水体中微囊藻毒素的检测方法

摘要

本发明涉及一种水体中微囊藻毒素的检测方法，所述检测方法为直接分析离子源-质谱法，包括以下步骤：(1)水样前处理制备待测样品；(2)将待测样品用直接电离源电离；(3)质谱检测已离子化的待测样品。该方法对水样只需要简单的过滤或者过滤加快速烘干的前处理，即可直接检测，提高了检测效率，能够满足实时、快速、原位的检测要求，解决了现有检测技术中样品前处理复杂，难以实时快速检测水体中微囊藻毒素的问题。本发明提供的检测方法可同时进行定性和相对定量分析，可以同时分析多种微囊藻毒素，为实际操作提供了便利性。

说明书

技术领域

本发明涉及分析技术领域，特别是涉及一种水体中微囊藻毒素的检测方法。

背景技术

近年来，随着经济的迅猛发展，水体富营养化程度加剧，有害蓝藻水华发生日趋频繁。蓝藻水华暴发不仅造成水质下降，而且微囊藻、鱼腥藻、颤藻等还向水体释放微囊藻毒素，危害水生生态系统的安全。

微囊藻毒素(Microcystin,MC)基本结构是由7个氨基酸组成的单环多肽，也称7肽单环肝毒素，相对分子量在1000左右。由于多肽可变位置上氨基酸种类的变化，导致了MC的多样性。迄今已发现90多种MCs异构体,毒性较强、产量较大的MC是MC-LR、MC-RR和MC-YR(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。MC具有肝脏毒性和肿瘤促进作用，它不仅对水生生物产生毒害作用，还可能通过饮用水和食物链的生物富集危害人类健康。

MC有数量众多的异构体和类似物，蓝藻水华爆发时，水体中往往包含了复杂的MC混合物，有时还会有其他种类的蓝藻毒素，监测水体中的MC比较困难。只有及时发现水体中MC的存在，才能对其进行针对性处理，降低人体健康风险。

目前，MC对水环境的影响和对人类及水生生物的毒害性已经越来越引起全世界的广泛关注，这带来了对其检测方法的强烈需求。近年来发展了多种基于生物化学或者基于复杂分析仪器的MC检测方法。现有测定藻毒素的生物化学分析方法虽然能在几小时内测定微囊藻毒素的总量，但不能识别微囊藻毒素的种类，且生物化学法易出现假阳性现象；现有测定微囊藻毒素的仪器分析方法，大多需要进行复杂的预处理，消耗大量有毒有机试剂，目标物分离时间较长，这致使样品测试的成本较高，对环境及实验操作者的身体健康造成严重威胁，不利于大量样品的快速检测，无法做到实时、快速、原位的检测要求。

国内外已有一些关于利用液相色谱-质谱法检测水体中微囊藻毒素的方法，这些报道与本发明的样品预处理方式、进样方式、电离方法、检测原理不同(Elisabeth J.Faassen,Miquel Lürling.Occurrence of the Microcystins MC-LW andMC-LF in Dutch Surface Waters and Their Contribution to Total Microcystin Toxicity.Marine drugs.11(2013)2643-2654.)。而且样品同样需要经过复杂的预处理。另外，国内外也有利用直接分析离子源质谱仪分析检测丙酮、药品、爆炸物的文献报道，这些报道与本发明的样品预处理方式、进样方式、离子源设置、检测目的、检测对象不同(Guangming Xu,Bo Chen,Guozhu Liu,Shouzhuo Yao.Rapidanalysis of acetone in human plasma by derivatizating on desorption electrosprayionization.Analyst.2010,135(9):2415-2419.)。

现有技术中未发现实时快速的微囊藻毒素质谱检测技术，因此发展一种实时、快速的微囊藻毒素质谱检测技术极其重要。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种水体中微囊藻毒素的检测方法，能够实现水体中微囊藻毒素的实时、快速检测。

为实现上述发明目的，具体技术方案如下：

一种水体中微囊藻毒素的检测方法，所述检测方法为直接分析离子源-质谱法，包括以下步骤：(1)水样前处理制备待测样品；(2)将待测样品用直接分析离子源电离；(3)质谱检测已离子化的待测样品。

在其中一些实施例中，所述直接分析离子源选自电喷雾解吸电离源、介质阻挡放电离子源、电喷雾萃取电离源中的一种。

在其中一个实施例中，所述直接分析离子源为电喷雾解吸电离源；步骤(1)所述水样前处理的方法为：取待测水样，用孔径为Φ40～Φ120mm的玻璃纤维滤膜进行真空抽滤，将滤液滴在样品台上加热至50～80℃干燥30～200秒，制得待测样品；步骤(2)的参数设置如下：电喷溶液管路与样品台的角度为30～80°，电喷溶液管路与样品的距离为1～3mm，质谱仪大气压接口与样品台的角度为10～60°，质谱仪大气压接口与样品的距离为1～5mm。

在其中一个实施例中，步骤(1)所述玻璃纤维滤膜的孔径为Φ50～Φ70，所述干燥的温度为50℃～60℃，所述干燥的时间为85～95秒；步骤(2)的参数设置如下：电喷溶液管路与样品台的角度为45～55°，电喷溶液管路与样品的距离为1mm，质谱仪大气压接口与样品台的角度为30～40°，质谱仪大气压接口与样品的距离为2.5～3.5mm。

在其中一个实施例中，所述直接分析离子源为电喷雾萃取电离源；步骤(1)所述水样前处理的方法为：取待测水样，用孔径为Φ40～Φ120mm的玻璃纤维滤膜进行真空抽滤，滤液即为待测样品；步骤(2)的参数设置如下：电喷溶液管路与进样管路之间的角度为20～150°，电喷溶液管路出口与进样管路出口之间的距离为1～20mm，进样管路和质谱仪大气压接口之间的角度为100～170°，电喷溶液管路(或进样管路)出口和质谱大气压接口处的距离为5～20mm，待测样品溶液的流量为1-40μL/min。

在其中一个实施例中，步骤(1)所述玻璃纤维滤膜的孔径为Φ50～Φ70；步骤(2)的参数设置如下：电喷溶液管路与进样管路的之间的角度为45～55°，电喷溶液管路出口与进样管路出口之间的距离为3～7mm，进样管路和质谱仪大气压接口之间的角度为150～160°，电喷溶液管路(或进样管路)出口和质谱仪大气压接口处的距离为8～12mm，待测样品溶液的流量为15～25μL/min。

在其中一个实施例中，步骤(2)所述电离用到的电喷溶液选自甲醇、水、乙腈、甲酸、乙酸中的一种或多种，电喷溶液的流量为1～50μL/min，电喷溶液被施加的电压为3～5kV。

在其中一个实施例中，步骤(2)所述电离用到的电喷溶液为体积比为80：19：1的甲醇、水和乙酸的混合液或体积比为1:1的乙腈和水的混合液，电喷溶液的流量为8～12μL/min，电喷溶液被施加的电压为3kV或5kV。

在其中一个实施例中，步骤(2)所述电离用到的雾化气为氮气、氦气或氙气，雾化气的线速度为200～350m/s。

在其中一个实施例中，步骤(2)所述电离用到的雾化气为氮气，雾化气的线速度为180～220m/s。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种直接分析离子源-质谱检测水体中微囊藻毒素的方法，通过直接分析电离源将水样中微囊藻毒素电离后，进入质谱仪进行定性和定量分析。现有技术通过液相色谱-串联质谱检测方法检测微囊藻毒素，需要对样品进行反复的萃取和富集，耗时耗力，检测效率低，该方法对水样的萃取和富集过程包含在了检测过程中，从而简化了预处理，只需要对水样进行简单的过滤或者过滤加快速烘干的前处理，即可直接检测，提高了检测效率，能够满足实时、快速、原位的检测要求，解决了现有检测技术中样品前处理复杂，难以实时快速检测水体中微囊藻毒素的问题。本发明提供的检测方法可同时进行定性和相对定量分析，可以同时分析多种微囊藻毒素，为实际操作提供了便利性。

附图说明

图1为直接分析离子源-质谱法检测水体中微囊藻毒素的流程示意图；

图2为电喷雾解析电离源示意图；

图3为实施例1的电喷雾解析电离源示意图；

图4为电喷雾萃取电离源示意图；

图5为实施例2的电喷雾萃取电离源示意图；

图6为实施例1中含微囊藻毒素MC-RR和MC-LR的水样的质谱图；

图7为实施例2中含微囊藻毒素MC-RR和MC-LR的水样的质谱图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1电喷雾解吸电离源-质谱法检测水体中的微囊藻毒素

一、实验仪器

按常规方法制备电喷雾解吸电离源，如图2和图3所示，主要部件包括：三维移动平台、电喷液管路、雾化器、样品台等，电离源的结构和原理参考美国普渡大学的研究成果：R.Graham Cooks,Zheng Ouyang,Zoltan Takats,Justin M.Wiseman.Ambient Mass Spectrometry.Science 311(2006):1566-1570。

二、实验方法

1、水样配制：称取MC-RR 500μg和MC-LR 250μg，混合后用500μL甲醇溶解，再用纯水定容至500ml，作为标准储备溶液，此标准储备溶液中MC-RR、MC-LR的溶度分别为1μg/mL、0.5μg/mL。用环境水样(按照GB/T 20466-2006检测，未检出微囊藻毒素)将微囊藻毒素标准储备溶液稀释至MC-RR、MC-LR的溶度分别为10μg/L、5μg/L，作为待测溶液，储存于冰箱中待测。

2、水样前处理：取一定量水样，用玻璃纤维滤膜(Φ60)在150mbar的条件下真空抽滤，滤液滴在样品台上加热干燥90s(50℃)，制得待测样品。

3、电离和检测：

(1)仪器调试：调整电喷溶液管路与样品台的角度为50°，电喷溶液管路与样品的距离为1mm，质谱仪大气压接口与样品台的角度为35°，质谱仪大气压接口与样品的距离为3mm，电喷溶液的流量为10μL/min，雾化气线速度为200m/s。

(2)进样和检测：所用的电喷溶液(甲醇:水:乙酸的体积比为80：19：1)先被加以3kv的电压，并从雾化器的内套管中喷出,雾化器外套管喷出的高速氮气迅速将溶剂雾化并使其加速，令带电的液滴撞击到待测样品表面。待测样品被高速液滴撞击后发生溅射进入气相，同时由于氮气的吹扫和干燥作用，含有待测样品的带电液滴发生去溶剂化，进入毛细管大气压接口，然后被质谱仪的检测器检测。

三、实验结果

本实施例用含微囊藻毒素MC-RR(10μg/L)和MC-LR(5μg/L)的水样作为样品，得到m/z＝519.79(MC-RR,[M+2H]²⁺)和m/z＝498.282(MC-LR,[M+2H]²⁺)的质谱特征峰，MC-RR的特征峰面积为MC-LR的2倍，如图6所示。试验结果表明：1对样品进行简单预处理后，可以直接检测水体中的微囊藻毒素；2根据质荷比，可以判定微囊藻毒素的种类；3根据微囊藻毒素的特征峰面积，可以对其进行定量分析；4检测结果中微囊藻毒素的质荷比数值可以精确到小数点后两位，从而可以根据质荷比将微囊藻毒素特征峰和杂质峰分开。

实施例2电喷雾萃取电离源-质谱法检测水体中的微囊藻毒素

一、实验仪器

按常规方法制备电喷雾萃取电离源，如图4和图5所示，主要部件包括：三维移动平台、电喷液管路、雾化器、进样管路等，离子源的结构和原理参考Chen等的设计：Chen,H.W.；Venter,A.；Cooks,R.G.,Extractive electrosprayionization for direct analysis of undiluted urine,milk and other complex mixtureswithout sample preparation.Chem.Commun.19(2006):2042-2044.

二、实验方法

1、水样配制：称取MC-RR 750μg和MC-LR 250μg，混合后用500μL甲醇溶解，再用纯水定容至500ml，作为标准储备溶液，此标准储备溶液中MC-RR、MC-LR的溶度分别为1.5μg/mL、0.5μg/mL。用环境水样(按照GB/T 20466-2006检测，未检出微囊藻毒素)将微囊藻毒素标准储备溶液稀释至MC-RR、MC-LR的溶度分别为15μg/L、5μg/L，作为待测溶液，储存于冰箱中待测。其他浓度比例的微囊藻毒素水样也按照上述方法配置。

2、水样前处理：取一定量水样，用玻璃纤维滤膜(Φ60)在150mbar的条件下真空抽滤，制得待测样品溶液。

3、电离和检测：

(1)仪器调试：调整电喷溶液管路出口与进样管路之间的角度为50°，电喷溶液管路出口与进样管路出口之间的距离为5mm，进样管路和质谱仪大气压接口之间的角度为155°，电喷溶液管路(或进样管路)出口和质谱仪大气压接口处的距离为10mm。电喷溶液的流量为10μL/min，待测样品溶液流量为20μL/min，雾化气的线速度为200m/s。

(2)进样和检测：所用的电喷溶液(乙腈:水的体积比为1:1)先被加以5kv的电压，并从雾化器的内套管中喷出,雾化器外套管喷出的高速氮气迅速将溶剂雾化并使其加速；待测样品溶液在进样管路中同样被高速氮气雾化；电喷溶液和待测样品溶液的雾滴同时进入质谱仪大气压接口前的三维空间里，电喷溶液对样品进行微萃取和离子化，然后进入质谱仪大气压接口，被质谱仪的检测器检测。

三、实验结果

本实施例用含微囊藻毒素MC-RR(15μg/L)和MC-LR(5μg/L)的水样作为样品，得到m/z＝519.79(MC-RR,[M+2H]²⁺)和m/z＝498.282(MC-LR,[M+2H]²⁺)的质谱特征峰，MC-RR的特征峰面积为MC-LR的3倍，如图7所示。试验结果表明：1对样品进行简单预处理后，可以直接检测水体中的微囊藻毒素；2根据质荷比，可以判定微囊藻毒素的种类；3根据微囊藻毒素的特征峰面积，可以对其进行定量分析；4检测结果中微囊藻毒素的质荷比数值可以精确到小数点后两位，从而可以根据质荷比将微囊藻毒素特征峰和杂质峰分开。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。