑10μm，平均孔径为10‑15nm，比表面积为90‑120m2/g，酸值50‑150mgKOH/g。将松香基高分子微球用装柱机湿法装柱制备色谱柱；通过对喜树碱和10‑羟基喜树碱进行HPLC分离，检测波长：230‑290nm，温度30±10℃，流速0.3‑1.0mL/min，喜树碱和10‑羟基喜树碱的分离度为1.80‑2.15。本发明对喜树碱和10‑羟基喜树碱具有较高的分离度，选择性高，且该方法灵敏度高、操作简单，快速高效，不会对药物、保健品、食品造成二次污染。

说明书

技术领域

本发明属于高效液相色谱法领域，特别是一种应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树碱和10-羟基喜树碱的方法。

背景技术

喜树碱，化学结构式：

喜树碱是喜树中所含的吲哚类生物碱，具有显著的抗癌活性，是植物资源的第三大天然抗癌药物，喜树碱对肠胃道和头颈部癌等有较好的疗效，通过抑制拓扑异构酶I发挥细胞毒性；结构与10-羟基喜树碱类似，但药理作用不同。

10-羟基喜树碱，化学结构式：

10-羟基喜树碱是喜树中含量较少的吲哚类生物碱，也可以通过喜树碱合成。它不仅比喜树分离得到的碱类物质具有更高药理活性，而且产生更少的毒性，结构与喜树碱类似，但药理作用高于喜树碱。

液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术，通过改进填料的粒度及柱压，在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论，在技术上采用了高压输液泵，高效固定相和高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种色谱技术被称为高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，简称HPLC)。HPLC有以下特点：(1)分析速度快—通常分析一个样品在15～30min，有些样品甚至在5min内即可完成；(2)选择性高—可对差异性很小的物质对如手性物质进行分离分析；(3)检测灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg；柱子反复使用，用一根色谱柱可分离不同的化合物；样品量少，容易回收；样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

目前，关于喜树碱和10-羟基喜树碱分离的方法报道，我们查到如下一些文献：

1.刘文哲，秦海燕，索志荣.喜树果中喜树碱和10-羟基喜树碱的HPLC分析.药物分析杂志.2005，25(2)：168-170；其中提到喜树碱和10-羟基喜树碱的液相色谱条件，用HypersilODS色谱柱(250mm×4.0mm)，以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长254nm，柱温25℃。

2.史伟国，祖元刚，杨磊.聚酰胺分离纯化喜树果中10-羟基喜树碱和喜果苷的研究.中国中药杂志.2008，33(21):2486-2489；其中提到10-羟基喜树碱和喜果苷的检测方法，采用C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm)，以乙腈和水为流动相，流速1.0mL/min，检测波长254nm，柱温35℃。

3.申请号：200510024487.8，发明名称：一种10-羟基喜树碱的生产方法，其中提到喜树碱和10-羟基喜树碱的分离，采用高压液相制备柱(填料为小颗粒球形硅胶，粒径为10～16μm)在10～30℃的条件下进样上柱，流速为250～350mL/min，设定紫外检测波长254nm。

关于应用松香基高分子色谱柱分离喜树碱和10-羟基喜树碱，到目前为止未见报道。。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树碱和10-羟基喜树碱的方法，该方法灵敏度高、操作简单，快速高效，不会对药物、保健品、食品造成二次污染。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树碱与10-羟基喜树碱的方法，将松香基高分子微球作为固定相填料用装柱机湿法装柱制备得到松香基高分子色谱柱；将松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3-1.0mL/min，检测波长230-290nm，柱温箱30±10℃；启动进样阀使流动相将喜树碱和10-羟基喜树碱的混合溶液带入松香基高分子色谱柱中，实现喜树碱和10-羟基喜树碱的分离。

松香基高分子微球分离两种物质的机理：喜树碱与10-羟基喜树碱分子中，自身带有C＝O、-OH基团，能够与松香基高分子微球上的-COOH相互作用，形成稳定的缔合物，喜树碱与10-羟基喜树碱在流动相中会解离出H⁺，可削弱其与固定相之间作用力，因此会被洗脱下来。但10-羟基喜树碱分子中的10号位比喜树碱多一个羟基，与固定相作用力不同，在流动相中解离出的H⁺更多，与固定相的作用力更弱，所以在分离过程中，10-羟基喜树碱会先出峰。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的松香基高分子微球粒径分布为3-10μm，平均孔径为10-15nm，比表面积为90-120m²/g，酸值50-150mgKOH/g。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的装柱机湿法装柱为用恒压泵将松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在3000psi压力下装填120-180min，继续增大压力至3500psi装填10-60min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到松香基高分子色谱柱。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的松香基高分子微球的制备方法为：以α-甲基丙烯酸或甲基丙烯酸甲酯为单体，马来松香丙烯酸乙二醇酯为交联剂，采用微悬浮自由基聚合方法制备松香基高分子微球。

作为技术方案的进一步改进，以上所述松微悬浮自由基聚合方法为：将离子水、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇组成的水相和α-甲基丙烯酸或甲基丙烯酸甲酯、交联剂马来松香丙烯酸乙二醇酯、溶剂乙酸乙酯、致孔剂异辛烷、引发剂偶氮二异丁腈组成的油相混合，用分散机进行分散，分散机设置转速为3000-5000rpm，分散时间为5-20min，然后进行程序升温反应即可得到所述的松香基高分子微球。α-甲基丙烯酸或甲基丙烯酸甲酯为本发明分离喜树碱和10-羟基喜树碱的功能单体。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的油相和水相的质量比为1：3-6。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的程序升温反应为：程序升温70℃反应10-80min，80℃反应20-100min，95℃反应30-60min，即可得到所述的松香基高分子微球。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的水相中去离子水、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇的质量比为100：0.1-0.5：1-3。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的油相中α-甲基丙烯酸或甲基丙烯酸甲酯、交联剂、溶剂、致孔剂、引发剂质量比为0.5-3：3-12.：50-100：1-5：0.1-2。

与现有的技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明制备出的松香基高分子色谱柱，其固定相填料膨胀度小、比表面积大，可用于提取植物中的有效成分，并可在有机溶剂中使用，不会因膨胀而破坏聚合物的网络结构，以松香基高分子微球为填料制备松香基高分子色谱柱，因富含大小不一的孔结构，具有通透性好、背压低、高效和高通量等优点，在较高的流速和压力下，没有出现压塌的现象，并且稳定性好，可重复使用，长时间使用后，色谱柱里的填料仍没有破坏、溶解。

2.本发明所使用的色谱柱，对喜树碱和10-羟基喜树碱有较好的分离效果，最高分离度可达2.15以上，与已有的商品柱C₁₈柱相比，C₁₈柱的分离度为1.74，分离效果可提高了24％以上。

3.本发明中松香基高分子微球以天然产物松香的衍生物为原料，廉价易得，机械强度高，安全无毒，可以用于食品级的分离。

4.本发明采用湿法装柱制备松香基高分子色谱柱，柱效高，抗压性好。

5.本发明的HPLC灵敏度高，操作简单，快速高效。

与现有的技术相比，本发明的有益效果为：

1.在检测波长：230-290nm，流动相为0.1％乙酸甲醇，温度30℃，流速0.5mL/min的条件下，本发明专利的分离度比C₁₈柱的分离度大。

2.本发明应用松香基高分子色谱柱分离喜树碱与10-羟基喜树碱，流动相单一，不需要加缓冲溶液，有利于未来药物的制备，降低药物的再次污染。

3.本发明松香基高分子色谱柱固定相的成本与C₁₈柱的固定相成本相比较，本发明的固定相成本较低。

附图说明

图1为C₁₈柱对喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液的分析图；

图2为本发明实施例4对喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液的分析图；

图3为本发明实施例5对喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液的分析图；

图4为本发明实施例6对喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液的分析图；

图5为本发明实施例7对喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液的分析图.

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。

松香基高分子微球的制备：

实施例1：

向250mL的烧杯中加入200g去离子水、0.4g十二烷基硫酸钠、4.0g聚乙烯醇(离子水、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇的质量比为100：0.2：2)，加热至95℃使聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠完全溶解，得到水相，转移至水浴锅中使温度降至55℃恒温。

称取3.00g马来松香丙烯酸乙二醇酯，溶于50.0g乙酸乙酯中，使用超声波促溶解，待交联剂完全溶解后，再依次加入0.50gα-甲基丙烯酸、1.00g异辛烷、0.10g偶氮二异丁腈(功能单体、交联剂、溶剂、致孔剂、引发剂质量比为0.5：3：50：1：0.1)，超声振荡10min，分散均匀，制得油相。

将配好的油相加入到水相中(油相和水相的质量比为1：3.75)，用分散机进行分散，分散机转速为3000rpm，分散时间为5min，得到乳液，分散完成后，将乳液移至500mL三口烧瓶中，在100rad/min的搅拌速度下升温聚合，温度升至70℃时恒温10min，升至80℃时恒温20min，升至95℃时恒温30min。

反应结束后，将产物过筛，筛子的筛孔为100目，筛分后的聚合物经5000rad/min的转速离心5min，将聚合物转移至500mL烧杯中用蒸馏水洗涤数次以去除多余的分散剂，将产物依次用乙酸乙酯、乙醇、甲醇溶液索氏提取。最后用水蒸气蒸馏法除去聚合物中的乙酸乙酯、乙醇、甲醇，得到松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的松香基高分子微球粒径分布为3-10μm，平均孔径为10-15nm，比表面积为90-120m²/g，酸值50-150mgKOH/g。

实施例2：

向500mL的烧杯中加入400g去离子水、2.00g十二烷基硫酸钠、12.00g聚乙烯醇(离子水、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇的质量比为100：0.5：3)，加热至95℃使聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠完全溶解，得到水相，转移至水浴锅中使温度降至55℃恒温。

称取12.00g马来松香丙烯酸乙二醇酯，溶于100.00g乙酸乙酯中，使用超声波促溶解，待交联剂完全溶解后，再依次加入3.00g甲基丙烯酸甲酯、5.00g异辛烷、2.00g偶氮二异丁腈(功能单体、交联剂、溶剂、致孔剂、引发剂质量比为3：12：100：5：2)，超声振荡10min，分散均匀，制得油相。

将配好的油相加入到水相中(油相和水相的质量比为1：3.4)，用分散机进行分散，分散机转速为4000rpm，分散时间为10min，得到乳液，分散完成后，将乳液移至1000mL三口烧瓶中，在120rad/min的搅拌速度下升温聚合，温度升至70℃时恒温50min，升至80℃时恒温60min，升至95℃时恒温60min。

反应结束后，将产物过筛，筛子的筛孔为100目，筛分后的聚合物经5000rad/min的转速离心10min，将聚合物转移至500mL烧杯中用蒸馏水洗涤数次以去除多余的分散剂，将产物依次用乙酸乙酯、乙醇、甲醇溶液索氏提取。最后用水蒸气蒸馏法除去聚合物中的乙酸乙酯、乙醇、甲醇，得到松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的松香基高分子微球粒径分布为3-10μm，平均孔径为10-15nm，比表面积为90-120m²/g，酸值50-150mgKOH/g。

实施例3：

向400mL的烧杯中加入300g去离子水、3.0g聚乙烯醇、0.30g十二烷基硫酸钠(离子水、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇的质量比为100：0.1：1)，加热至95℃使聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠完全溶解，得到水相，转移至水浴锅中使温度降至55℃恒温。

称取3.25g马来松香丙烯酸乙二醇酯，溶于80.0g乙酸乙酯中，使用超声波促溶解，待交联剂完全溶解后，再依次加入1.55gα-甲基丙烯酸、3.0g异辛烷、1.0g偶氮二异丁腈(功能单体、交联剂、溶剂、致孔剂、引发剂质量比为1.55：3.25：80：3：1)，超声振荡10min，分散均匀，制得油相。

将配好的油相加入到水相中(油相和水相的质量比为1：3.42)，用分散机进行分散，分散机转速为5000rpm，分散时间为20min，得到乳液，分散完成后，将乳液移至500mL三口烧瓶中，在100rad/min的搅拌速度下升温聚合，温度升至70℃时恒温80min，升至80℃时恒温100min，升至95℃时恒温45min。

反应结束后，将产物过筛，筛子的筛孔为100目，筛分后的聚合物经5000rad/min的转速离心5min，将聚合物转移至500mL烧杯中用蒸馏水洗涤数次以去除多余的分散剂，将产物依次用乙酸乙酯、乙醇、甲醇溶液索氏提取。最后用水蒸气蒸馏法除去聚合物中的乙酸乙酯、乙醇、甲醇，得到松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的松香基高分子微球粒径分布为3-10μm，平均孔径为10-15nm，比表面积为90-120m²/g，酸值50-150mgKOH/g。

应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树碱和10-羟基喜树碱的方法

实施例4：

将实施例2所得的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：装柱机湿法装柱为用恒压泵将松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在3000psi压力下装填140min，继续增大压力至3500psi装填30min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到松香基高分子色谱柱，用0.10％的乙酸甲醇溶液冲洗至基线平衡即可进样。

一种应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树碱和10-羟基喜树碱的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量喜树碱、10-羟基喜树碱，用甲醇溶解，配制成每1L含2.5×10^-4mol的喜树与10-羟基喜树碱混合溶液，进样；

(2)设定参数：将松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.5mL/min，检测波长230nm，柱温箱30℃；

(3)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现喜树碱和10-羟基喜树碱的分离，所得结果如图1所示，在保留时间，24.68min时出现10-羟基喜树碱峰，在保留时间33.61min时出现喜树碱峰，分离度为2.15。

实施例5：

将实施例1所得的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：装柱机湿法装柱为用恒压泵将松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在3000psi压力下装填120min，继续增大压力至3500psi装填10min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到松香基高分子色谱柱，用甲醇冲洗至基线平衡即可进样。

一种应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树碱和10-羟基喜树碱的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量喜树碱、10-羟基喜树碱，用甲醇溶解，配制成每1L含2.5×10^-4mol的喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液，进样；

(2)设定参数：将松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3mL/min，检测波长254nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现喜树碱和10-羟基喜树碱的分离，所得结果如图2所示，在保留时间，30.69min时出现10-羟基喜树碱峰，在保留时间39.38min时出现喜树碱峰，分离度为1.93。

实施例6：

将实施例3所得的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：装柱机湿法装柱为用恒压泵将松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在3000psi压力下装填160min，继续增大压力至3500psi装填50min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到松香基高分子色谱柱，用甲醇溶液冲洗至基线平衡即可进样。

一种应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树和10-羟基喜树碱的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量喜树碱、10-羟基喜树碱，用甲醇溶解，配制成每1L含2.5×10^-4mol的喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液，进样；

(2)设定参数：将松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.8mL/min，检测波长290nm，柱温箱35℃；

(3)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现喜树碱和10-羟基喜树碱的分离，所得结果如图3所示，在保留时间，28.55min时出现10-羟基喜树碱峰，在保留时间36.61min时出现喜树碱峰，分离度为1.99。

实施例7：

将实施例2所得的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：装柱机湿法装柱为用恒压泵将松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在3000psi压力下装填180min，继续增大压力至3500psi装填60min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到松香基高分子色谱柱，用0.10％的乙酸甲醇溶液冲洗至基线平衡即可进样。

一种应用松香基高分子色谱柱高效分离喜树碱和10-羟基喜树碱的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量喜树碱、10-羟基喜树碱，用甲醇溶解，配制成每1L含2.5×10^-4mol的喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液，进样；

(2)设定参数：将松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.0mL/min，检测波长254nm，柱温箱30℃；

(3)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现喜树碱和10-羟基喜树碱的分离，所得结果如图4所示，在保留时间26.96min时出现10-羟基喜树碱峰，在保留时间37.27min时出现喜树碱峰，分离度为2.10。