羟基红花黄色素A‑红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物在制备抗肿瘤药物的应用

摘要

本发明提供了羟基红花黄色素A‑红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA‑PEG‑Hydroxy Saffloryellow A）在制备抗肿瘤药物的应用，羟基红花黄色素A‑红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA‑PEG‑Hydroxy Saffloryellow A）的结构式如下：

说明书

技术领域

本发明涉及合成药，具体涉及羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）在制备抗肿瘤药物的应用。

背景技术

肿瘤的生长需要血管为之提供营养和排除代谢产物，如果没有新生血管的生成，肿瘤可长期只处于1~2mm 的微小状态。一旦新生毛细血管长进肿瘤组织，肿瘤则迅速增长并且其侵润和转移能力也大大加强。因此，如何阻断肿瘤血管生成已成为世界上治疗癌症的热点。

在新血管的发生过程中，血管内皮细胞活化并增殖是最基本和最重要的环节。通过抑制血管内皮细胞增殖就可以抑制新生血管生成。由于肿瘤细胞和血管内皮细胞互相依赖介导了肿瘤血管新生，因此，研究体外肿瘤血管新生的过程，要求模拟体内与肿瘤细胞共生的过程，即：血管内皮细胞与肿瘤细胞在共培养的条件下生长。

研究表明，至少有30 种生长因子与肿瘤的血管生成有关，其中最直接的促血管生成因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF) 和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。肿瘤的血管内皮细胞除了高表达VEGF和bFGF外，还大量表达VEGF及bFGF的受体，通过作用于血管内皮细胞表面的这些受体而诱导血管新生。

羟基红花黄色素A(Hydroxy Saffloryellow A，HSYA)能够通过抑制肿瘤VEGF和bFGF的表达，从而抑制肿瘤血管的生长，达到抗肿瘤作用；红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）与胎盘受体(Chondroitin sulfate A ,CSA)的粘附介导结合，CSA在生长旺盛的肿瘤细胞中高度表达，将羟基红花黄色素A与红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）偶联后，可以将羟基红花黄色素A靶向的进入CSA高度表达的肿瘤细胞中，从而达到定向抗肿瘤的作用。

本发明发现将羟基红花黄色素A(Hydroxy Saffloryellow A，HSYA)和红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）偶联，形成羟基红花黄色素A-VAR2CSA多肽复合物，能够有效抑制多种肿瘤细胞的生长，宜进一步研究开发新药。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究设计羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）在制备抗肿瘤药物的应用。

本发明提供了羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）在制备抗肿瘤药物的应用。

羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）的结构式如下：

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本发明所述羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）是通过下列方法制备得到的：

将羟基红花黄色素A(Hydroxy Saffloryellow A，HSYA)、N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯(N,N′-Disuccinimidyl>N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）活化，按摩尔比1：30的比例将羟基红花黄色素A-聚乙二醇复合物（HSYA-NPEG）和活化好的红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）混合，4℃搅拌24小时，取出透析除盐，过分子筛，收集终产物得到羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy>

本发明将羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）进行动物药效试验，结果显示羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy SaffloryellowA）可抑制卵巢癌、肺癌、子宫癌和睾丸癌等上皮组织的恶性肿瘤细胞的生长，对癌细胞的转移有明显的抑制作用；羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）对其他的肿瘤细胞的抑制效果要慢于巢癌、肺癌、子宫癌和睾丸癌等，表明羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）容易富集于CSA受体过度表达的肿瘤细胞，对其他细胞的作用要小很多。因此，羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）可用于制备治疗卵巢癌、肺癌、子宫癌和睾丸癌等恶性肿瘤的药物。

本发明所述羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）在制备治疗治疗卵巢癌、肺癌、子宫癌和睾丸癌等恶性肿瘤的药物为由羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。所述药物组合物可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。有较大的临床应用价值。

附图说明

图1 红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）与肿瘤细胞A549特异性结合图

图中 1：rContr、2：rVAR2CSA组、3：CSA组

图2 红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）与肿瘤细胞skov-3特异性结合图

图中 1：rContr、2：rVAR2CSA组、3：CSA组

图3 红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）与肿瘤细胞ishikawa特异性结合图

图中 1：rContr、2：rVAR2CSA组、3：CSA组

图4 红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）与肿瘤细胞HUVEC特异性结合图

图中 1：rContr、2：rVAR2CSA组、3：CSA组

图5 不同组别人静脉内皮细胞增殖情况；

图中 1：正常组、2：模型组、3：给药组；*P<0.01，与正常比较； ** P<0.05，与模型组比较

图6 羟基红花黄色素A对异常增殖HUVEC凋亡的作用

图中 1：正常组、2：模型组、3：给药组；*P<0.01，与正常比较； ** P<0.05，与模型组比较

图7 羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物的体外抑制肿瘤实验

图中 1：对照组、2：羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物高剂量组、3：羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物中剂量组、4：羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物低、5：环磷酰胺组。

具体实施方式

本发明公开了一种羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）在制备抗肿瘤药物的应用，下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）偶联

取一洁净的圆底烧瓶，分别称取羟基红花黄色素A(Hydroxy Saffloryellow A，HSYA)(纯度≥95%，购自中检所) 0.612g、N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯(N,N′-DisuccinimidylCarbonate,DSC)> N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）(色谱纯, 购自Sigma-Aldrich)室温搅拌反应30min，将溶解于DMSO的羟基红花黄色素A-聚乙二醇复合物（HSYA-NPEG）和活化好的红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）混合，室温搅拌30min；反应结束，用磷酸盐缓冲液4℃透析除盐，每6h换一次液，收集终产物得到羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy>

实施例2 红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白（VAR2CSA）与肿瘤的特异性结合

1.实验准备

完全培养基：不完全培养基+10%的胎牛血清（GIBCO），混匀后备用，4℃保存。其中不完全培养基选用RPMI1640培养基（GIBCO）

不同浓度CSA的制备：电子天平称取少量受试物（1-3mg），用少量PBS溶解，用相应培养基配制成7个浓度梯度的溶液，首浓度0.22μm过滤后，后面的浓度倍比稀释配制。

2.实验分组和实验方案

共有4个细胞，每个细胞各分为3组，每组3个孔。分别为rContr、rVAR2CSA组、CSA组。分别取A549、skov-3、ishikawa、HUVEC对数生长期细胞（均购自中科院生科院细胞库），接种于96孔板（购自Corning公司）中，每孔100μL，24h后分别加入rContr、rVAR2CSA和CSA，对照组每孔加培养基100μL，对照组和检测组均设3个复孔，另设空白对照组，不加细胞只加培养基的作为调零组。将96孔板置于37℃, 5%CO₂培养箱培养，细胞生长至70%-80%密度的时候，去上清，孵育用含2%的胎牛血清的PBS，4℃孵育30min，然后加入V5-FITC抗体进行第二次的孵育，孵育后流式检测进行分析。

3、结果

1、流式细胞仪检测MFI值分析

在此实验中，我们测试了患者来源的人类癌细胞系A549、skov-3、ishikawa和人类正常细胞来源的HUVEC与rVAR2CSA的结合率，每个细胞各分为3组，每组3个复孔。rContr组（对照组）只加入rContr，rVAR2CSA组只加入rVAR2CSA，CSA组同时加入rVAR2CSA和CSA。加完药物后待细胞长到70%-80%密度时取出，加入V5-FITC抗体孵育后，用流式细胞仪进行MFI(平均荧光强度)检测。

根据MFI值评估分析后得出结果，rVAR2CSA与人类癌细胞系表现出高结合率，同时加入抑制剂CSA后，结合率明显降低，说明rVAR2CSA具有识别人类癌细胞的功能。

实施例3 羟基红花黄色素A对HUVEC的作用

建立异常增殖的HUVEC模型，加入HSYA（购自中国药品生物制品检定所标准品）后，MTT检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。

实验分组和实验方案：

正常组：正常HUVEC

模型组：正常HUVEC+SGC7901上清液（50%）

给药组：正常HUVEC+SGC7901上清液（50%）+HSYA(0.075g/L)

正常的HUVEC 80%融合后传代，按1×10⁵接种于25cm²的培养瓶中，加入2.5mL/瓶的培养液，细胞贴壁6h后，随机分组，吸出培养液，正常组加入5mL/瓶的1640培养液（购自GIBCO），模型组加入含50%>

HUVEC细胞80%融合后传代，用培养基将细胞浓度调整为0.5×10⁵个/ml，接种于96孔板，置培养箱内贴壁6小时后，吸出上清，正常组加入1640培养液200μL/孔。37℃,5%CO₂分别培养48小时后，加入5mg/mL>

调整细胞浓度至10⁶个/mL，加入冰乙醇（75%）重悬，固定，加入1mL冷PBS（购自hyclone，GE），轻轻震荡使细胞悬浮。1000rpm，4℃离心，10分钟，弃上清，留沉淀，该过程进行两次。将细胞重悬于200μL>

实验结果：

1）MTT检测

给药组细胞吸光度明显低于模型组。与模型组比较，给药组细胞OD值明显低于模型组，说明给药组细胞生长收到抑制。

2）流式检测

给药组细胞凋亡峰明显升高；给药组细胞凋亡率明显高于模型组。与模型组相比，给药组细胞S期所占的比例明显降低，而其他各组的变化不明显。说明给药组HSYA抑制细胞生长，并可能发生凋亡。

实施例4：羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）的体外抑制肿瘤实验

低浓度的HSYA是一种较强的血管生成抑制剂，HSYA链接上VAS2CSA后，特异性识别肿瘤组织，最终达到移植肿瘤生长的功效。本实验通过动物模型来研究羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy Saffloryellow A）对胃癌移植瘤的抑制效果。

实验分组和实验方案：

把A549细胞株穿戴至足够数量后，带贴壁的细胞处于对数生长期时，用0.25%胰酶消化，于倒置显微镜下计数，并观察细胞活力大于95%，调整浓度，配制成1×10⁷个/mL单细胞悬液，按0.2mL/只接种于C57BL/6小鼠（购于广东省动物实验中心）左肋腹皮下，复制小鼠胃癌移植瘤模型。接种1周后随机分为五组，每组6只。接种次日开始，羟基红花黄色素A-红细胞黏附硫酸软骨素A受体蛋白多肽复合物（VAR2CSA-PEG-Hydroxy>

接种第22天，全部小鼠处死后，常规消毒，完整剥离小鼠左肋腹皮下肿瘤，用电子天平称取瘤重，计算各组的肿瘤生长抑制率。

实验结果：

集中后第7天时全部C57BL/6小鼠肉眼即可见在左侧腹壁下有微小突起，大小约0.25×0.22cm左右皮下结节，逐渐明显，均已出瘤，成瘤率100%；从肿瘤生长曲线可以看出肿瘤体积生长最快的是生理盐水组，生长最慢的是环磷酰胺组，用药第14天，各组肿瘤体积组建出现差异，生理盐水组与HSYA大剂量组小鼠移植瘤体制生长明显加快，HSYA小剂量组小鼠移植瘤体积生长相对较慢，CTX组生长最慢。在第16d的时候各组小鼠移植瘤体积增长都明显加快，其中HSYA各组肿瘤体积变化最明显。