一种磷酸盐诱导启动子降低黑曲霉β‑葡萄糖苷酶表达酶活的方法

摘要

本发明公开了一种磷酸盐诱导启动子降低黑曲霉β‑葡萄糖苷酶表达酶活的方法，属于基因工程领域。本发明方法包括如下步骤：（1）将由磷酸盐诱导启动子或含磷酸盐诱导启动子的DNA序列、表达与β‑葡萄糖苷酶mRNA互补的反义mRNA的DNA序列和终止子序列组成的DNA片段构建到表达载体上；（2）将步骤（1）所构建的重组载体转化到黑曲霉中；（3）往培养基中加入磷酸盐后对转化有重组载体的黑曲霉菌株进行培养。本发明利用磷酸盐诱导启动子调控β‑葡萄糖苷酶mRNA互补的反义mRNA转录，有效降低了β‑葡萄糖苷酶的翻译量和表达的活性，从而优化了黑曲霉表达的纤维素酶系组合，以最大化发挥纤维素酶系降解纤维素的效率。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种磷酸盐诱导启动子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表达酶活的方法。

背景技术

纤维素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。

在纤维素酶降解纤维素的时候，外切酶先把纤维素酶解为短链可溶的片段，内切酶把短链的片段酶解为纤维二糖，纤维二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下酶解为葡萄糖。纤维素酶酶解纤维素是一个协同降解的过程，某一种酶活性过高或者过低都会降低纤维素酶解效率。

黑曲霉是一种食品安全菌，产生的纤维素酶具有广阔的应用领域，比如污水处理、垃圾利用、食品等。黑曲霉生产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶的酶活相对较高，三种酶的组成不利于最大化的发挥酶的催化效率。降低β-葡萄糖苷酶的活性是优化纤维素酶酶系组成的一个重要措施。已有的降低某种酶的表达效率的措施主要为基因敲除，也取得了一些效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种磷酸盐诱导启动子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表达酶活的方法。本发明的目的还在于提供一种磷酸盐诱导β-葡萄糖苷酶活性降低的黑曲霉菌株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种磷酸盐诱导启动子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表达酶活的方法，包括如下步骤：

（1）将由磷酸盐诱导启动子或含磷酸盐诱导启动子的DNA序列、表达与β-葡萄糖苷酶mRNA互补的反义mRNA的DNA序列和终止子序列组成的DNA片段构建到表达载体上；

（2）将步骤（1）所构建的重组载体转化到黑曲霉中；

（3）往培养基中加入磷酸盐后对转化有重组载体的黑曲霉菌株进行培养。

步骤（1）中所述的含磷酸盐诱导启动子的DNA序列优选如SEQ ID NO.1所示。

步骤（1）中所述的表达与β-葡萄糖苷酶mRNA互补的反义mRNA的DNA序列优选如SEQID NO.2所示。

步骤（1）中所述的终止子序列优选如SEQ ID NO.3所示。

步骤（1）中所述的表达载体优选为pMW1载体。

步骤（1）优选为：将序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段通过限制性内切酶EcoI、KpnI及DNA连接酶构建到pMW1载体上，得到重组载体。

步骤（2）中所述的黑曲霉优选为黑曲霉ATCC16404。

步骤（2）优选通过农杆菌将所构建的重组载体转化到黑曲霉中。

步骤（3）中所述的培养基的配方优选为：麸皮10g，蛋白胨1g，牛肉膏1g，水1L。

步骤（3）中所述的磷酸盐优选为磷酸钠。

一种磷酸盐诱导β-葡萄糖苷酶活性降低的黑曲霉菌株，为上述方法中构建的转化有重组载体的黑曲霉菌株。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明利用磷酸盐诱导启动子调控β-葡萄糖苷酶mRNA互补的反义mRNA转录，有效降低了β-葡萄糖苷酶的翻译量和表达的活性，从而优化了黑曲霉表达的纤维素酶系组合，以最大化发挥纤维素酶系降解纤维素的效率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1. 材料

黑曲霉（Aspergillus>）ATCC16404，大肠杆菌（Escherichia>）DH5α，根癌农杆菌（Agrobacterium>）AGL1，pMW1质粒（BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心）。

人工合成的DNA序列1（SEQ ID NO.4所示），该序列由含磷酸盐诱导启动子的DNA序列、表达与β-葡萄糖苷酶mRNA互补的反义mRNA的DNA序列、终止子序列及两端的酶切位点序列组成。

2. 方法

（1）质粒pMW1的提取

含有质粒pMW1的大肠杆菌DH5α在含有30μg/mL氨苄霉素的LB培养基中培养18h。质粒提取按照上海生工的一步法质粒DNA抽提试剂盒（产品编号B518188）的操作流程提取。具体如下：取0.5mL菌液，10000r/m离心3min收集菌体，倒尽或吸干培养基。在菌体沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振荡至彻底悬浮菌体，室温放置3min。将裂解液全部小心移入吸附柱，室温放置1min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，再次向吸附柱中加入500μL WashSolution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，将空吸附柱和收集管放入离心机，8000rpm离心2min。将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室温静置2min，8000r/m离心2 min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

（2）重组质粒的构建

1）pMW1质粒、合成的DNA序列1的酶切、回收

往20μL提取的pMW1质粒或用双蒸水稀释10倍的DNA序列1中加入EcoI和KpnI（Takara）各2μL、酶切缓冲液2.5μL，37℃水浴3h后，加入2μL>

酶切的质粒或DNA序列1通过琼脂糖凝胶电泳后用上海生工的SanPrep核酸纯化套件（胶回收）试剂盒（B515103-0100）回收，得pMW1质粒酶切回收液、DNA序列1酶切回收液。

2）连接和转化

连接体系为：pMW1质粒酶切回收液17.5μL，DNA序列1酶切回收液2μL，DNA连接酶（Takara）2.5μL，连接酶缓冲液2.5μL。16℃连接24h，连接产物备用。

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子培养，提质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pMW1-01。

（3）黑曲霉孢子原生质体制备及重组质粒的转化

1）斜面活化

在无菌操作台中，将保藏的黑曲霉ATCC16404菌种接入已灭菌的斜面培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养3天，斜面长出孢子。

所用斜面培养基为PDA培养基，其配制方法为：取新鲜马铃薯60g，去皮切成细丝状，加入适量蒸馏水，置于蒸煮锅内煮沸并不断用玻璃棒搅拌至快成糊状，用八层纱布过滤取滤液，依次加入用天平称取的葡萄糖2g、琼脂2g，搅匀，最后用蒸馏水定容至100mL，加热溶解。分装于试管中，约至试管的三分之一，然后加塞包扎灭菌，灭菌温度为121℃，压强为0.1Mpa，灭菌20min。灭菌结束后摆斜面冷却待用。

2）孢子悬浮液的制备

将已活化的黑曲霉孢子从试管中刮到装有生理盐水的三角瓶中，置于30℃摇床上，150r/m震荡10min。取出用4层擦镜纸过滤，将滤液用3000r/m离心，弃上清液，用生理盐水洗涤1-2次。然后对悬浮液进行镜检和计数，调整孢子浓度约为5×10⁸个/mL，50℃热激1min，30℃培养8h，得到孢子萌发悬浮液。

3）原生质体悬液的制备

采用高渗溶液即0.8mol/L NaCl溶液配制0.5%蜗牛酶和1%纤维素酶的混合酶液10mL，加入10mL孢子萌发悬浮液，30℃水浴4h，用微孔滤膜过滤，再用0.8mol/L NaCl溶液反复冲洗滤膜上的孢子，最后滤膜上的孢子溶解到10mL 0.8mol/L NaCl溶液中，得到原生质体悬液。

4）根癌农杆菌感受态的制备

挑取根癌农杆菌AGL1接种于3mL LB液体培养基中，28℃、180r/min培养过夜。取2mL 培养液接种于100mL LB液体培养基中继续培养，至OD₆₀₀为0.5左右。将培养液置冰浴中40min后4℃、5000r/min>

5）根癌农杆菌的转化和培养

取1μL重组质粒pMW1-01，加到70μL根癌农杆菌AGL1感受态细胞中，混匀，吸取并加到间距0.2cm电转杯中，擦拭干净，调节电击电压为2.5kV，电击5ms。将电转化后的根癌农杆菌涂布于LB平板（含100μg/mL氨苄霉素）上进行筛选。筛选得到的阳性克隆子在LB平板（含100μg/mL氨苄霉素）上划线，28℃培养2d。挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基（含100μg/mL氨苄霉素）中，28℃、180r/min培养16～20h。取1mL根癌农杆菌菌液接种于含有相应抗性的100mL LB液体培养基中，28℃、180r/min培养至OD₆₀₀为0.8左右时备用。

6）诱导培养和转化

根癌农杆菌的诱导培养：取4mL（OD₆₀₀＝0.8）的根癌农杆菌菌液5000r/min离心5min收集菌体，用6mL含有400μmol/L乙酰丁香酮的IM培养基悬浮菌体，28℃悬浮培养5h。IM培养基：KH₂PO₄>2HPO₄>4NO₃>2>4·7H₂O>

转化：黑曲霉原生质悬液250μL，调节诱导后的根癌农杆菌菌液的浓度，按黑曲霉孢子与根癌农杆菌1:100的数量比例等体积混合均匀，涂布在转化媒介醋酸硝酸混合膜的IM固体培养基上。

7）转化子的筛选

涂布在转化媒介醋酸硝酸混合膜的IM固体培养基上的黑曲霉24℃避光培养48h，然后将原生质体长处的菌丝用无菌水稀释后涂到含有150μg/mL潮霉素B的IM固体培养基上进行初筛，培养4d，随后转接至含有200μg/mL潮霉素B的IM培养基上进行复筛，获得转化成功的转化子。

（4）诱导启动降低β-葡萄糖苷酶的表达活性

1）产酶培养

产酶培养基配制：麸皮10g，蛋白胨1g，牛肉膏1g，自来水1L，115℃灭菌30min。在250mL三角瓶中装入150mL液体产酶培养基。

在无菌操作台中，将黑曲霉菌种或筛选的转化子接入已灭菌的斜面PDA培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养3d，得到斜面孢子。得到的斜面孢子接入到产酶培养基中，接种量为 1×10⁵孢子/mL，150r/m、30℃培养36h，培养液用滤纸过滤，测定滤液β-葡萄糖苷酶的酶活。出发菌株的酶活为22U/mL，所筛选转化子的酶活为21.0U/mL。

β-葡萄糖苷酶酶活测定按照文献（张莉，王婧，杨婷。产β-葡萄糖苷酶酿酒酵母菌株紫外诱变选育及酶学性质分析。《食品工业科技》， 2015。）中的方法。

2）磷酸盐诱导产酶培养

往产酶培养基中加入磷酸钠，磷酸钠的终浓度为2g/L。在无菌操作台中，将黑曲霉菌种或筛选的转化子接入已灭菌的斜面PDA培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养3d，得到斜面孢子。黑曲霉菌种或筛选的转化子接入到诱导培养基中，接种量为 1×10^{5>孢子/mL，150r/m、30℃培养培养36h，滤纸过滤，测定滤液β-葡萄糖苷酶的酶活。出发菌株的酶活为25U/mL，所筛选转化子的酶活为7.8U/mL。这说明启动子在磷酸盐诱导下，启动β-葡萄糖苷酶反义mRNA的转录，降低了β-葡萄糖苷酶的翻译量，从而降低了其表达量。}

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工业大学

<120> 一种磷酸盐诱导启动子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表达酶活的方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1346

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 含磷酸盐诱导启动子的DNA序列

<400> 1

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<211> 110

<212> DNA

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<223> 表达与β-葡萄糖苷酶mRNA互补的反义mRNA的DNA序列

<400> 2

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<211> 214

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 终止子序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 1686

<212> DNA

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<223> DNA序列1

<400> 4

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attcgg 1686

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