一种珙桐高效诱导丛生芽的组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种珙桐高效诱导丛生芽的组培快繁方法，具体步骤为：1）选择生长健壮、无病虫害、性状优良、侧芽形成且未展叶时的珙桐枝条为母株，加入GA3溶液中进行浸泡，至珙桐侧芽生长到3cm以上；2）剪取侧芽，进行消毒，然后接种于Wpm+KT1.2mg·L

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组培繁殖技术，具体为一种珙桐高效诱导丛生芽的组培快繁方法。

背景技术

珙桐为落叶乔木。可生长到15～25米高，叶子广卵形，边缘有锯齿。色花奇美，是1000万年前新生代第三纪留下的孑遗植物，在第四纪冰川时期，大部分地区的珙桐相继灭绝，只有在中国南方的一些地区幸存下来，成为了植物界今天的“活化石”，被誉为“中国的鸽子树”，又称“鸽子花树”、“水梨子”，野生种只生长在中国四川省和湖北省周边地区。珙桐已被列为国家一级重点保护野生植物，为中国特有的单属植物，属孑遗植物，也是全世界著名的观赏植物。

目前，珙桐的繁殖技术主要以播种育苗为主，但此方式存在以下不足：成苗周期长，出苗时间为3-10年；出苗率低、不整齐、易变异，对保存母株的优良性状有一定影响；同时需大量人力、物力及土地资源，生产成本高；综上所述，寻找出苗快捷，生产成本低的珙桐组培快繁方式，推动产业化生产具有必要性。

西南师范大学邹丽娟在《植物研究》发表的《濒危植物珙桐的组织培养与植株再生》公开了一种采用珙桐侧芽直接诱导丛生芽的快繁方法，但此方法存在外植体采集时间受限、诱导时间长的缺点，并且其增值率和增殖倍数都有一定的提升空间；四川农业大学夏晗发表的《珙桐初代培养研究》和湖北民族大学罗世荣发表的《珙桐芽体组织培养研究》中都提到以珙桐侧芽为外植体进行芽诱导，但是都仅仅只能促使单芽萌发，不能诱导丛生芽。

发明内容

本发明的目的提供一种珙桐高效诱导丛生芽的组培快繁方法，其操作简便，诱导速度快，增殖系数高。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种珙桐高效诱导丛生芽的组培快繁方法，包括以下步骤：

1)选择生长健壮、无病虫害、性状优良、侧芽形成且未展叶时的珙桐枝条为母株，加入GA3溶液中进行浸泡，至珙桐侧芽生长到3cm以上；

2)剪取侧芽，进行消毒，然后接种于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+琼脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培养基内；培养18-22d后芽点萌发生长，形成丛生芽。

对珙桐枝条进行采集及处理的时间为当年的9月至次年的3月。

优选的，对珙桐枝条进行采集及处理的时间为3月份。此时为侧芽即将自然萌动时，萌发率，芽长生长快。

步骤1)中珙桐枝条是截取当年生从上往下至第5个侧芽的枝条。

步骤1)中浸泡时采用100mg/L的GA3溶液，每5天换一次溶液。

步骤2)中剪取的侧芽含有1-2mm木质部。

步骤2)中消毒时，先流水冲洗1h，采用质量浓度0.4％洗衣粉浸泡4-6min，然后采用体积浓度75％酒精浸泡20s，无菌水冲洗2次，再用质量浓度0.1％Hgcl₂浸泡3-5min，最后无菌水冲洗4次即可。

培养的环境为温度25±1℃、湿度75±2％、光照12-14h/d、光强1800-2200lx。

步骤1)中的浸泡过程在室外进行处理，GA3溶液高度4-6cm；浸泡部位为枝条基部。

所述的Wpm为木本植物培养基，其中大量元素10倍为：Ca(NO3)·4H2O 5.56g/L、NH4NO3 3.50g/L、K2SO3 9.9g/L、MgSO4·7H2O 3.20g/L、KH2PO4 1.70g/L、CaCl20.725g/L；微量元素100倍为：MnSO4·4H2O 2.23g/L、ZnSO4·7H20 0.86g/L、H3BO3 0.62g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、Na2MoO4·2H2O 0.025g/L；铁盐100倍为：FeSO4·7H2O 2.78g/L、Na2-EDTA 3.72g/L；有机100倍为：盐酸硫胺素VB1 0.1g/L、盐酸吡哆醇VB6 0.05g/L、烟酸VB5 0.05g/L、甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L。

由于珙桐侧芽存在长短枝现象，导致室内培养时芽不伸长，不分化，浪费人力物力，也影响研究结果。本发明采取室外激素预处理方法，通过GA3进行浸泡预处理，能简单有效甄别长短枝芽问题，还能一定程度上促进短枝芽萌发伸长，对珙桐侧芽萌发有明显促进作用，对芽伸长也有明显的促进作用。

现行珙桐侧芽诱导时都是采取剥芽后再诱导萌发伸长，而GA3溶液预处理，可减少实验室剥芽环节，直接进行丛生芽诱导工序，从而减少了实验过程中人力和物力的消耗，提高了工作效率，节约了生产成本。

接种培养时采用的培养基能直接让侧芽诱导丛生芽，诱导时间缩短至20天，平均增值倍率为5.2。此培养基中是以KT为主要影响因素，同时降低琼脂、蔗糖含量至3.5g、20g，并添加少量AC，能明显促进珙桐侧芽诱导丛生芽。

由于采用GA3预处理，打破休眠，促进生长；经过多次试验表明，KT对珙桐生长分化具有较强的促进作用；降低琼脂、蔗糖浓度能加强培养基内养分流动，促进其生长分化；实现直接诱导。采用本发明提供的珙桐丛生芽诱导技术，方法简便，诱导周期短，繁殖系数高，对此国家一级珍稀濒危植物保护具有一定的促进作用。

附图说明

图1为实施例2中珙桐带侧芽枝条室外激素浸泡处理的照片。

图2为实施例2中处理后侧芽接种7d时生长情况。

图3为实施例2中处理后侧芽接种15d时生长情况。

图4为实施例2中处理后侧芽接种30d时生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。

实施例1：

1)选择生长健壮、无病虫害、性状优良、侧芽形成且未展叶时的珙桐枝条为母株，加入GA3溶液中进行浸泡，至珙桐侧芽生长到3cm以上；

2)剪取侧芽，进行消毒，然后接种于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+琼脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培养基内；培养18-22d后芽点萌发生长，形成丛生芽。

实施例2：

1)选择生长健壮、无病虫害、性状优良、侧芽形成且未展叶时的珙桐枝条为母株，加入100mg/L的GA3溶液中进行浸泡，每5天更换浸泡溶液，至珙桐侧芽生长到3cm以上；如图1所示；

2)剪取侧芽，剪取时基部带1-2mm木质部，进行消毒，具体是先流水冲洗1h，0.4％洗衣粉浸泡4-6min，后在操作台进行75％酒精浸泡20s，无菌水冲洗2次，0.1％Hgcl₂浸泡3-5min，无菌水冲洗4次，完成消毒工序；然后接种于Wpm+KT1.2mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+6-BA0.5mg·L^-1+琼脂3.5g·L^-1+蔗糖20g·L^-1+AC0.2g·L^-1的培养基内；培养环境为温度25±1℃、湿度75±2％、光照12-14h/d、光强1800-2200lx的恒定温湿度的培养室内；培养5-7d后侧芽基部开始膨胀，侧芽继续伸长，培养10-14d后侧芽基部产生3-7个芽点，18-22d后芽点芽点萌发生长，形成丛生芽，丛生芽诱导率达92％，平均增值倍数为5.2，如图2-4所示。

所述的Wpm为木本植物培养基，其中大量元素10倍为：Ca(NO3)·4H2O 5.56g/L、NH4NO3 3.50g/L、K2SO3 9.9g/L、MgSO4·7H2O 3.20g/L、KH2PO4 1.70g/L、CaCl20.725g/L；微量元素100倍为：MnSO4·4H2O 2.23g/L、ZnSO4·7H20 0.86g/L、H3BO3 0.62g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、Na2MoO4·2H2O 0.025g/L；铁盐100倍为：FeSO4·7H2O 2.78g/L、Na2-EDTA 3.72g/L；有机100倍为：盐酸硫胺素VB1 0.1g/L、盐酸吡哆醇VB6 0.05g/L、烟酸VB5 0.05g/L、甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L。

GA3溶液浓度的优化：

选择生长健壮、无病虫害等性状优良的珙桐为母株，当侧芽形成且未展叶时截取当年生从上往下至第5个侧芽的枝条为实验材料，每10个枝条为一捆用橡皮筋箍紧，用清水、10mg/LGA3、100mg/L GA3、500mg/L GA3四种处理进行浸泡，5d换一次溶液，10d后进行统计萌发生长情况见表1。

表1

由表一可得GA3对珙桐侧芽萌发有明显促进作用，对芽伸长也有明显的促进作用，最佳处理为100mg/LGA3溶液处理。

对珙桐诱导丛生芽的组培快繁技术的操作时间的优化：

侧芽形成、膨大到展叶的时间周期为当年9月至次年3月，为了找出最佳采集时间，在9、10、11、12、1、2、3月的10号分别按上述方法采集珙桐带侧芽枝条，用100mg/LGA3溶液浸泡处理，5d换一次溶液，10d后对侧芽萌发生长情况进行统计见表2。

表2

由表2可知在侧芽形成到展叶的7个月中使用GA3室外处理都能有效促使侧芽萌发及伸长，其中最佳采集和处理时间为3月侧芽即将自然萌动时，萌发率达100％，平均芽长为3.9cm。

上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。