一种快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法

摘要

本发明提供了一种从芽孢杆菌发酵液中快速定量检测芽孢体和营养体的方法。包括芽孢萌发、营养体细胞NADH的提取及其荧光检测。将营养体细胞离心得菌体，经提取NADH并测定荧光强度；然后将芽孢细胞经过萌发剂萌发，在细胞不显著增殖的前提下在细菌培养液混合1.5h得到由芽孢转化成的营养体细胞，检测细胞NADH含量，最后通过增加的NADH含量计算出芽孢的浓度。本发明可适用于基于芽孢杆菌纯培养的发酵体系，尤其是以芽孢杆菌作为发酵剂生产微生态制剂，能实现发酵过程监控或者终端产品的快速、灵敏测定。亦可用于食品、环境中的芽孢数量的定量检测。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种快速定量检测芽孢杆菌发酵液中芽孢体和营养体的方法，特别是基于芽孢体和营养体细胞中NADH的差别实现两种不同形态细胞的快速定量测定，属于微生物发酵和检测技术领域。

背景技术

芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧并能够产生具有抗逆性的内生孢子的杆状细菌，因为芽孢杆菌的芽孢特性使其能够对热、紫外线、辐射等不利条件有很强抗性。芽孢杆菌中具有很多特殊功能的菌株，在实际应用中具有较大价值。有的菌株能分泌多种酶类，是酶制剂的良好来源；大部分菌株与动植物关系密切互惠共生，可以用于益生菌制剂和菌肥；有的还可以用于生产微生物农药；芽孢杆菌还能在农药降解、污染净化等环保领域发挥重要作用。

在应用芽孢杆菌进行发酵生产时，都需要监控芽孢杆菌的生长代谢和菌体细胞累积情况，而基于芽孢杆菌特殊的生理特征，在生长后期、营养缺乏或者产物抑制等情况下芽孢杆菌发酵时伴随有大量芽孢体产生，某些发酵调控需要尽可能减少芽孢的生产，如酶制剂的扩大生产；而有些则需要创造条件促进芽孢积累，如芽孢类益生菌的制备。无论哪种情况均需要对发酵基质中的芽孢和营养体分别进行定量测定，通常其测定方法也均是参照普通细菌总数的测定方式，即传统的平板计数法，培养周期长，人为误差较大，干扰因素比较多。对于芽孢杆菌而言，传统方法无法特异性将芽孢体和营养体区分开，实际操作时一般根据芽孢的耐热性通过加热处死营养体后再进行平板计数来定量测定芽孢，加热的过程本身亦会促进营养体向芽孢体的转变，因此，对芽孢杆菌的定量测定而言，常规的测定操作更繁琐，误差更大，不适合现场实时检测。

目前已有其他替代技术应用各种微生物快速检测，如PCR技术、ELISA法、基因芯片技术、生物传感法、免疫荧光技术以及基于菌体特定的荧光分子的生物荧光法(ATP、NADH)等。这些手段大大提高了检测速度，并具有一定的灵敏性，但这些方法缺乏通用性，需要昂贵的仪器及其配套试剂，或者操作过程相对复杂，推广应用难度较大。尤其对于芽孢杆菌而言，缺乏特异性的区分其营养体和芽孢体的检测方法和技术。

发明内容

本发明提供了一种从芽孢杆菌发酵液中快速定量检测芽孢体和营养体的方法，该方法能有效区分芽孢和营养体细胞，而且方法简单，灵敏度高，重现性好。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法，包括以下步骤：(1)将待测的芽孢杆菌发酵液离心、洗涤并重悬到缓冲液中，充分混匀后得到菌悬液；

(2)量取菌悬液，对菌悬液中的NADH进行提取，提取液采用浓度为1.5～2mol/L的KOH乙醇溶液，将提取液与菌悬液按照不小于3：1的体积比充分混合均匀，加热至80～90℃，在此温度下处理30～60分钟，处理完毕后离心取上清液，检测上清液中NADH的荧光强度，记录检测结果；

(3)再次量取步骤(1)中的菌悬液，将其放在含有外在萌发剂的培养基中进行培养，培养至菌悬液中的芽孢体充分萌发变成营养体，然后采用与步骤(2)中相同的方法对培养后的菌悬液中的NADH进行提取，并检测上清液中NADH的荧光强度，记录检测结果；

(4)取已知初始活菌浓度的营养体悬液，分别进行稀释，然后采用步骤(2)与步骤(2)中相同的NADH提取及荧光强度检测方法，作出活菌浓度与NADH荧光强度的关系曲线，并以此曲线作为标准曲线分别计算出步骤(2)和步骤(3)中荧光强度检测结果所对应的活菌浓度值，其中步骤(2)所对应的活菌浓度值即为营养体浓度值，将步骤(3)所对应的活菌浓度值减去步骤(2)所对应的活菌浓度值即为芽孢体浓度值。

所述的荧光强度检测中的检测参数为：扫描速度3000nm/min；EX狭缝10.0nm；EM狭缝20.0nm；光电倍增管电压400V；响应0.08s；激发波长为344nm，发射波长为456nm。

步骤(3)中所述外在萌发剂为含有L-Ala，L-Gln，L-Val等营养性萌发剂的液体培养基。

步骤(4)中标准曲线的具体绘制方法为：取OD_600nm为0.8的营养体悬液，采用平板稀释法进行平板活细胞计数，确定其初始的活菌浓度，以确定活菌浓度的营养体悬液为基础，分别进行2倍、10倍、20倍、100倍、200倍、1000倍梯度稀释，对稀释的菌悬液进行NADH提取和荧光检测，空白为Tris-HCl缓冲液，从而根据检测结果作出活菌浓度与NADH荧光强度的关系曲线。

本申请中，由于还原性辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)广泛稳定存在于活细胞中，其较强的自发荧光特性常被用作指示物来研究细胞的代谢变化；对于特定活细胞而言，NADH的胞内水平保持恒定，通过测定NADH水平的方法亦可用于反映活细胞的数量。对于芽孢杆菌而言，其孢子中是不存在NADH的，随着芽孢的萌发产生营养体，细胞内NADH含量随之上升，直到芽孢彻底萌发成营养体后达到稳定，因此，NADH稳定存在于芽孢的营养体细胞中，通过检测细胞内的NADH的水平实际上就实现了芽孢杆菌营养体总数水平的测定。因此在本申请中采取芽孢萌发激发的方法，在不改变活细胞浓度的前提下，用萌发剂促使芽孢萌发转变为营养体，通过检测细胞从芽孢体萌发生产营养体过程中NADH的变化量来换算成生产的营养体浓度，得到的浓度实际也就能间接反映样品中芽孢的浓度。与现有技术相比，本发明所提供的检测方法能有效区分芽孢和营养体细胞，方法简单，灵敏度高，重现性好，可适用于基于芽孢杆菌纯培养的发酵体系，尤其是以芽孢杆菌作为发酵剂生产微生态制剂，能实现发酵过程监控或者终端产品的快速测定。

附图说明

图1为1nM-1000nM范围内NADH浓度与相应荧光强度标准曲线图；

图2为芽孢杆菌营养体不同OD值与提取的NADH荧光强度关系曲线；

图3为芽孢杆菌营养体不同活菌浓度值与提取的NADH荧光强度关系曲线；

图4为培养时间对芽孢萌发生长的影响；

图5为芽孢在萌发生长初期受到L-Ala萌发激发后NADH在胞内积累的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

本申请中首先需要对菌悬液中的营养体细胞进行最大限度提取，经过实验确定了以下最佳提取方法和条件：用1.5mol/L～2mol/L KOH/乙醇(体积分数50％)的提取液按照3：1的比例与菌体的Tris-HCl菌悬液充分混合，在80℃的水浴锅处理细胞30min，6000r/min离心20min取上清液，将上清液立即进行NADH的荧光强度检测即可。

本申请中设定NADH的荧光强度最佳检测条件参数：扫描速度3000nm/min；EX狭缝10.0nm；EM狭缝20.0nm；光电倍增管电压400V；响应0.08s；激发波长为344nm，发射波长为456nm。并对此参数进行验证：准确称取NADH纯品0.071g，用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0；下同)定容至100mL。配制成1mM的NADH母液。用Tris-HCl缓冲液稀释母液使其浓度为1nM～1000nM之间。在设定的参数基础上，测定不同标准浓度NADH溶液对应的荧光强度，并做相应的NADH标准曲线，如图1所示，有图1可以看出曲线的线性良好，相关系数R²为0.999。

接着验证OD_600nm值与NADH荧光强度的线性关系：

在LB培养基的基础上添加2g/L谷氨酰胺和50g/L葡萄糖，谷氨酰胺和葡萄糖能最大限度减少芽孢的产生。将活化的芽孢杆菌接种到LB液体培养基中振荡好氧培养12h，取样涂片经显微镜显微观察确保菌悬液均为营养体后，将菌液4℃下经8000r/min离心5min处理，收集菌体，用Tris-HCl缓冲液洗涤两次后并悬浮在Tris-HCl缓冲液中制成营养体悬液。以高浓度的营养体Tris-HCl悬液为基础，分别用Tris-HCl做稀释剂进行稀释，获得OD_600nm值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8五个梯度的菌悬液，分别进行NADH的提取和荧光检测，空白为Tris-HCl缓冲液，做OD_600nm与NADH荧光强度的关系曲线，如图2所示，从图2中可以看出其线性良好，相关系数R²为0.9996。

最后对标准曲线进行绘制，取OD_600nm为0.8左右的营养体Tris-HCl悬液，采用普通的平板稀释法进行平板活细胞计数，确定其初始的活菌浓度(CFU/mL)，以确定活菌浓度初始菌悬液为基础，分别进行2倍、10倍、20倍、100倍、200倍、1000倍梯度稀释，对稀释的菌悬液进行NADH提取和荧光检测，空白为Tris-HCl缓冲液，作活菌浓度与NADH荧光强度的关系曲线，如图3所示，从图3中可以看出其线性良好，相关系数R²为0.9998。因此，本申请中可以根据营养体细胞的NADH浓度直接对照标准曲线来定量测定活细胞营养体浓度，检测限为10⁴CFU/mL。

实施例1

本实施例中首先将待测的芽孢杆菌发酵液采用Tris-HCl缓冲液进行稀释，并充分混匀后得到菌悬液。量取菌悬液，按照上述方法对菌悬液中的NADH进行提取并进行荧光检测，记录检测结果为AU₁。

接下来为确保芽孢在萌发处理过程中不至于显著生长从而影响到最终的结果测定，芽孢首先用100mM的L-Ala的Tris-HCl溶液预处理3h，待其芽孢彻底萌发后离心，用无菌水洗涤两次后将萌发后的芽孢悬液接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养，每0.5h取样一次，测定样品的OD_600nm，检测结果如图4所示。从图4中可以看出在萌发生长处理的1.5h内，菌悬液OD_600nm未显著变化，故以此时间作为实现芽孢最大限度萌发的处理时间，立即取菌悬液做NADH的提取和荧光检测，检测结果为AU₄；并同时采用L-Ala处理芽孢后的NADH的胞内累积(检测结果AU₂)及芽孢的LB培养基溶液(检测结果AU₃)作实验对照，结果如图5所示。从图5中可以看出仅L-Ala处理在1.5h内不能显著增加NADH水平，LB培养基溶液能够促使芽孢转变为营养体细胞并引起NADH的增加，但含有萌发剂L-Ala的LB培养基的增强作用更强，通过计算在1.5h内芽孢经萌发激发增加的NADH的含量正是溶液中从芽孢转变为营养体的细胞数量，即：ΔAU＝AU₄-AU₁；通过ΔAU的数值在标准曲线上计算对应的细胞浓度就能实现间接测定芽孢浓度。

与此同时，通过常规的芽孢测定的方法对本实施例中的结果予以验证，即采用芽孢杆菌的样品悬液置于80℃水浴高温处理15分钟，冷却后稀释、涂板、培养和计数，获得耐受高温处理的芽孢数。两种方法检测的结果如下：