一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法

摘要

本发明涉及一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，属于淡水蚌类繁育技术领域。其包括选择成熟且活力好的紫黑翼蚌钩介幼虫，通过悬浮快速沉降法清洗幼虫，制备特定鱼血浆，配置特定幼虫体外培养液配方，在无二氧化碳的控温培养条件下实现钩介幼虫的变态发育，最后采用自来水逐步稀释替换培养液，唤醒变态稚蚌。本发明采用改进的体外培养方法和特定培养液配方首次实现了蚌类斧头型钩介幼虫的非寄生变态发育，在没有特定寄主鱼的限制条件下，突破了我国紫黑翼蚌人工繁育关键技术瓶颈，不仅使蚌类钩介幼虫体外培养技术和理论得到了完善和提高，对蚌类人工繁育及增殖保护具有重要应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，属于淡水蚌类繁育技术领域。

背景技术

大多数蚌类钩介幼虫需要短暂地寄生在特定的鱼类或蝾螈上，才能完成变态发育从而实现自然繁衍。自Isom & Hudson（1982）创建钩介幼虫体外培养技术以来，在幼虫清洗、抗生素使用、血浆（或血清）种类及换液频率等方面不断改进和完善，形成了经典的体外培养技术，为世界蚌类人工繁育保护与变态发育基础研究提供了重要技术途径。与寄主鱼寄生方法相比，钩介幼虫体外培养技术具有培养数量大、成本低、繁殖成功率高等优势，尤其对于缺乏寄主鱼及信息的蚌类人工繁育具有重要应用价值。

紫黑翼蚌（Potamilus>），原产于北美洲，属大型淡水贝类，成蚌个体达20cm以上，珍珠层厚实，呈紫黑色，光泽好，在自然水域中能产生天然的紫黑珍珠，进一步的人工育珠试验结果表明：紫黑翼蚌具有培育高值紫黑珍珠的良好前景。为发展紫黑珍珠养殖，我国2012年从美国引进一批紫黑翼蚌幼蚌在国内开展人工驯养，通过2年多驯养研究，首次人工培育出一批亲蚌，初步建立了我国紫黑翼蚌人工繁育基础种群。近百年的研究结果表明：紫黑翼蚌钩介幼虫对寄主鱼具有高度选择性，淡水石首鱼是目前发现唯一的特定寄主鱼。由于国内没有淡水石首鱼，严重制约了我国紫黑翼蚌苗种的规模化繁育。因此，体外培养技术成为实现紫黑翼蚌变态发育的首选技术途径。

经典的蚌类钩介幼虫体外培养采用M199或MEM为基础培养液，需要在1～5%的二氧化碳条件下调节维持稳定的pH，实现钩介幼虫的非寄生变态发育。蚌类钩介幼虫主要分为有钩型、无钩型和斧头型3种类型。目前，通过经典的体外培养方法已实现了41种蚌类钩介幼虫的非寄生变态发育，这些幼虫都为无钩或有钩型，具有较大的双壳，在变态发育过程中仅内脏完成组织分化而外壳几乎不生长。紫黑翼蚌钩介幼虫为斧头型，双壳无法完全闭合，外壳与内脏器官需同时生长才能完成变态发育，且变态发育周期较长。目前，以经典的体外培养技术和理论，对于紫黑翼蚌这类内脏和外壳同时生长发育类型的钩介幼虫体外培养一直未能取得突破。因此，在我国没有特定寄主鱼的重大限制条件下，研制出适宜于紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的配方及方法是突破我国紫黑翼蚌人工繁育的重要技术途径之一。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法。

按照本发明提供的技术方案，一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，步骤为：

（1）选种：检查紫黑翼蚌孕育蚌育儿囊发育情况，选择成熟且活力良好钩介幼虫用于体外培养。钩介幼虫成熟和活力鉴定标准：幼虫为淡黄色、黄色或褐色，取少量显微镜下检查，外膜破裂，双壳做5～12次/min的开合运动，加入L-15培养液双壳立即并一直保持关闭状态。

（2）幼虫获取：采用18号注射器从孕育蚌育儿囊后端中部垂直刺入，将L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃间隔中的钩介幼虫冲出，流入500ml烧杯中，用吸管吹打使幼虫分散，加入300～500ml L-15培养液清洗幼虫，通过悬浮快速沉降3～5次，完全去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物等。

（3）特定鱼血浆制备：取500～800g健康瓜子斑，采用10ml无菌注射器，用肝素钠溶液润湿注射器，尾静脉无菌采血，4℃条件下3000转/min离心10min，取上清液0.45µm无菌膜过滤1次，-80℃冻存，使用前0.22µm无菌膜过滤2次。

（4）混合抗生素溶液配置：每100ml无菌纯水溶液中加入50～100 µg羧苄青霉素二钠、50～100 µg硫酸庆大霉素、50～100 µg发霉素和2.5～5µg两性霉素B，充分溶液后0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用。

（5）幼虫培养液的配置：按L-15基础培养液：步骤（3）制备的特定鱼血浆：步骤（4）制备的混合抗生素溶液体积比2:0.8～1.5:0.5取液混合，配置得到幼虫培养液。

（6）培养：在无菌操作台中，将步骤（5）制备所得3.5mL幼虫培养液加入无菌培养皿中，培养皿直径为6cm，加入清洗好的钩介幼虫，数量控制在100～400只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在23～25℃；每3d更换一次步骤（5）制备所得新鲜的幼虫培养液。

在培养20～24d后幼虫完成变态发育，每小时向培养皿中按培养液与充分曝气的自来水体积比1:1逐步加入充分曝气的自来水，水温保持在23～25℃；6～8h内稀释替换至自来水含量大于95%，幼虫变态率可达到90%以上，即完成培养。

本发明的有益效果：

1、采用L-15作为基础培养液，在培养箱中无需提供二氧化碳来维持培养液的pH，降低了对培养设施的要求，简化了培养方法，减少了换液频率，显著降低了培养成本，使蚌类钩介幼虫体外培养技术和理论得到了进一步完善和提高。

2、采用特定鱼类血浆和适宜的抗生素浓度，首次实现了斧头型钩介幼虫的非寄生变态发育，突破了我国紫黑翼蚌人工繁育关键技术，对蚌类人工繁育和增殖保护具有重要应用价值。

具体实施方式

以下实施例中L-15培养液购自生工生物工程股份有限公司。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

（1）选种：2014年11月21日，取N1紫黑翼蚌孕育蚌，检查育儿囊内幼虫为黄色，幼虫能做开合运动，加L-15培养液后幼虫双壳立即并一直保持闭合。

（2）幼虫获取：用18号注射器从育儿囊后端垂直刺入，将L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃丝中成熟钩介幼虫冲出，流入500mL烧杯中，用吸管吹打幼虫使分散，加入400mL L-15培养液，并通过5次快速悬浮沉降，尽量去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物等。

（3）特定鱼血浆的制备：取体重500～600g健康的斜带髭鲷，采用10mL注射器尾静脉无菌采集血液，每尾可采集8～10mL，4℃条件下3000r/min离心10min，取上清液0.45µm无菌过滤膜过滤1次，-80℃冻存，使用前0.22µm无菌过滤膜过滤2次。

（4）混合抗生素溶液配置：每100mL无菌纯水溶液中加入50 µg羧苄青霉素二钠、50 µg硫酸庆大霉素、50µg发霉素和2.5µg两性霉素B，充分溶液后0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用。

（5）幼虫培养液的配置：按体积比2:0.8:0.5比例混合L-15基础培养液、特定鱼血浆及混合抗生素溶液，配置幼虫培养液。

（6）培养：在无菌操作台中，将上述3.5mL混合培养液加入无菌培养皿中，培养皿直径为6cm，加入清洗好的钩介幼虫，数量300±10只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在24 ± 0.5℃；每3d更换一次新鲜的培养液。

在培养20d后，向培养皿逐步加入充分爆气的自来水唤醒稚蚌，水温保持在23～25℃，8h内稀释替换直至自来水含量大于95%，幼虫变态率为92.9 ± 3.1%。

实施例2

（1）选种：2014年12月06日，取N23紫黑翼蚌孕育蚌，检查育儿囊内幼虫为黄色，幼虫能做开合运动，加L-15培养液后幼虫双壳立即并一直保持闭合。

（2）幼虫获取：用18号注射器从育儿囊后端垂直刺入，将L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃丝中成熟钩介幼虫冲出，流入500mL烧杯中，用吸管吹打幼虫使分散，加入500mL L-15培养液，并通过4次快速悬浮沉降，尽量去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物等。

（3）特定鱼血浆的制备：取体重500～600g 健康的斜带髭鲷，采用10mL注射器尾静脉无菌采集血液，每尾可采集8～10mL，4℃条件下2000转/min离心20min，取上清液0.45µm无菌过滤膜过滤1次，-80℃冻存，使用前0.22µm无菌过滤膜过滤2次。

（4）混合抗生素溶液配置：每100mL无菌纯水溶液中加入100µg羧苄青霉素二钠、100µg硫酸庆大霉素、100µg发霉素和5µg两性霉素B，充分溶液后0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用。

（5）幼虫培养液的配置：按体积比2:1:0.5比例混合L-15基础培养液、特定鱼血浆及混合抗生素溶液，配置幼虫培养液。

（6）培养：在无菌操作台中，将上述3.5mL混合培养液加入无菌培养皿中，培养皿直径为6cm，加入清洗好的钩介幼虫，数量390±10只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在24 ± 0.5℃；每3d更换一次新鲜的培养液。

在培养24d后，向培养皿逐步加入充分爆气的自来水唤醒稚蚌，水温保持在23～25℃，8h内稀释替换直至全部为自来水，幼虫变态率在90.6 ± 3.7%。

实施例3

（1）选种：2015年10月21日，取N12紫黑翼蚌孕育蚌，检查育儿囊内幼虫为黄色，幼虫能做开合运动，加L-15培养液后幼虫双壳立即并一直保持闭合。

（2）幼虫获取：用18号注射器从育儿囊后端垂直刺入，将L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃丝中成熟钩介幼虫冲出，流入500mL烧杯中，用吸管吹打幼虫使分散，加入400mL L-15培养液，并通过5次快速悬浮沉降，尽量去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物等。

（3）特定鱼血浆的制备：取体重650～800g 健康的斜带髭鲷，采用10mL注射器尾静脉无菌采集血液，每尾可采集10～12mL，4℃条件下2500r/min离心15min，取上清液0.45µm无菌过滤膜过滤1次，-80℃冻存，使用前0.22µm无菌过滤膜过滤2次。

（4）混合抗生素溶液配置：每100mL无菌纯水溶液中加入75µg羧苄青霉素二钠、75µg硫酸庆大霉素、75µg发霉素和3µg两性霉素B，充分溶液后0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用。

（5）幼虫培养液的配置：按体积比2:1.5:0.5比例混合L-15基础培养液、特定鱼血浆及混合抗生素溶液，配置幼虫培养液。

（6）培养：在无菌操作台中，将上述3.5mL混合培养液加入无菌培养皿中，培养皿直径为6cm，加入清洗好的钩介幼虫，数量250 ± 10只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在24 ± 0.5℃；每3d更换一次新鲜的培养液。

在培养20d后，向培养皿逐步加入充分爆气的自来水唤醒稚蚌，水温保持在23～25℃，6h内稀释替换直至全部为自来水，幼虫变态率在95.2±2.4%。

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