水稻耐镉性能的检测方法及耐镉水稻的选育方法

摘要

本发明涉及一种水稻耐镉性能的检测方法及耐镉水稻的选育方法，属于水稻选育领域。水稻耐镉性能的检测方法，其包括：制备含水稻原生质体的原生质体溶液；测定原生质体溶液中的原生质体总数；将原生质体溶液与含镉离子的溶液作用后，得到含镉离子的原生质体溶液，测定含镉离子的原生质体溶液中的活性原生质体数；以及计算活性原生质体数占原生质体总数的百分比用以判断水稻的耐镉性能。本发明能够对水稻的耐镉性能进行快速、准确地检测，并且不受田间水分、气候、病害、虫害等因素的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻选育领域，具体而言，涉及一种水稻耐镉性能的检测方法及耐镉水稻的选育方法。

背景技术

我国南方部分水稻主产区土壤中重金属镉含量严重超标，而镉含量过高会影响水稻正常的生长，也会进一步影响水稻的产量。由于不同水稻品种对镉的抗性有着显著的差异，一些耐镉品种的水稻即使在污染地区种植，也能够正常生长。因此，非常有必要筛选出具有良好耐镉性能的水稻品种，并在镉超标地区推广使用。

目前筛选耐镉水稻品种的方法，都是通过盆栽和小区实际种植的方式进行实验检测。然而，由于水稻生长一季需要半年时间，而且前期的播种以及中期管理、施肥等工作也较为耗时耗力，而且经济成本也比较高。此外，由于在种植过程中，水稻的生长很容易由于受气候条件变化、水肥、病虫害等自然条件的影响，因而，种植试验往往需要进行2－3次的重复，才能得到可信的实验结果，这也进一步影响了检测和筛选实验的效率，增加了成本。

因此，开发一种可以低成本且高效检测水稻耐镉性能的方法是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻耐镉性能的检测方法，其能够对水稻的耐镉性能进行快速、准确地检测，并且不受田间水分、气候、病害、虫害等因素的影响。

本发明的另一目的在于提供一种耐镉水稻的选育方法，其能够快速、准确地筛选出耐镉的水稻品种。

本发明的实施例是这样实现的：

一种水稻耐镉性能的检测方法，其包括：

制备含水稻原生质体的原生质体溶液；测定原生质体溶液中的原生质体总数；将原生质体溶液与含镉离子的溶液作用后，得到含镉离子的原生质体溶液，测定含镉离子的原生质体溶液中的活性原生质体数；以及计算活性原生质体数占原生质体总数的百分比用以判断水稻的耐镉性能。

一种耐镉水稻的选育方法，其包括上述的水稻耐镉性能的检测方法。

本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例的检测水稻耐镉性能的方法利用水稻苗幼茎的原生质体进行耐镉性能检测，将原生质体经过镉离子溶液处理后通过计数原生质体溶液中存活的原生质体数和在镉离子溶液处理之前的原生质体总数的比值来检测水稻的耐镉性能，本发明实施例的检测方法简单，克服了现有盆栽或小区种植所存在的需要耗费大量时间成本和费用成本的缺陷，提高了检测效率，并且本发明实施例通过包含水稻所有生命物质的原生质体进行检测，其检测结果更为准确，可信度高，同时，本发明实施例的检测方法不受田间水分、气候、病虫害等因素的影响。

本发明实施例的耐镉水稻的选育方法，其通过本发明实施例的水稻耐镉性能的检测方法耐镉性能好的水稻，然后将选育出的耐镉水稻进行杂交育种或人工诱变育种。本发明实施例的耐镉水稻的选育方法能够简单、快速并且准确地筛选出具有优异耐镉性能的水稻品种，大大降低了时间和金钱成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的实验组1－1在荧光显微镜下拍摄的照片；

图2为本发明实施例1的实验组1－2在荧光显微镜下拍摄的照片；

图3为本发明实施例1的实验组1－3在荧光显微镜下拍摄的照片；

图4为本发明实施例1的实验组1－4在荧光显微镜下拍摄的照片；

图5为本发明实施例1的对照组在荧光显微镜下拍摄的照片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例的水稻耐镉性能的检测方法包括以下步骤：

步骤1：制备原生质体溶液

本发明实施例的原生质体溶液优选为原生质体悬浮液，制备原生质体悬浮液包括：

取水稻苗幼茎为原料，将水稻苗幼茎置于TVL溶液中静置。向TVL溶液中加入混合酶液进行酶解反应，对酶解后的溶液进行过滤处理，然后向得到的滤液中加入W5溶液并对溶液进行冷藏处理，得到原生质体悬浮液。具体地：

将生长10－20天的水稻苗幼茎切成长0.5－1mm长的小段置于TVL溶液中并在黑暗条件下静置15－45min。在切割水稻苗幼茎时，尽量一次切完，以避免多次切割对植物组织造成过多伤害。本发明实施例的TVL溶液包括山梨醇和二水氯化钙，山梨醇的浓度为0.1－0.5mol/L，二水氯化钙的浓度为30－60mmol/L。优选地，山梨醇的浓度为0.3mol/L，二水氯化钙的浓度为50mmol/L。

然后，向TVL溶液中加入混合酶液摇匀，将加入混合酶液后的TVL溶液置于水平摇床上以40－80转/min的速度摇动2－5h，使得水稻苗幼茎在混合酶液的作用下被充分分解。本发明实施例的混合酶液包括纤维素酶和果胶酶。在混合酶液中，纤维素酶的重量百分含量为1－5％，果胶酶的重量百分含量为0.3－1％。优选地，纤维素酶的重量百分含量为3％，果胶酶的重量百分含量为0.6％。

将酶解后的溶液过滤，向滤液中加入W5溶液并置于冷藏室中静置20min以上。W5溶液包括浓度为145－160mmol/L的NaCl、浓度为120－130mmol/L的二水氯化钙、浓度为2－8mmol/L的KCl和浓度为1－3mmol/L的MES(pH＝5.7)。优选地，NaCl的浓度为154mmol/L，二水氯化钙的浓度为125mmol/L，KCl的浓度为5mmol/L，MES(pH＝5.7)的浓度为2mmol/L。在本发明实施例中，采用纱布对酶解后的溶液进行过滤。为了提高过滤效果，优选采用8层纱布进行过滤。冷藏的目的在于抑制原生质体中酶的活性，使得在进行后续耐镉性能检测时，原生质体中的酶具有活性。冷藏室的温度优选为2－10℃，更优选地，冷藏室的温度为4℃。优选地，加入W5溶液后的滤液在冷藏室中静置30－40min。

经过上述步骤后，原生质体富集到溶液的中间层，由于原生质体中包含叶绿体，因此在溶液的中间呈现出便于区分的绿色。

进一步地，在本发明的较佳实施例中，对冷藏后的原生质体悬浮液进行纯化处理。纯化处理包括：向原生质体悬浮液中加入W5溶液，混合均匀后进行离心处理，去除上清液，再加入W5溶液重新进行悬浮处理。在进行离心处理时，离心力为100×g，离心时间为5－10min。优选地，离心时间为5min。

步骤2：测定原生质体总数

本步骤是测定在未经过含镉离子的溶液作用的原生质体溶液中的原生质体数，以此作为原生质体总数。具体地：

向原生质体溶液中加入细胞荧光染料对原生质体溶液进行染色处理。加入W5溶液稀释后离心，去除上清液，再加入W5溶液混匀，然后统计被染色的原生质体数为原生质体总数。同样地，在进行离心处理时，离心力为100×g，离心时间为5－10min，其中，g＝9.8m/s²。优选地，离心时间为5min。

在本发明实施例中，细胞荧光染料是二乙酸荧光素、碘化丙啶(PI)、4，6－二脒基－2－苯基吲哚(DAPI)、异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或别藻青蛋白(APC)。本发明实施例的细胞荧光染料包括但不限于上述列举的，本领域技术人员可以根据实际情况进行相应选择。

在本发明的较佳实施例中，配制等体积的细胞荧光染料溶液对原生质体溶液中的原生质体进行染色处理。优选地，细胞荧光染料溶液的浓度为0.005－0.05wt％。更优选地，细胞荧光染料溶液的浓度为0.01wt％。

步骤3：测定活性原生质体数

本步骤是测定在经过含镉离子的溶液作用后的原生质体溶液中的原生质体数，也即是，测定含镉离子的原生质体溶液中的活性原生质体数。具体地：

向原生质体溶液中添加含镉离子的溶液。含镉离子的溶液的浓度为0.2－10mg/L。经含镉离子的溶液处理后，进行离心处理，去除上清液，再加入W5溶液重新进行悬浮处理，得到含镉离子的原生质体溶液。在具体实施时，本领域技术人员可以取多份等体积的原生质体悬浮液，向每份原生质体悬浮液中添加浓度逐渐增大的镉离子溶液，从而检测水稻品种对不用浓度的镉离子溶液所表现出的耐镉性能，进而优选出具有较强耐镉性能的水稻品种。

然后，向含镉离子的原生质体溶液中加入细胞荧光染料对含镉离子的原生质体溶液进行染色处理，加入W5溶液稀释后离心，去除上清液，再加入W5溶液混匀，然后统计被染色的原生质体数为活性原生质体数。

步骤4：计算活性原生质体数占原生质体总数的百分比

取等体积的原生质体溶液液和含镉离子的原生质体溶液，计算活性原生质体数占原生质体总数的百分比。优选地，取多个视野下，并计算每个视野下的原生质体数，计算出经过镉离子溶液处理的活性原生质体数与未经过镉离子溶液处理的原生质体溶液中的原生质体总数的比值，求取平均值，以该比值大小作为评价水稻品种耐镉性能的参数。比值越大，说明经过镉离子处理后存活的原生质体数量越大，进而具有更好的耐镉性能。作为一个参考标准，一般取比值大于60％的作为耐镉水稻品种。应当理解，该参考标准还可以提高，例如取比值大于80％或90％的作为具有优异耐镉性能的水稻品种。

本发明实施例的耐镉水稻的选育方法，包括上述的水稻耐镉性能的检测方法。在进行选育时，通过本发明实施例的水稻耐镉性能的检测方法耐镉性能好的水稻，然后将选育出的耐镉水稻进行杂交育种或人工诱变育种。

实施例1

通过本实施例的水稻耐镉性能的检测方法，检测同一水稻品种对不同浓度的含镉离子的溶液所表现出的耐镉性能。在本实施例中，选取的水稻品种为“湘早籼24”。

在本实施例中，TVL溶液包括浓度为0.25mol/L的山梨醇和浓度为40mmol/L的二水氯化钙。即，在1L TVL溶液中包含0.25mol山梨醇和40mmol二水氯化钙。

在本实施例中，W5溶液包括浓度为150mmol/L的NaCl、浓度为128mmol/L的二水氯化钙、浓度为6mmol/L的KCl和浓度为1.5mmol/L的MES(pH＝5.7)。即，在1L W5溶液中包含150mmol NaCl、128mmol二水氯化钙、6mmol KCl和1.5mmol MES(pH＝5.7)。

在本实施例中，混合酶液中纤维素酶的重量百分含量为2％，果胶酶的重量百分含量为0.5％。

在本实施例中，细胞荧光染料为浓度为0.01wt％二乙酸荧光素(FDA)。

取生长14天的“湘早籼24”水稻苗幼茎，分成五等份分，每份2g，其中四份作为实验组，剩余一份作为对照组。

将五份水稻苗幼茎在超净台上用手术刀切割成0.5mm长的小段。切割时尽量只切一刀，以避免对植物组织造成过多伤害。将切割后的水稻苗幼茎分别转入五个装有15mL的TVL溶液的小烧杯中，在黑暗条件下静置30min。然后，加入混合酶液15mL，置于水平摇床上摇动4h，水平摇床的转速设定为60转/min，使得溶液充分均匀，酶解得更加充分。将酶解后的溶液用纱布过滤，所得滤液转入至无菌的离心管中，再缓慢滴入20mL W5溶液。将离心管置于温度为4℃的冰箱内冷藏45min，使离心管内原生质体自动沉降。经过45min中冷藏后，原生质体富集到溶液的中间层，由于原生质体内包含叶绿体，其在溶液中间呈现出极易区分的绿色。

作为可选的操作步骤，可以对上述原生质体溶液进行纯化处理。用吸管吸取富集在溶液中间层的原生质体溶液至容量为50mL的离心管中，大约取10mL。向离心管中加入10mL W5溶液，混匀，在离心力为100×g下离心5min，去除上清，再加入2mL W5重新悬浮。

取体积为100μL上述原生质体溶液作为对照组，用等体积的0.01％二乙酸荧光素(FDA)染色10min。然后，加入W5溶液稀释到1mL，在100×g的离心力下离心5min，去上清，再加入适量W5溶液，混匀。用荧光显微镜拍摄绿色荧光下的原生质体并计数，计算原生质体总数，为了提高准确性，取3个视野，计算平均值。

取体积为1mL作为实验组的上述原生质体溶液四份，分别加入含镉离子的溶液，使得每份原生质体溶液中镉离子的浓度分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L和1.6mg/L。经镉离子处理10min后，在100×g的离心力下离心5min，去除上清液，再加入1ml的W5重新悬浮。然后，用等体积的0.01％二乙酸荧光素(FDA)染色10min，加入W5稀释到1mL，在100×g的离心力下离心5min，去除上清液，再加入1ml的W5溶液，轻轻震动混匀。用荧光显微镜拍摄绿色荧光下的原生质体并计数，计算经镉离子作用后的活性原生质体数，为了提高准确性，取3个视野，计算平均值。

计算活性原生质体数占原生质体总数的百分比。在本发明实施例中，用抑制率表征水稻品种的耐镉性能，抑制率＝100－活性原生质体数占原生质体总数的百分比。未经镉离子作用的原生质体溶液的抑制率为0％，抑制率越大表示经镉离子作用后的原生质体溶液中存活的原生质体数越少，因而耐镉性能越差。

上述实验组和对照组的检测结果见表1。

表1

实验组溶液中镉离子浓度(mg/L)抑制率(％)1－10.224.811－20.451.941－30.886.821－41.696.90对照组00

从表1可以看出，“湘早籼24”水稻随镉离子浓度变化所表现出的耐镉性，当镉离子浓度为0.2mg/L时，只有24.81％的原生质体受到镉离子的抑制作用，无法正常生长，此时“湘早籼24”表现出较强的耐镉性能。当镉离子浓度增大至0.4mg/L，受抑制的原生质体数增长至51.94％，有约一半的原生质体无法正常生长。随着镉离子浓度继续增大，“湘早籼24”的耐镉性逐渐降低，将镉离子浓度增大至1.6mg/L时，96.90％的原生质体受到镉离子的抑制作用，几乎全部的原生质体无法生长。

将上述经镉离子作用的原生质体溶液在荧光显微镜下观察，拍摄的照片如图1－5所示。图1为实验组1－1的照片，照片中被染色的绿色荧光点(即，图中的灰色小点)较多。图2为实验组1－2的照片，照片中被染色的绿色荧光点变少，这是由于镉离子浓度增大所导致。图3为实验组1－3的照片，照片中被染色的绿色荧光点更少，这是由于镉离子浓度增大所导致。图4为实验组1－4的照片，照片中被染色的绿色荧光点最少，在拍摄的照片范围内几乎没有，这是由于镉离子浓度增大至1.6mg/L所导致。图5为对照组的照片，由于其没有被镉离子作用，因此被染色的原生质体数最多。

因此，对于“湘早籼24”水稻而言，其可以在镉离子浓度约0.2mg/L或者低于0.2mg/L的土壤里播种。由此可见，通过本实施例可以检测出水稻品种能够正常播种的土壤中所含镉离子的最大浓度，为在镉含量超标的土壤中播种水稻提供指引方向。

需要说明的是，本实施例仅以“湘早籼24”水稻为例进行了耐镉测试，本领域技术人员可以在本实施例的教导下对其他水稻品种按照上述检测方法进行水稻耐镉性能的检测，其所采用的检测方法均在本发明实施例的保护范围之内。

实施例2

通过本实施例的水稻耐镉性能的检测方法，检测不同水稻品种对相同浓度的含镉离子的溶液所表现出的耐镉性能，以筛选出在同等条件下，耐镉性能最佳的水稻品种。在本实施例中，选取的水稻品种包括“湘早籼24”、“T优705”、“黄花粘”、“粤香占”和“天优998”。

按照与实施例1相同的方法制备每个水稻品种的原生质体溶液，并且计算出每个水稻品种的原生质体溶液在未经过镉离子作用的原生质体总数。原生质体溶液体积为1mL。

分别取体积为1mL上述五个水稻品种的原生质体溶液，向每个水稻品种的原生质体溶液中分别加入含镉离子的溶液，使得每份原生质体溶液中镉离子的浓度均为0.4mg/L。经镉离子处理10min后，在100×g的离心力下离心5min，去除上清液，再加入1ml的W5重新悬浮。然后，用等体积的0.02％碘化丙啶(PI)染色10min，加入W5稀释到1mL，在100×g的离心力下离心5min，去除上清液，再加入1ml的W5溶液，轻轻震动混匀。用荧光显微镜拍摄绿色荧光下的原生质体并计数，计算经镉离子作用后的活性原生质体数，为了提高准确性，取3个视野，计算平均值。

计算活性原生质体数占原生质体总数的百分比。并按照实施例1的方法计算出镉离子对每个水稻品种的抑制率，详见表2。

表2

水稻品种溶液中镉离子浓度(mg/L)抑制率(％)“湘早籼24”0.451.94“T优705”0.468.21“黄花粘”0.441.71“粤香占”0.474.39“天优998”0.455.72

从表2可以看出，在镉离子浓度相同的情况下，“黄花粘”水稻

的抑制率最低，进而表现出最佳的耐镉性能，“湘早籼24”水稻和“天优998”水稻耐镉性能一般，“T优705”水稻次之，“粤香占”水稻最差。由此，可以筛选出耐镉性能最佳的水稻品种为“黄花粘”水稻。

需要说明的是，本实施例仅以“湘早籼24”、“T优705”、“黄花粘”、“粤香占”和“天优998”水稻为例进行了耐镉测试，本领域技术人员可以在本实施例的教导下对其他水稻品种按照上述检测方法进行水稻耐镉性能的检测，以筛选出耐镉性能最佳的水稻品种，其所采用的检测方法也均在本发明实施例的保护范围之内。

实施例3

本实施例的耐镉水稻的选育方法是利用本发明实施例的水稻耐镉性能的检测方法检测出耐镉性能佳的水稻品种，然后将筛选出的耐镉水稻用于育种，培育出耐镉的水稻品种。在本实施例中，可以采用杂交育种或人工诱变育种。

以实施例2检测出的耐镉性能最佳的“黄花粘”水稻为例，将其与“华南早籼”进行杂交育种，培育出耐镉性能佳的水稻品种。

综上所述，本发明实施例的水稻耐镉性能的检测方法利用水稻的原生质体能够对水稻品种的耐镉性能进行快速、准确的检测，极大地节约的时间成本和种植成本，同时由于检测方法在实验室内即可完成，因此不受田间水分、气候、病害和虫害等因素的影响。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。